CN101979106B - 修复脊髓损伤的生物材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种修复脊髓损伤的生物材料及其制备方法与应用。修复脊髓损伤的生物材料的制备方法，包括如下步骤：a)有序胶原材料与151IgG共价交联，形成交联151IgG的有序胶原材料；b)将带胶原结合区的脑源性神经营养因子与步骤1)得到的交联151IgG的有序胶原材料孵育，得到所述修复脊髓损伤的生物材料。该生物材料能够促进神经再生并且消除神经再生的抑制因素，同时能引导神经再生的方向。这种多功能生物材料在神经损伤修复中有着重要的应用价值。

Description

修复脊髓损伤的生物材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及修复脊髓损伤的生物材料及其制备方法与应用。

背景技术

脊髓是连接外周与大脑中枢神经系统的桥梁，它将身体的感觉(如痛觉、温度觉、触觉)刺激传导至大脑，也将大脑的指令传导到运动肌群而产生运动。另外，脊髓还负责一些神经反射。脊髓损伤主要因外伤、炎症、肿瘤等引起。严重的脊髓损伤会出现脊髓组织的缺失，这种脊髓损伤称为脊髓横断损伤。哺乳动物脊髓部位的中枢神经损伤后，受损神经的再生能力非常有限。这种神经再生能力的匮乏不仅是由于受损部位神经元死亡以及神经纤维的退行性变化，还因为脊髓损伤后，受损神经所处的体内环境中含有多种抑制神经再生的因素。一系列实验也证明，一些特殊的分子可以抑制神经再生。促进脊髓横断损伤后神经再生和功能恢复不仅需要受损轴突的生长，还需要形成有效的突触连接，这样才能正确传导神经冲动。

脊髓损伤后，对于神经再生有抑制作用的物质主要是硫酸软骨素(CSPG)和与髓鞘相关的3种分子：Nogo-A，髓鞘相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)。Nogo-A，MAG和OMgp的抑制作用是通过激活NgR和p75/TROY受体复合物来介导的，继而引发神经细胞内钙浓度升高，激活表皮生长因子受体(EGFR)。所以，EGFR的激活处于NgR受体复合物的下游。除了髓鞘相关的几种分子，胶质细胞分泌的硫酸软骨素(CSPG)也是阻碍神经再生的重要因素。研究证明，CSPG也能激活EGFR。可见，抑制神经再生的几种物质都能激活EGFR。所以，EGFR可以作为治疗神经损伤并促进神经再生的重要治疗靶点。

脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的一员。它能够促进神经元存活、分化，并在突触可塑性中发挥重要作用。

胶原支架材料能够为轴突的生长搭桥，起到引导轴突生长的作用。胶原蛋白是一种在组织工程中广泛应用的生物材料，它免疫原性低，生物相容性好，可降解性能好。我们实验室前期工作中制备的有序胶原材料(LOCS)是一种很好的神经生长引导材料，能引导神经细胞轴突沿有序胶原材料细丝的方向生长，这样，就能引导神经元形成正确的突触连接，有助于神经功能的恢复。同时，有序胶原材料能结合神经营养因子，可以作为神经营养因子的载体，我们还可以对有序胶原材料做其他修饰，使之带有可以阻断轴突再生抑制物的物质。

在前期工作中，我们已经制备出具有胶原结合能力的脑源性神经营养因子(collagen binding BDNF，CBD-BDNF)，并且验证了CBD-BDNF与有序胶原材料具有特异结合能力。结合了CBD-BDNF的有序胶原材料能有效促进脊髓半横断损伤后的神经再生和运动功能恢复(Han Q，Sun W，Lin H，Zhao W，Gao Y，Zhao Y，et al.Linearordered collagen scaffolds loaded with collagen-binding brain-derivedneurotrophic factor improve the recovery of spinal cord injury in rats.TissueEng 2009；15：2927-35.)。

但是，促进比脊髓半横断损伤更加严重的脊髓横断伤后的神经再生，不仅仅需要用有序胶原材料引导神经再生的方向、用神经营养因子促进受损神经元的存活和轴突生长，还要尽量将损伤部位微环境中抑制神经再生的各种因素的影响降到最低。这样，既增加了积极因素，又消减了消极因素，神经再生的效果才能更好。

