CN110183536B

CN110183536B - 一种复合支架材料及其应用

Info

Publication number: CN110183536B
Application number: CN201810153811.3A
Authority: CN
Inventors: 戴建武; 陈曦; 李星; 肖志峰; 赵燕南; 陈冰; 侯祥林; 胡慧霞
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2018-02-22
Filing date: 2018-02-22
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2038-02-22
Also published as: CN110183536A

Abstract

本发明公开了一种复合支架材料及其应用。本发明首先保护一种蛋白质(CBD‑NT3蛋白)，为序列表的序列1所示的蛋白质。本发明还保护CBD‑NT3蛋白在制备产品中的应用；所述产品的功能为：促进神经元延伸；促进神经元形成；促进神经元存活；促进神经元分化；促进神经突出形成；促进神经干细胞增殖；促进神经干细胞分化；修复脊髓损伤；促进脊髓损伤的神经再生；促进脊髓损伤后的恢复。本发明还保护负载CBD‑NT3蛋白的支架。负载CBD‑NT3蛋白的支架是将CBD‑NT3蛋白负载于复合支架得到的；所述复合支架是将凝胶状胶原材料负载于聚合物支架得到的。本发明对于脊髓损伤修复具有重大的应用价值。

Description

一种复合支架材料及其应用

技术领域

本发明涉及一种复合支架材料及其应用。

背景技术

随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会对整个社会造成巨大的经济负担。由于脊髓损伤所导致的社会经济损失，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种复合支架材料及其应用。

本发明首先保护一种蛋白质(CBD-NT3蛋白)，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)或(a5)：

(a1)包括如下两个元件的蛋白质：胶原结合肽、人源神经营养因子；

(a2)自上游至下游依次包括如下两个元件的蛋白质：胶原结合肽、人源神经营养因子；

(a3)包括如下三个元件的蛋白质：His₆标签、胶原结合肽、人源神经营养因子；

(a4)自上游至下游依次包括如下三个元件的蛋白质：His₆标签、胶原结合肽、人源神经营养因子；

(a5)序列表的序列1所示的蛋白质。

所述胶原结合肽具体可为序列表的序列1第22-28位氨基酸残基所示。

所述人源神经营养因子具体可为序列表的序列1第42-160位氨基酸残基所示。

编码CBD-NT3蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

编码CBD-NT3蛋白的基因具体可为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)或(b5)：

(b1)编码区如序列表的序列2第64-480位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)编码区如序列表的序列2第13-480位核苷酸所示的DNA分子；

(b3)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子；

(b4)在严格条件下与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA分子杂交且编码所述CBD-NT3蛋白的DNA分子；

(b5)与(b1)或(b2)或(b3)具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述CBD-NT3蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明还保护CBD-NT3蛋白在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下(c1)至(c10)中的至少一种：

(c1)促进神经元延伸；

(c2)促进神经元形成；

(c3)促进神经元存活；

(c4)促进神经元分化；

(c5)促进神经突出形成；

(c6)促进神经干细胞增殖；

(c7)促进神经干细胞分化；

(c8)修复脊髓损伤；

(c9)促进脊髓损伤的神经再生；

(c10)促进脊髓损伤后的恢复。

本发明还保护一种胶原材料，其制备方法包括如下步骤：

(1)取牛的真皮组织，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(5)取步骤(4)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液；

(6)将完成步骤(5)的整个体系转移到透析袋中，先在醋酸溶液中进行透析，然后在水中进行透析；

(7)完成步骤(6)后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。

所述方法还包括如下步骤(8)：取步骤(7)得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料。

所述步骤(1)中，获得牛的真皮组织的方法如下：取新鲜剥取的牛的皮肤组织，去除表皮和皮下组织，得到真皮组织。所述步骤(1)中，所述水为去离子水。

所述步骤(2)中，所述表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。所述步骤(2)中，表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为1-5g/100ml，具体可为3g/100ml。所述步骤(2)中，表面活性剂为SDS、TritonX-100或脱氧胆酸钠等。所述步骤(2)中，表面活性剂溶液具体可为3g/100ml SDS水溶液。所述步骤(2)中，浸泡的温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。所述步骤(2)中，浸泡的时间可为1小时-5小时，具体可为3小时。

所述步骤(3)中，所述水为去离子水。所述步骤(3)中，浸泡温度可为2℃-16℃，具体可为4℃。所述步骤(3)中，浸泡并清洗可为“每15分钟-25分钟换水，共换水15次-25次”，具体可为“每20分钟换水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤”。

所述步骤(4)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

所述步骤(5)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。所述步骤(5)中，醋酸溶液为3％-10％(质量百分含量)醋酸溶液，具体可为6％(质量百分含量)醋酸溶液。所述步骤(5)中，干燥组织与醋酸溶液的配比为“0.3-3g：100ml-500ml”，具体配比可为“0.3-3g：150ml”或“2g：100ml-500ml”，具体配比可为“2g：150ml”。所述步骤(5)中，醋酸溶液为预冷的醋酸溶液。所述预冷的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。所述步骤(5)中，溶于醋酸溶液的实现方式可为“2℃-16℃搅拌36小时-60小时”，具体可为“4℃搅拌48小时”。

所述步骤(6)中，所述透析袋的截留分子量为10kDa-100kDa，具体可为30kDa。所述步骤(6)中，所述醋酸溶液为醋酸水溶液。所述步骤(6)中，醋酸溶液为0.05％-0.2％(质量百分含量)醋酸溶液，具体可为0.1％(质量百分含量)醋酸溶液。所述步骤(6)中，在醋酸溶液中的透析时间为20-30小时，具体可为24小时。所述步骤(6)中，在醋酸溶液中透析时，每3-5小时换液一次，具体可每4小时换液一次。所述步骤(6)中，所述水为去离子水。所述步骤(6)中，在水中的透析时间为12-18天，具体可为15天。所述步骤(6)中，在水中透析时，每天换液4-6次，具体可每天换液5次。所述步骤(6)中，透析的温度为2℃-16℃，具体可为4℃。

所述步骤(7)中，所述冷冻干燥的时间可为24小时-72小时，具体可为48小时。

所述步骤(8)中，溶剂可为生理盐水或磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液可为pH7-8的磷酸盐缓冲液，具体可为pH7.4的PBS缓冲液。所述步骤(8)中，干粉状胶原材料与溶剂的配比可为“1-4g：100ml”，具体可为“3g：100ml”。

本发明还保护一种胶原材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)取牛的真皮组织，用水清洗；

(2)取完成步骤(1)的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

(3)取完成步骤(2)的组织，置于水中浸泡并清洗；

(4)取完成步骤(3)的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

(5)取步骤(4)得到的干燥组织，溶于醋酸溶液；

本发明还保护负载CBD-NT3蛋白的胶原材料。负载CBD-NT3蛋白的胶原材料是将CBD-NT3蛋白负载于凝胶状胶原材料得到的。所述凝胶状胶原材料具体为以上任一所述凝胶状胶原材料。

本发明还保护负载CBD-NT3蛋白的支架(复合功能支架)。负载CBD-NT3蛋白的支架是将CBD-NT3蛋白负载于复合支架得到的；所述复合支架是将凝胶状胶原材料负载于聚合物支架得到的。所述聚合物支架，由聚富马酸丙二醇酯和富马酸二乙酯组成，其中聚富马酸丙二醇酯的质量百分含量为60％-80％。所述聚合物支架中，聚富马酸丙二醇酯的质量百分含量具体可为70％。所述聚合物支架为多孔结构。所述聚合物支架为具有多个贯穿孔的多孔结构。贯穿孔的孔径可为700-900μm，具体可为800μm。所述聚合物支架具体可为圆柱状，沿圆柱轴向均匀分布若干贯穿孔。贯穿孔的密度为每15-25平方毫米具有24个贯穿孔。所述聚合物支架具体可为直径为5毫米的圆柱状。所述聚合物支架具体可为直径为5毫米、高度为0.5-5毫米的圆柱状。所述聚合物支架具体可为直径为5毫米、高度为0.8-1.2毫米的圆柱状。所述复合支架的制备方法包括如下步骤：用凝胶状胶原材料浸没聚合物支架，然后冷冻干燥，得到复合支架。所述复合功能支架的制备方法包括如下步骤：将CBD-NT3蛋白溶液滴加至复合支架上，得到复合功能支架。聚合物支架与CBD-NT3蛋白的配比可为“每单位体积聚合物支架：1-20μg CBD-NT3蛋白”，具体可为“每单位体积聚合物支架：5μg CBD-NT3蛋白”。每单位体积可为“直径为5毫米、高度为0.8-1.2毫米的圆柱的体积”。所述凝胶状胶原材料具体为以上任一所述凝胶状胶原材料。