151IgG是EGFR的竞争性抑制剂，能够封闭EGFR的信号通路，所以它也被称为EGFR的中和抗体。如果有序胶原材料可以携带151IgG，就能在促进神经再生的同时，消除神经再生的抑制因素。我们通过化学交联的方法直接将151IgG共价交联到有序胶原材料上，选用的化学交联剂是sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(Sulfo-SMCC)和2-iminothiolane·HCl(Traut’sReagent)。Sulfo-SMCC是一种异双功能交联剂，在分子的两端分别含有一个反应官能团，即羟基琥珀酰亚胺基(N-hydroxysuccinimide ester group，NHS)和马来酰亚胺基(maleimide group)。NHS可以和伯氨基(-NH2)反应，而马来酰亚胺基可以和巯基(-SH)反应，这样Sulfo-SMCC就可以将含有伯氨基(-NH2)和巯基(-SH)的两个分子共价交联在一起。Traut’s Reagent是一种环形的交联剂，能与伯氨基(-NH2)发生化合反应，同时释放出巯基(-SH2)，从而向目标分子上添加巯基(-SH2)。通过Traut’s Reagent与有序胶原材料LOCS化合交联，生成有序胶原材料LOCS-Traut’s；然后混合Sulfo-SMCC和151IgG化合成151IgG-SMCC。混合上面两种新生成的化合物，可以得到共价交联了151IgG的有序胶原材料LOCS。

CBD-BDNF可以与有序胶原材料LOCS特异结合，那么，有序胶原材料共价交联151IgG并且结合CBD-BDNF后，就带有两种活性功能成分：151IgG和CBD-BDNF。我们将这种生物材料取名为LOCS-151IgG+CBD-BDNF，它能引导神经再生，促进神经轴突的生长，同时消除抑制神经再生的因素。用大鼠6mm脊髓全横断损伤模型来验证这种具有多种功能的生物材料对于神经再生的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种修复脊髓损伤的生物材料(命名为LOCS-151IgG+CBD-BDNF)的制备方法。

本发明提供的制备方法包括如下步骤：

a)有序胶原材料与151IgG共价交联，形成交联了151IgG的有序胶原材料；

b)将带胶原结合区的脑源性神经营养因子与步骤a)得到的交联了151IgG的有序胶原材料孵育，得到所述修复脊髓损伤的生物材料。

所述有序胶原材料、所述151IgG和所述带胶原结合区的脑源性神经营养因子的配比是长度6mm、直径4mm的有序胶原材料、2-6μg的151IgG和0.3-1.0nmol的带胶原结合区的脑源性神经营养因子；优选配比是长度6mm、直径4mm的有序胶原材料、4μg的151IgG和0.5nmol的带胶原结合区的脑源性神经营养因子。

步骤a)中，所述共价交联的步骤包括如下步骤：将所述151IgG与Sulfo-SMCC室温反应0.4-1.0小时，生成化合物151IgG-SMCC，然后将所述151IgG-SMCC与所述有序胶原材料室温反应0.6-1.5小时，得到所述交联了151IgG的有序胶原材料；

所述151IgG与Sulfo-SMCC的配比是4μg∶0.075mg；所述151IgG与Sulfo-SMCC室温反应0.5小时；所述151IgG-SMCC与所述有序胶原材料室温反应1小时；

所述有序胶原材料优选是用Traut’s Reagent修饰过的；所述Traut’s Reagent修饰的方法优选包括如下步骤：将Traut’s Reagent与所述有序胶原材料反应1.03.0小时，优选是2.0小时；所述Traut’s Reagent与所述有序胶原材料的配比是0.5mg的Traut’s Reagent和长度6mm、直径4mm的有序胶原材料。步骤b)中，所述孵育是3-10℃反应0.6-6小时，优选4℃反应1小时。

进一步讲，上述有序胶原材料(LOCS)的制备方法包括如下步骤：

1)将牛筋膜用体积百分浓度为1-1.5％的磷酸三丁酯溶液处理24-72小时；

2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的Tris-HCl缓冲液处理24-72小时；

3)接着，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96小时，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8；得到所述有序胶原材料；