本发明还保护负载CBD-NT3蛋白的胶原材料在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下(c1)至(c10)中的至少一种：

(c1)促进神经元延伸；

(c2)促进神经元形成；

(c3)促进神经元存活；

(c4)促进神经元分化；

(c5)促进神经突出形成；

(c6)促进神经干细胞增殖；

(c7)促进神经干细胞分化；

(c8)修复脊髓损伤；

(c9)促进脊髓损伤的神经再生；

(c10)促进脊髓损伤后的恢复。

本发明还保护负载CBD-NT3蛋白的支架在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下(c1)至(c10)中的至少一种：

(c1)促进神经元延伸；

(c2)促进神经元形成；

(c3)促进神经元存活；

(c4)促进神经元分化；

(c5)促进神经突出形成；

(c6)促进神经干细胞增殖；

(c7)促进神经干细胞分化；

(c8)修复脊髓损伤；

(c9)促进脊髓损伤的神经再生；

(c10)促进脊髓损伤后的恢复。

本发明还保护一种支架(聚合物支架)，由聚富马酸丙二醇酯和富马酸二乙酯组成，其中聚富马酸丙二醇酯的质量百分含量为60％-80％。所述支架中，聚富马酸丙二醇酯的质量百分含量具体可为70％。所述支架为多孔结构。所述支架为具有多个贯穿孔的多孔结构。贯穿孔的孔径可为700-900μm，具体可为800μm。所述支架具体可为圆柱状，沿圆柱轴向均匀分布若干贯穿孔。贯穿孔的密度为每15-25平方毫米具有24个贯穿孔。所述支架具体可为直径为5毫米的圆柱状。所述支架具体可为直径为5毫米、高度为0.5-5毫米的圆柱状。所述支架具体可为直径为5毫米、高度为0.8-1.2毫米的圆柱状。

本发明还保护一种支架(聚合物支架)的制备方法，依次包括如下步骤：

①将60-80质量份富马酸丙二醇酯和40-20质量份富马酸二乙酯在溶剂中混匀，然后使溶剂完全蒸发；

②采用激光束进行穿孔。

步骤①中，富马酸丙二醇酯和富马酸二乙酯的质量配比可为70:30。

步骤①中，的溶剂可为有机溶剂，具体可为100％乙醇。

步骤②中，激光束具体可为308nm的氯化氙激光束。

在步骤①和步骤②之间，还包括进行外型加工的步骤。

在步骤②之后，还包括进行外型加工的步骤。

所述富马酸丙二醇酯的制备方法包括如下步骤：富马酸和丙二醇进行反应，得到富马酸丙二醇酯。

所述富马酸丙二醇酯的制备方法具体包括如下步骤：

(Ⅰ)将2.4mol富马酸放入3mol丙二醇中，先145℃反应17小时，再185℃反应5小时，然后冷却至室温；

(Ⅱ)完成步骤(Ⅰ)后，将整个体系加至200ml二氯甲烷中并进行旋转蒸发，残留物即为聚富马酸丙二醇酯。

脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种严重的神经系统创伤，致残性高，极具破坏力，尚无十分有效的治疗方法。本发明中的聚合物支架具有很好的力学强度，可以提供稳定的结构支撑和空间上的填补。本发明中的复合支架，胶原蛋白能紧密填充并贴附在聚合物支架材料内部。胶原蛋白具有低抗原性、良好的生物相容性和生物降解性，在组织损伤的修复过程中能为细胞提供依附，引导细胞生长。本发明提供的复合功能支架上负载有CBD-NT3蛋白。胶原结合肽区段负责与胶原蛋白结合，人源神经营养因子区段具有给受损神经提供营养、促进神经干细胞增殖和分化的作用，可以提高皮质脊髓束的生存以及神经纤维的出芽(最终促进运动功能的恢复)，也可以促进神经元的存活、生长、分化，刺激神经突出的形成。CBD-NT3蛋白与胶原蛋白具有强结合能力，可以实现CBD-NT3蛋白的缓释。将复合功能支架移植到脊髓损伤处，可以对神经组织提供营养和保护发，减少损伤的区域，引导神经组织连接，并且促进新生及成熟神经元的产生和存活，以及促进轴突的再生，最终促进电生理及运动功能的恢复。

本发明对于脊髓损伤修复具有重大的应用价值。

附图说明

图1为聚合物支架的照片。

图2为聚合物支架在光镜和电镜下的照片。

图3为复合支架的照片。

图4为复合支架在光镜下的照片。

图5为小脑颗粒神经元在显微镜下的照片。

图6为神经元的平均神经突长度。

图7为行为学测试的结果。

图8为电生理检测的结果。

图9为大体标本观察的结果。

图10为Tuj-1的结果(免疫荧光染色)。

图11为每视野Tuj-1阳性细胞的数量。

图12为Map2的结果(免疫荧光染色)。

图13为每视野Map2阳性细胞的数量。

图14为NF的结果(免疫荧光染色)。

图15为每视野NF阳性细胞的数量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所有数据采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，进行单因素方差分析或两独立样本t检验，以p<0.05为差异具有显著统计学意义，p<0.01为差异具有极显著统计学意义，p>0.05为差异无统计学意义。所有数据均采用“均数±标准差”的方式记录。实施例中，冷冻干燥均采用0.1Mpa真空度。SDS全称为十二烷基硫酸钠。如无特殊说明，实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4的PBS缓冲液。

载体pET-28a(+)：EMD Biosciences(Novagen)，产品目录号为69864-3。

大肠杆菌BL21(DE3)：天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号为CD601。

SD大鼠：维通利华SD大鼠，品系代码101。

实施例1、聚合物支架和复合支架的制备

一、聚合物支架的制备

1、将2.4mol富马酸(物质形态：粉末)放入3mol丙二醇(物质形态：液态)中，先145℃反应17小时，再185℃反应5小时，然后冷却至室温。

2、完成步骤1后，将整个体系加至200ml二氯甲烷中并进行旋转蒸发，残留物即为聚富马酸丙二醇酯。

3、将100％乙醇作为反应体系，加入步骤2得到的聚富马酸丙二醇酯和富马酸二乙酯(聚富马酸丙二醇酯和富马酸二乙酯的质量配比为70:30)，然后室温持续搅拌至乙醇完全蒸发(通常3天左右实现)，获得残留物。

4、取步骤3得到的残留物，进行外型加工，得到直径为5毫米、高度为5毫米的圆柱状支架前体。

5、取步骤4得到的支架前体，采用308nm的氯化氙激光束进行穿孔，得到聚合物支架。聚合物支架为圆柱形(直径为5毫米、高度为5毫米)，沿圆柱轴向均匀分布24个贯穿孔，孔径为800.0±2.0μm。

聚合物支架放入75％乙醇水溶液中保存。

聚合物支架的照片见图1A和图1B。将聚合物支架切成厚度为1毫米的圆片，照片见图1C。

聚合物支架放入无菌皿中，并放入光镜下进行观察，可见均匀分布的贯穿孔，见图2(左)。取聚合物支架，喷洒金粉，于扫描电镜下进行观察，见图2(右)，贯穿孔表面光滑。

二、胶原材料的制备

1、取新鲜剥取的牛的皮肤组织，去除表皮和皮下组织，得到真皮组织，用去离子水充分洗涤。

2、取步骤1得到的真皮组织，置于表面活性剂溶液中浸泡。

本实施例中，采用的表面活性剂溶液为3g/100ml SDS水溶液，4℃浸泡3小时。

实际应用中，所述表面活性剂溶液为表面活性剂水溶液。

实际应用中，所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度为1-5g/100ml。

实际应用中，所述表面活性剂可为SDS、TritonX-100、脱氧胆酸钠等。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，浸泡时间为1小时-5小时均可。