上述处理的温度均为2-8℃，优选是4℃。

步骤3)得到所述有序胶原材料还经过浓度为0.5-1.5mol/L强碱溶液处理5-10分钟；

步骤1)中，所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液；

步骤1)中，所述筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪。

具体地讲，上述带胶原结合区的脑源性神经营养因子的获得包括如下构建方法：将序列表中序列2的第7-366位所示的BDNF成熟肽基因插入pET 28a his-CBD质粒的多克隆位点构成重组表达载体，然后将所述重组表达载体在大肠杆菌中表达得到所述带胶原结合区的脑源性神经营养因子；

所述pET 28a his-CBD质粒是将胶原结合区的DNA片段(序列表中序列1所示的片段)插入pET28a载体的多克隆位点得到的重组质粒。

上述制备方法得到的修复脊髓损伤的生物材料也属于本发明的保护范围之内。

所述生物材料中的所述胶原材料、所述151IgG和所述带胶原结合区的脑源性神经营养因子的配比是长度6mm、直径4mm的有序胶原材料、2-6μg 151IgG和0.3-1.0nmol带胶原结合区的脑源性神经营养因子；优选配比是长度6mm、直径4mm的有序胶原材料、4μg 151IgG和0.5nmol带胶原结合区的脑源性神经营养因子。

上述生物材料在制备促进脊髓损伤修复的材料中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述生物材料在制备促进脊髓横断部位电生理恢复的材料中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述生物材料在制备促进神经再生的材料中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述生物材料在制备减少脊髓损伤部位胶质细胞增生的材料中的应用也属于本发明的保护范围之内。

实验证明：将本发明制备得到的生物材料LOCS-151IgG+CBD-BDNF进行体外活性实验发现：当培养基中加入了5μg/ml的髓鞘相关蛋白时，DRG不仅可以长出轴突，而且轴突的长度明显长于其他组。体内活性实验发现：生物材料LOCS-151IgG+CBD-BDNF治疗的大鼠，其横断部位电生理的恢复显著好于其他组；损伤部位的胶质细胞阳性率显著小于其他组。

综上所述，结合CBD-BDNF并且共价交联151IgG的有序胶原材料(LOCS-151-IgG+CBD-BDNF)是一种多功能的生物材料，能够促进神经再生并且消除神经再生的抑制因素，同时能引导神经再生的方向。这种多功能生物材料在神经损伤修复中有着重要的应用价值。

附图说明

图1：为多功能生物材料的示意图和实物图。

图2：体外培养的DRG在有序胶原材料上的生长状态。

图3：151IgG与有序胶原材料的交联实验和CBD-BDNF与有序胶原材料的结合实验。

图4：体外活性实验。

图5：大鼠脊髓全横断动物模型及电生理监测。

图6：损伤部位的神经再生情况。

图7：损伤部位胶质细胞增生的情况。

图8：有序胶原材料示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

材料说明：

一、有序胶原材料，由本实验室制备，方法如法参考专利ZL 200510098731.5，具体步骤如下：

(一)、取材与处理

1、预处理筋膜

取新鲜带有白色筋膜的成年牛肌肉，用冷的去离子水冲洗3遍；用镊子和手术刀分离出筋膜，尽量去除内层粘附的肌肉组织，和外层的脂肪等组织。

2、材料制备

将预处理筋膜按如下步骤处理：

1)1％TnBP(磷酸三丁酯)溶液(50mM Tris-HCl，pH＝8.0，体积百分比)中48小时；

2)50mM Tris-Cl buffer(pH＝8.0，含有1M NaCl)中处理48小时；

3)1g胰蛋白酶/100ml(50mM Tris-HCl缓冲液，pH＝8.0)中处理72小时；

4)1M NaOH中处理5分钟，充分清洗直至中性；

冻干，即得到本发明的有序胶原材料，命名为有序胶原材料(Linear orderedcollagen scaffolds，LOCS).