3、取完成步骤2的组织，置于去离子水中4℃浸泡(每20分钟更换去离子水，共换水19次，最后一次换水20分钟后完成本步骤)。

实际应用中，2℃-16℃均可。

实际应用中，可每15分钟-25分钟更换去离子水，共换水15次-25次。

4、取完成步骤3的组织，进行48小时的冷冻干燥，得到干燥组织。

实际应用中，冷冻干燥24小时-72小时均可。

5、称取2g步骤4得到的干燥组织，溶于150ml 4℃预冷的6％(质量百分含量)醋酸水溶液中，4℃搅拌48小时。

实际应用中，可采用取0.3-3g步骤4得到的干燥组织。

实际应用中，可采用100ml-500ml醋酸水溶液。

实际应用中，可采用3％-10％(质量百分含量)醋酸水溶液。

实际应用中，2℃-16℃预冷均可。

实际应用中，2℃-16℃搅拌36小时-60小时均可。

5、完整步骤4后，将整个体系转移到透析袋(透析袋截留分子量为30kDa)中，先在0.1％(质量百分含量)醋酸水溶液中透析24小时(每4小时换液一次)，然后在去离子水中透析15天(每天换液5次)，透析温度为4℃。

实际应用中，可采用截留分子量为10kDa-100kDa的透析袋。

实际应用中，可采用0.05％-0.2％(质量百分含量)醋酸水溶液。

实际应用中，在醋酸水溶液中的透析时间为20-30小时(每3-5小时换液一次)。

实际应用中，在去离子水中的透析时间为12-18天(每天换液4-6次)。

实际应用中，透析温度为2℃-16℃均可。

6、完成步骤5后，收集透析袋内的整个体系，进行48小时的冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料。

实际应用中，冷冻干燥24-72小时均可。

7、取3g步骤6得到的干粉，用100ml生理盐水溶解，得到凝胶状胶原材料。

实际应用中，也可采用磷酸盐缓冲液代替生理盐水作为溶剂。

实际应用中，干粉和溶剂的配比为可：1-4g：100ml。

三、复合支架的制备

1、取步骤一制备的聚合物支架，置于75％(体积百分含量)乙醇水溶液中浸泡24小时。

2、完成步骤1后，取聚合物支架，用无菌水充分洗涤。

3、完成步骤2后，将聚合物支架进行切割，得到厚度为0.8-1.2毫米的圆片状支架。

4、取步骤3得到的圆片状支架，在室温无菌的环境中自然干燥，然后将其置于96孔板的孔中，然后从其上方均匀、缓慢地注入步骤二制备的凝胶状胶原材料直至完全淹没圆片状支架，密封好96孔板，4℃、5000rpm离心10分钟，然后冷冻干燥，得到复合支架，将复合支架转移到无菌管中保存备用。

复合支架的照片见图3。可见凝胶状胶原材料很好地填充在圆片状支架支架的内部及侧面。

取复合支架，喷洒金粉，于扫描电镜下进行观察，见图4。复合支架表面较光滑，而凝胶状胶原材料能紧密地填充在圆片状支架的多孔通道中，并很好地贴附在孔隙壁上，形成完整的复合材料。

实施例2、CBD-NT3蛋白和复合功能支架的制备

一、CBD-NT3蛋白的制备

1、将序列表的序列2所示的DNA分子插入载体pET-28a(+)的NcoI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。

序列表的序列2所示的DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。将序列表的序列1所示的蛋白质命名为CBD-NT3蛋白。

序列表的序列1中，第5-10位氨基酸残基组成His₆标签，第22-28位氨基酸残基组成胶原结合肽,第42-160位氨基酸残基组成人源神经营养因子。

将序列表的序列2所示的DNA分子命名为CBD-NT3基因。序列表的序列2中，第13-30位核苷酸编码His₆标签，第64-84位核苷酸编码胶原结合肽，第124-480位核苷酸编码人源神经营养因子。

2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

3、将重组菌接种至液体LB培养基，37℃、180rpm振荡培养至OD_600nm＝0.6(实际操作中，0.6-0.8均可)。

4、完成步骤3后，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷并使其在体系中的浓度为1μM，然后37℃、200rpm振荡培养5小时，然后4℃、8000g离心10min，收集菌体沉淀。

5、取步骤4得到的菌体沉淀，悬浮于PBS缓冲液，然后进行超声破碎(100W，总时间15min，单次超声时间5s，单次间隔时间5s)，然后4℃、12000g离心20min，收集沉淀(包涵体)。

6、取步骤5得到的包涵体，溶解于含8M尿素和0.4％(体积百分含量)β-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲液(pH8.0、50mM)中，4℃、12000g离心20min，收集上清液。

7、取步骤6得到的上清液，滴加于复性液中，16℃、80rpm振荡反应72小时，然后用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。

复性液(pH7.5)：含50mM Tris、0.5M NaCl、1mM氧化谷胱苷肽和2mM还原谷胱苷肽，余量为水。

8、取步骤7得到的滤液，进行Ni柱层析。

Ni柱层析的具体参数：采用加载有Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析填料的PD-10柱；上样后，先用10倍柱体积的含50mM咪唑和0.5M NaCl的PBS缓冲液洗涤(以去除未结合的蛋白)，然后用3倍柱体积的含300mM咪唑和0.5M NaCl的PBS缓冲液洗脱(收集过柱后溶液)。

9、取步骤8得到的过柱后溶液，进行脱盐。

脱盐的具体参数：采用加载有Sephadex G-25S填料的HiTrap Desalting脱盐柱；上样后，用1.5倍柱体积的PBS缓冲液洗涤，在1/3柱体积时出峰，出峰时收集过柱后溶液，即为CBD-NT3蛋白溶液。

二、CBD-NT3蛋白的生物活性测定

1、取出生5天的SD大鼠，解剖并分离获得小脑。

2、将小脑剪碎，然后用0.25％的胰酶溶液37℃消化40分钟，用10％的胎牛血清终止消化，250g离心5分钟，弃上清(残留物即为为小脑颗粒神经元)。

3、取多孔板，分别按试验组和对照组进行处理。

试验组：小脑颗粒神经元置于蛋白浓度为40nM的CBD-NT3蛋白溶液(取步骤一制备的CBD-NT3蛋白溶液，用PBS缓冲液稀释)中，37℃培养24小时。

对照组：小脑颗粒神经元置于PBS缓冲液中，37℃培养24小时。

4、完成步骤3后，收集所述多孔板，吸弃上清，先在4％多聚甲醛中固定20分钟，然后在5％牛血清白蛋白溶液中室温孵育1小时。

5、完成步骤4后，取所述多孔板，吸弃上清，在一抗(小鼠抗βIII tubulin单克隆抗体，1:500,05-559,Millipore)中4℃孵育12小时。

6、完成步骤5后，取所述多孔板，吸弃上清，在二抗(Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG，1:500,A11001,Invitrogen)中室温孵育1小时。

细胞核采用Hoechst 33342(1:1000,B2261,Sigma)染色，采用Zeiss 200荧光显微镜观察，并采用AxioVision(Zeiss Microscopy GmbH,Germany)存取软件进行分析。

在显微镜下的照片见图5。神经元的平均神经突长度见图6。

试验组的孔中，神经元表现出了神经突外生。与对照组相比，试验组神经元能延伸更长的神经纤维(p<0.05)。

三、复合功能支架

将实施例1的步骤三制备的复合支架置于无菌皿中，将20μl步骤一制备的CBD-NT3蛋白溶液(总蛋白含量为5μg)均匀滴加在复合支架上，得到复合功能支架，无菌保存备用。

实施例3、脊髓损伤模型的建立与移植治疗手术

试验动物：雌性SD大鼠，体重180-200g，维通利华实验动物技术有限公司。

一、制备模型并移植治疗(均在试验第1Tina进行)