(二)材料的形态

所得有序胶原材料LOCS为白色片状形态，还可以将其制备为有序的管状或者胶原纤维。LOCS的形态图如图8所示，图8a、图8b和图8c分别表示片状的、管状的及纤维状的LOCS，标尺长＝1cm；图8d为LOCS的扫描电镜照片。由图8表明，LOCS保持了天然胶原纤维的结构，其电镜照片显示了它具有有序的表面结构，其粗糙的表面结构也利于细胞的贴附。

二、151IgG购买自Developmental Studies Hybridoma Bank。

三、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC均购自Invitrogen公司。

四、pET 28a his-CBD质粒(本实验室已有的质粒，带有组氨酸标签和胶原结合区序列，ZL 200610081506.5)，具体如下：将CBDU与CBDD(表1)互为模板，以搭桥PCR的方式扩增胶原结合结构域与连接肽的编码序列，50μl PCR反应体系为：引物CBDU与CBDD各1pmol/μl，dNTPs 200μmol/μl，Taq酶1ul，用ddH20补充反应体系至50μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，然后测序发现得到一条核苷酸序列如序列表中序列1所示的条带。回收并纯化该目的条带后，将其用限制性内切酶Nde I和HindIII进行双酶切后与经同样酶双酶切的原核表达载体pET28a(Novagen公司)连接，对其进行测序，测序结果表明获得了序列正确的胶原结合结构域与连接肽的编码序列，将正确连接有该序列的重组载体命名为pET 28a his-CBD。

表1引物序列

五、带胶原结合区的脑源性神经营养因子(CBD-BDNF)和不带胶原结合区的脑源性神经营养因子(NAT-BDNF)由本实验室纯化得到。

制备方法如下：首先，构建带有CBD-BDNF和NAT-BDNF的表达载体。制备序列表中序列2所示的BDNF成熟肽(hsdparrgel svcdsisewv taadkktavd msggtvtvle kvpvskgqlkqyfyetkcnp mgytkegcrg idkrhwnsqc rttqsyvral tmdskkrigw rfiridtscv ctltikrgr)基因(两端加上了Sal I和Xho I酶切位点)。用Sal I和Xho I双酶切BDNF基因、pET 28a his-CBD质粒和pET28a his质粒(Novagen公司)，通过连接反应将BDNF基因分别插入pET 28ahis-CBD质粒和pET28a his质粒的Sal I和Xho I酶切位点间，构建成质粒pET 28ahis-CBD-BDNF和pET 28a his-NAT-BDNF。前者含有组氨酸标签，胶原蛋白结合区和BDNF成熟肽的DNA序列，后者与前者的区别是不含胶原蛋白结合区。

其次，利用原核蛋白表达体系表达CBD-BDNF和NAT-BDNF。将构建好的pET 28ahis-CBD-BDNF和pET 28a his-NAT-BDNF重组质粒转入BL21E.coli感受态菌中。按2％转接至LB培养基中扩大培养，1‰IPTG诱导BL 21 E.coli表达目的蛋白。37℃，5个小时。8000rpm，4℃离心收集菌体，超声破碎菌体，12,000rpm，4℃离心分离上清和包涵体。镍柱纯化后，对纯化好的CBD-BDNF和NAT-BDNF进行蛋白复性。

实施例1、修复脊髓损伤的生物材料的制备

一、交联151IgG且结合CBD-BDNF的LOCS的获得

(一)发现过程

1、胶原材料的选择

观察体外培养的分离自出生24小时内SD乳鼠背根神经节(DRG)在胶原膜(购自烟台正海生物技术公司)和有序胶原材料LOCS上的生长状态。图2中，A图为DRG在胶原膜上的生长状态，B图为DRG在LOCS上的生长状态，C图为经消化的DRG细胞在LOCS上的生长状态。由图2可见，DRG细胞能够很好的贴附在LOCS上，并且轴突生长状态良好，与A图比较，生长在LOCS上的DRG的轴突沿着有序材料细丝的方向生长。因此，修复脊髓损伤的生物材料中的胶原材料选用有序胶原材料LOCS。

2、151IgG与LOCS结合方式的选择

将151IgG分别通过自然吸附以及共价交联两种方式与LOCS结合。具体步骤如下：

1)自然吸附实验：将LOCS修剪成长度6mm、直径4mm的簇状，辐照灭菌。每簇LOCS用150μl含4μg 151IgG的PBS(pH 7.2，EDTA 4mM)溶液浸泡2小时。

2)交联实验：

①有序胶原材料的准备

将LOCS修剪成长度6mm、直径4mm的簇状，辐照灭菌，将无菌的LOCS放在含有4mM乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 8.0)中浸泡过夜。

②交联

用PBS(pH 8.0，EDTA 4mM)溶解Traut’s Reagent，配制成2.5mg/ml Traut’sReagent(购自Invitrogen)，每簇有序胶原材料中加入200μL 2.5mg/ml Traut’s Reagent，量室温浸泡2小时，然后用PBS(pH 7.2，EDTA 4mM)清洗材料，得到Traut’s Reagent修饰过的LOCS(LOCS-Traut’s)。

用150μLPBS(pH 7.2，EDTA 4mM)溶解0.075mg Sulfo-SMCC(购自Invitrogen)，60℃溶解5分钟，然后在此溶液中加入含有4μg 151IgG，室温条件下反应0.5小时，生成化合物151IgG-SMCC。将这种化合物加载到Traut’s Reagent修饰过的LOCS上，室温反应1个小时。PBS(pH 7.2，EDTA4mM)冲洗，加入含有5％的甘氨酸的PBS(pH 7.2，EDTA 4mM)1小时，得到LOCS-151IgG。

在完成上述1)自然吸附、2)交联实验后，用ELISA来检测151IgG共价交联到有序胶原材料上的交联效率。PBS冲洗三次后，用碱性磷酸酶偶联的山羊抗大鼠二抗检测LOCS上151IgG的量。2mg/ml p-NPP显色后，酶标仪上405nm读数。

结果如图3A所示，图A显示的是151IgG分别经自然吸附到LOCS和交联到LOCS上的量。可见，交联到LOCS上的151IgG明显多于自然吸附的量。

3、CBD-BDNF与LOCS-151IgG的结合能力检测

不同浓度(0μM-6μM)的CBD-BDNF和NAT-BDNF分别与LOCS-151IgG室温下孵育1小时。PBS冲洗3次后，用5％BSA进行封闭。依次加入兔抗组氨酸一抗、碱性磷酸酶偶联的山羊抗兔二抗。p-NPP显色后，于酶标仪上405nm读数。

结果如图3B所示，B图表示的是不同浓度的NAT-BDNF和CBD-BDNF与LOCS-151IgG的结合能力，可见在每一个浓度点，CBD-BDNF与LOCS-151IgG的结合能力都高于NAI-BDNF。

(二)交联151IgG且结合CBD-BDNF的有序胶原材料的制备

1、按照上述步骤(一)的2)的②交联实验方法制备LOCS-151IgG。

2、将15μl含有0.5nmol CBD-BDNF的溶液滴入步骤1得到的LOCS-151IgG材料上，使之充分被材料吸收(4℃孵育2小时)。PBS冲洗3次后，得到交联151IgG且结合CBD-BDNF的有序胶原材料(LOCS-151IgG+CBD-BDNF)。每簇有序胶原材料携带有4μg151IgG和0.5nmolCBD-BDNF。

图1显示的是结合了CBD-BDNF并且共价交联了151IgG的有序胶原材料的示意图和实物图。如图1A所示，有序胶原材料呈细丝状。B图是移植入脊髓横断部位的既结合CBD-BDNF又交联151IgG的有序胶原材料。

实施例2、修复脊髓损伤的生物材料(LOCS-151IgG+CBD-BDNF)的功能检测

一、体外活性实验

将DRG分别培养在胶原膜和各个经过不同修饰的有序胶原材料上。培养液中添加5μg/ml髓鞘相关蛋白以模拟神经再生的抑制环境。观察DRG的轴突生长情况。所用髓鞘相关蛋白是用密度梯度离心法分离自大鼠脊髓。

结果如图4所示。图A所示，DRG能够在胶原膜上生长出轴突。图B所示，当培养基中加入了5μg/ml的髓鞘相关蛋白时，DRG的轴突生长完全被抑制了。图C所示，在交联了4μg/ml 151IgG的胶原膜上培养DRG，即使培养基中加入了5μg/ml的髓鞘相关蛋白，DRG仍可以生长出轴突。这说明髓鞘相关蛋白抑制轴突生长的作用被151IgG消除。图D所示，在交联了4μg/ml 151IgG并且结合了0.5nmol CBD-BDNF的胶原膜上培养DRG，当培养基中加入了5μg/ml的髓鞘相关蛋白时，DRG不仅可以长出轴突，而且轴突的长度明显长于其他组。这说明，髓鞘相关蛋白的作用能被151IgG消除，而且CBD-BDNF能促进轴突的生长。