取试验动物，采用腹腔注射水合氯醛(0.5g/kg)的方式麻醉，备皮，消毒背部皮肤，然后手术刀制作约2cm的切口，暴露T8-T10截段的脊椎，采用椎扳切除术暴露T9段脊髓，完全横断1mm的脊髓，得到完全横断脊髓损伤模型。彻底止血后，分成四组，每组12只动物，分别进行如下处理：

第一组(复合材料+神经营养因子组)：将实施例2的步骤三制备的复合功能支架移植到损伤处，然后缝合肌肉层和皮肤；

第二组(复合材料组)：将实施例1的步骤三制备的复合支架移植到损伤处，然后缝合肌肉层和皮肤；

第三组(单一材料组)：将实施例1的步骤三的3制备的圆片状支架移植到损伤处，然后缝合肌肉层和皮肤；

第四组(空白对照组)：不进行任何移植处理，直接缝合肌肉层和皮肤。

12只雌性SD大鼠，不进行任何处理，与以上各组平行饲养，作为正常组。

二、检测效果

1、行为学测试

试验第7天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天、第49天、第56天、第63天、第70天、第77天和第84天(依次作为术后1周、术后2周、……、术后12周的数据)，对每只动物进行行为学测试。

行为评分标准参考文献报道，采用BBB评分法进行，分为0-21分，共22级。21分为正常功能，0分为下肢运动功能完全丧失，运动功能越好，分数越高。BBB评分采用单盲检测法，将动物放置于平整干净的爬行垫上，每只老鼠观察5分钟并进行评分。

结果见图7。正常组大鼠连续12周均为21分。第一组至第四组，术后1周评分均为0,术后2周至术后12周评分均呈升高趋势，术后10周开始进入平台期。从术后2周开始，第一组的评分均显著高于第二组、第三组和第四组。结果表明，在脊髓损伤后12周的恢复期内，移植复合功能支架能显著提升下肢运动功能恢复。

2、电生理检测

试验第85天，麻醉动物，采用Keypoint多通道-刺激电位/肌动描记器系统

(9033A07,Dantec Company,Copenhagen,Denmark)检测皮层运动诱发电位(MEP)。两刺激电极插入运动皮层头盖骨的表面，两个接收电极插入至大鼠腓肠肌约2mm深，参考电极插入背部皮肤约3mm深。45mA电流强度单刺激下记录MEP。

结果见图8，A为运动诱发电位的直接输出结果，B为运动诱发电位潜伏期的统计对比，C为运动诱发电位振幅的统计对比。第一组至第四组运动诱发电位的潜伏期都未能恢复至正常组水平，但是第一组电位的潜伏期明显小于第四组(p<0.05)。第一组至第四组电位的振幅同样未能恢复至正常组水平，但是第一组电位的振幅(20.7±

1.53μV)明显高于第二组、第三组和第四组(p<0.01)。结果表明，移植复合功能支架的治疗方法能有效促进电生理改善。

3、大体标本观察

试验第85天，进行大体观察。照片见图9。第一组至第四组动物胸段脊髓均可见明显的损伤点，其中第四组、第三组、第二组脊髓损伤点面积较大，溃烂区域明显。而第一组脊髓损伤点面积最小，并且与周围正常脊髓整合最好，相对于第二组、第三组和第四组，第一组的组织连接性更好。

4、免疫荧光染色检测神经再生情况

试验第85天，麻醉处死所有动物，分离脊髓，切取包含损伤区域的长约2cm的截段，先用OCT包埋剂包埋，然后制成15mm厚的冰冻切片。取冰冻切片，先用冷丙酮固定10分钟，然后置于含5g/100mL胎牛血清和0.3g/100mL Triton X-100的水溶液中室温孵育1小时。然后分别与抗βIII tubulin的单抗(Tuj-1，1:500)、抗Map2的单抗(1:500)、抗neurofilament的单抗(NF,1:500)杂交，检测神经再生情况。每项染色指标是随机选取每组六只动物的六张切片进行分析，所有图片利用Leica TCS共聚焦显微镜采集所得。抗βIII tubulin的单抗：Abcam，Ab18207。抗Map2的单抗：Abcam，Ab11267。抗neurofilament的单抗：Abcam，Ab8135。