图E是对各组DRG轴突平均长度的统计，横坐标1是在胶原膜上，用无血清培养基培养的DRG；2是在胶原膜上，用含有5μg/ml髓鞘相关蛋白的无血清培养基培养的DRG；3是在交联了151IgG的胶原膜上，用含有5μg/ml髓鞘相关蛋白的无血清培养基培养的DRG；4是在交联了151IgG并且结合了CBD-BDNF的胶原膜上，含有5μg/ml髓鞘相关蛋白的无血清培养基培养的DRG。从图E中可以看出，在交联了151IgG且结合CBD-BDNF的胶原膜上生长的DRG，即使处于轴突生长的抑制环境中时，仍能长出长轴突。

二、体内活性实验

1、实验步骤：大鼠6mm脊髓全横断损伤后，将各个经过不同修饰的有序胶原材料移植入6mm长的脊髓缺损处。分为5组：1，对照组(control)：只在脊髓缺损处填充用来止血的胶原海绵；2，有序胶原材料组(LOCS)：脊髓缺损处移植入长度6mm、直径4mm的有序胶原材料；3，结合CBD-BDNF的有序胶原材料组(LOCS+CBD-BDNF)：脊髓缺损处移植入结合了0.5nmol CBD-BDNF的长度6mm、直径4mm的有序胶原材料；4，共价交联了151IgG的有序胶原材料组(LOCS-151IgG)：脊髓缺损处移植入共价交联了4μg 151IgG的长度6mm、直径4mm的有序胶原材料；5，结合了CBD-BDNF并且共价交联了151IgG的有序胶原材料组(LOCS-151IgG+CBD-BDNF)：脊髓缺损处植入既结合有0.5nmol CBD-BDNF也共价交联了4μg151IgG的长度6mm、直径4mm的有序胶原材料。

8周后，进行电生理监测观察神经电位传导的恢复情况。电生理监测后，取出损伤部位的组织，进行免疫组化检测，观察损伤部位的神经再生情况和胶质细胞增生的情况。

2、对于神经电生理传导的恢复作用

图5中，图A至图D是大鼠6mm脊髓全横断损伤模型的手术过程。A，暴露T8-T9胸椎的脊髓；B，切除6mm长大鼠脊髓；C，材料植入脊髓缺损处；D，材料植入后的状态。

图E和图F分别表示了电生理监测的电极放置部位和电生理监测结果。刺激电极在大鼠的腿部肌肉施加电刺激，接收电极分别在脊髓横断部位的靠头端和靠尾端接受电刺激。如果脊髓横断部位的神经传导恢复的越好，电刺激就能越多的传导到横断部位的靠头端，靠头端的接收电极接受到的电位与靠尾端的接收电极接收的电位之比越接近于1。从F图中可见，用既交联了151IgG又结合有CBD-BDNF的有序胶原材料治疗的大鼠，其脊髓横断部位电生理的恢复显著好于其他组。

3、促进神经再生并且减少胶质细胞的增生

图6表示治疗(材料植入后的)8周，损伤部位神经再生的情况。通过神经丝染色表明，结合CBD-BDNF并且共价交联151IgG的有序胶原材料组(LOCS-151IgG+CBD-BDNF)的损伤部位神经再生非常明显(图6E)，神经纤维的密度明显高于其他组，而且神经纤维沿脊髓的纵向方向排列，成平形状态，多数神经轴突都长于500μm。共价交联151IgG的有序胶原材料组(LOCS-151IgG)(图6D)和结合CBD-BDNF的有序胶原材料组(LOCS-CBD-BDNF)(图6C)的神经再生情况类似，神经丝密度没有显著差异，神经纤维明显短于结合CBD-BDNF并且共价交联151IgG的有序胶原材料组(LOCS-151IgG+CBD-BDNF)(图6E)。有序胶原材料组(LOCS)(图6B)也有神经再生，但是神经纤维的密度比以上三组都低，再生的神经纤维很短。对照组(control)(图6A)几乎没有神经再生，损伤处有因脊髓组织大量缺损而形成的空洞。图6F是各组神经丝阳性率的统计分析，可见LOCS-151IgG+CBD-BDNF组的神经丝阳性率显著高于其他组。

图7表示的是治疗(材料植入后的)8周，损伤部位胶质细胞增生的情况。通过胶质细胞的标志物GFAP的染色可见，对照组(control)(图7A)的损伤部位有大量的胶质细胞增生，形成胶质疤痕。其余四组(图7B、C、D、E)的胶质细胞增生都明显少于对照组，其中结合CBD-BDNF并且共价交联151IgG的有序胶原材料组(LOCS-151IgG+CBD-BDNF)(图7E)损伤部位的胶质细胞最少。图7F是GFAP阳性率的统计分析。可见LOCS-151IgG+CBD-BDNF组的神经丝阳性率较其他组低。

我们可以得出结论：这种结合CBD-BDNF并且共价交联151IgG的有序胶原材料是一种多功能的生物材料，能够促进神经再生并且消除神经再生的抑制因素，同时能引导神经再生的方向。这种多功能生物材料在神经损伤修复中有着重要的应用价值。

Claims (10)

1.修复脊髓损伤的生物材料的制备方法，包括如下步骤：

a)有序胶原材料与151IgG共价交联，形成交联了151IgG的有序胶原材料；

b)将带胶原结合区的脑源性神经营养因子与步骤a)得到的交联151IgG的有序胶原材料孵育，得到所述修复脊髓损伤的生物材料。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述有序胶原材料、所述151IgG和所述带胶原结合区的脑源性神经营养因子的配比是长度6mm、直径4mm的有序胶原材料、2-6μg的151IgG和0.3-1.0nmol的带胶原结合区的脑源性神经营养因子。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤a)中，所述共价交联的步骤包括如下步骤：将所述151IgG与Sulfo-SMCC室温反应0.4-1.0小时，生成化合物151IgG-SMCC，然后将所述151IgG-SMCC与所述有序胶原材料室温反应0.6-1.5小时，得到所述交联了151IgG的有序胶原材料；

所述151IgG与Sulfo-SMCC的配比是4μg∶0.075mg；

所述有序胶原材料是用Traut’s Reagent修饰过的；所述Traut’s Reagent修饰的方法包括如下步骤：将Traut’s Reagent与所述有序胶原材料反应1.0-3.0小时；所述Traut’s Reagent与所述有序胶原材料的配比是0.5mg的Traut’s Reagent和长度6mm、直径4mm的有序胶原材料。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b)中，所述孵育是3-10℃反应0.6-6小时。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述有序胶原材料的制备方法包括如下步骤：

1)将牛筋膜用体积百分浓度为1-1.5％的磷酸三丁酯溶液处理24-72小时；

2)然后，用含有0.5-1.5mol/L NaCl的25-100mmol/L、pH为7.6-8.5的Tris-HCl缓冲液处理24-72小时；

3)接着，用0.5-1.5g胰蛋白酶/100ml缓冲液处理48-96小时，所述缓冲液为25-100mmol/L Tris-HCl，pH为7-8；得到所述有序胶原材料；

上述处理的温度均为2-8℃。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤3)得到所述有序胶原材料还经过浓度为0.5-1.5mol/L强碱溶液处理5-10分钟；

步骤1)中，所述磷酸三丁酯溶液的溶剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液；

步骤1)中，所述筋膜在处理前还要去除内层粘附的肌肉组织和外层粘附的脂肪。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述带胶原结合区的脑源性神经营养因子的获得包括如下步骤：将序列表中序列2的第7-366位所示的BDNF成熟肽基因插入pET28a his-CBD质粒的多克隆位点构成重组表达载体，然后将所述重组表达载体在原核表达系统中表达得到所述带胶原结合区的脑源性神经营养因子；

所述pET28a his-CBD质粒是将序列表中序列1所示的片段插入pET28a载体的多克隆位点得到的重组质粒。

8.权利要求1或4-7任一所述制备方法得到的修复脊髓损伤的生物材料，其特征在于：所述有序胶原材料、所述151IgG和所述带胶原结合区的脑源性神经营养因子的配比是长度6mm、直径4mm的有序胶原材料、2-6μg151IgG和0.3-1.0nmol带胶原结合区的脑源性神经营养因子。

9.权利要求8所述的生物材料在制备促进脊髓损伤修复的材料中的应用或在制备促进脊髓横断部位电生理恢复的材料中的应用。

10.权利要求8所述的生物材料在制备促进神经再生的材料中的应用或在制备减少脊髓损伤部位胶质细胞增生的材料中的应用。

Images