Tuj-1的结果见图10和图11。在第一组、第二组和第三组中，能发现跨越损伤区域再生的细条状的Tuj-1阳性组织。在第一组中，能观察到损伤点形成了跨越损伤截段的神经元桥接。第一组中，Tuj-1阳性神经元的数量明显高于第二组、第三组和第四组。结果表明，移植复合功能支架能有效促进脊髓损伤后新生神经元的产生。

Map2的结果见图12和图13。在脊髓切片的损伤中心，第一组中Map2阳性神经元(成熟神经元)的数量明显高于第二组、第三组和第四组。结果表明，复合功能支架具有最好的治疗效果，紧密结合于复合支架上的CBD-NT3蛋白通过其神经营养作用更好地促进了成熟神经元的存活及产生。

NF的结果见图14和图15。在组织的损伤点，第一组相比于第二组、第三组和第四组表现出了最多的NF阳性信号，提示了其具有最多的轴突再生数量。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种复合支架材料及其应用

<130> GNCYX180194

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 160

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Thr Lys Lys Thr Leu Arg Thr Gly Ser Ala Gly

20 25 30

Ser Ala Ala Gly Ser Gly Gly Lys Leu Tyr Ala Glu His Lys Ser His

35 40 45

Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp

50 55 60

Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly His Gln Val Thr Val Leu Gly

65 70 75 80

Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr

85 90 95

Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp

100 105 110

Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg

115 120 125

Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg

130 135 140

Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr

145 150 155 160

<210> 2

<211> 483

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atgactaaga aaaccctgcg tactggtagc gcgggcagtg ctgcgggttc tggcggtaag 120

ctttacgcgg agcataagag tcaccgaggg gagtactcgg tatgtgacag tgagagtctg 180

tgggtgaccg acaagtcatc ggccatcgac attcggggac accaggtcac ggtgctgggg 240

gagatcaaaa cgggcaactc tcccgtcaaa caatattttt atgaaacgcg atgtaaggaa 300

gccaggccgg tcaaaaacgg ttgcaggggt attgatgata aacactggaa ctctcagtgc 360

aaaacatccc aaacctacgt ccgagcactg acttcagaga acaataaact cgtgggctgg 420

cggtggatac ggatagacac gtcctgtgtg tgtgccttgt cgagaaaaat cggaagaaca 480

tga 483

Claims

1.负载特定蛋白质的支架；

所述负载特定蛋白质的支架是将特定蛋白质负载于复合支架得到的；所述复合支架是将凝胶状胶原材料负载于聚合物支架得到的；

所述特定蛋白质为序列表的序列1所示的蛋白质；

所述凝胶状胶原材料，其制备方法包括如下步骤：

（1）取牛的真皮组织，用水清洗；

（2）取完成步骤（1）的组织，置于表面活性剂溶液中浸泡；

（3）取完成步骤（2）的组织，置于水中浸泡并清洗；

（4）取完成步骤（3）的组织，进行冷冻干燥，得到干燥组织；

（5）取步骤（4）得到的干燥组织，溶于醋酸溶液；

（6）将完成步骤（5）的整个体系转移到透析袋中，先在醋酸溶液中进行透析，然后在水中进行透析；

（7）完成步骤（6）后，收集透析袋内的整个体系，然后进行冷冻干燥，得到干粉，即为干粉状胶原材料；

（8）取步骤（7）得到的干粉状胶原材料，用溶剂溶解，得到凝胶状胶原材料；

所述聚合物支架，由聚富马酸丙二醇酯和富马酸二乙酯组成，其中聚富马酸丙二醇酯的质量百分含量为60%-80%；

所述聚合物支架的制备方法依次包括如下步骤：

②采用激光束进行穿孔。

2.权利要求1所述的负载特定蛋白质的支架在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下（c2）至（c3）中的至少一种：

（c2）促进神经元形成；

（c3）促进神经元存活。