CN101827564A - 用于将生长因子递送至纤维结缔组织的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于将纤维结缔组织诱导性生长因子非共价性定位于植入物表面的肽组合物，该组合物包含一种对植入物表面材料具有亲和性的肽，其偶联于一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。本发明提供一种用于以可有效促进纤维结缔组织修复和纤维结缔组织形成的量递送纤维结缔组织诱导性生长因子GDF-7的方法。本发明还提供通过使该组合物与植入物表面相接触而将该肽组合物施予植入物的方法以及包含该组合物的试剂盒。

Description

用于将生长因子递送至纤维结缔组织的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本发明要求2007年9月4日提交的美国临时申请专利序列号No.60/969,748的优先权；其披露案的全部内容结合于此供参考。
资助声明
本发明部分得到政府支持，来自国家关节炎和肌骨骼和皮肤病研究所的资助No.1R43AR053753-01。因此，美国政府在本发明中具有某些权利。
技术领域
本发明的主旨涉及用于将生长因子递送至纤维结缔组织的组合物。较具体的，本发明涉及对用于纤维结缔组织再生非常重要的生长因子具有亲和性的肽家族，这些肽与用于一种或多种修复纤维结缔组织缺损或诱导纤维结缔组织形成的植入物相关的组合物和方法中非常有用。
背景技术
在美国，每年有近500万人因为肌腱疼痛而就医，其中约20万人需要进行手术修复。肌腱和韧带的损伤非常普遍，且预计这些损伤的频率随着人群老龄化而上升，且持续活跃。肌腱修复术在美国非常普遍，包括肌腱套腱(51,000/年)、跟腱(44,000/年)和膑腱(42,000/年)。
由于纤维结缔组织如肌腱和韧带的愈合是一个耗时的过程，因此需要长时间的固定和康复。固定受伤的纤维结缔组织可使愈合过程启动，同时将可能干扰愈合过程和/或使正愈合的纤维结缔组织再次损伤的动作减到最少。然而，一旦愈合过程在愈合期的纤维结缔组织中提供足够的机械强度及其完整性，则通常鼓励个体“康复”该组织。愈合期纤维结缔组织的康复常常通过增强运动的有效范围而实现，据信其可促进组织功能更好的恢复、加速组织愈合以及增强组织修复的质量。此外，还需要减少肢体或关节的固定时间，因为即使6-8周的固定时间也可引起肌肉萎缩、关节僵化、骨关节炎的风险以及其他并发症。因此，任何可通过提高愈合速率而缩短该时间(以及因此所修复组织的强度)的治疗还将通过使患者较快恢复活动而提高护理。
尽管目前用于受伤纤维结缔组织修复的手术操作通常都相当成功，但包括修复失败在内的并发症并不少见。例如，慢性退行性肩袖撕裂就对骨科大夫提出了一种严峻挑战。由于组织缺损和回缩，肩袖撕裂可在最初修复后引起过强的张力，并引起初次修复的失败。目前，由于肌腱退化和肌肉萎缩，较大慢性撕裂的初次修复失败率可达38％。
生长分化因子(GDF)是生长因子家族的成员，属于骨形态发生蛋白(BMP)家族。GDF-5、GDF-6和GDF-7(还分别称为BMP-14、BMP-13和BMP-12)与纤维结缔组织形成和愈合显著相关，因为其在体外和体内均刺激纤维结缔组织的产生。例如，GDF-5敲除小鼠已证实该生长因子对于正常肌腱发育非常必要。已证实GDF-5缺乏可改变跟腱的超结构、机械性能和组分，并显著减慢其在损伤模型中的愈合。这些GDF蛋白彼此之间密切相关，具有至少约80％-86％的氨基酸同源性。此外，啮齿类和人类GDF之间的氨基酸一致性为：GDF5是97％，GDF6是95％而GDF-7是97％。
体内肌腱修复实验已提出对GDF剂量的担忧。GDF能够驱动除肌腱细胞之外的多种细胞类型分化，包括成骨细胞和软骨细胞。因此，以恰当剂量范围之外的剂量将GDF应用于肌腱修复部位，或在肌腱修复部位以外应用GDF，则有诱导不必要的骨和/或软骨形成的风险。已在研究GDF-7的临床前动物模型中观察到软骨岛，特别是在采用较高剂量时。因此，尽管生长因子常常对组织发挥有效的治疗活性，其还可以触发健康组织或非靶组织的异位或不需要的反应。需要特别注意的是，生长因子如GDF，特别是在较高或意外剂量时，能够驱动关节、肌腱、软骨和骨的异位分化。因此，这些生长因子的递送必须采用最小有效剂量的生长因子，将其严格限制于特定区域内。尽管已有少数几种技术开发用于递送生长因子(例如洗脱生长因子的聚合物)并满足这些递送要求，但成功仍然较少。
因此，目前仍然需要一种用于将生长因子定向递送并保留于待治疗纤维结缔组织部位的系统，用于促进纤维结缔组织愈合和/或生长。
发明内容
本发明涉及用于将纤维结缔组织诱导性生长因子递送至植入物表面促进纤维结缔组织形成和修复的肽组合物。本发明还提供涂布该肽组合物的植入物以及用于将该纤维结缔组织诱导性生长因子递送至植入物表面的方法。该肽组合物包含一种对植入物表面材料具有亲和性的表面结合肽，其已偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。本发明还提供包含该肽组合物的试剂盒。
附图说明
图1是一个示意图，示出了本发明所披露的肽，其对植入物的表面材料具有亲和性，而该植入物偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。图1中，示出了纤维结缔组织诱导性生长因子GDF-7结合于该肽。
图2是一个示意图，比较本发明所述一系列肽在缝合线上捕获GDF-7的EC50值。所述肽包括对植入物表面材料具有亲和性的肽，而该植入物偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。图2中，所采用对植入物表面材料具有亲和性的肽是SEQ ID NO：67(白色框)或者SEQ IDNO：71(浅灰色框)。类似的，所采用对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽是SEQ ID NO：2(深灰色框)。此外，图2中的肽包含脂肪酸末端修饰或脂肪酸连接物(浅色锯齿状阴影是十一烷酸，深色锯齿状阴影是肉豆蔻酸)、PEG连接物(MP表示mini-PEG，P10表示PEG10)和氨基酸连接物(GSSG)中的一种或多种。
具体实施方式
大多数软组织的愈合，包括基底细胞增生和血管化，需要7-10天。然而，因为必须合成大量胶原，并恰当重建而形成具有足够完整性的纤维结缔组织，以承受肢体多种运动过程中产生的压力，因此纤维结缔组织的愈合可能需要几周的时间。例如，肌腱愈合可通过腱鞘和鞘内膜细胞增生而内在发生；或者可通过周围鞘和滑膜的细胞浸润而外在发生。内在修复仅依赖于组织本身的细胞来实现愈合。外在修复则依赖于外部组织来源的细胞浸润。在纤维结缔组织修复中，两种模式均涉及到，其中外在修复在该过程的早期涉及，而内在修复则在该过程的晚期涉及。由于周围组织整合入疤痕组织，因此外在修复可能引起粘连。粘连可能导致新形成的纤维结缔组织运动范围障碍。
在本发明的一个实施方式中，提供用于将纤维结缔组织诱导性生长因子递送至植入物表面以及用于刺激纤维结缔组织产生的组合物。由于利用处于正常位置的植入物表面的组合物进行递送，纤维结缔组织诱导性生长因子可刺激体内纤维结缔组织的产生。因此，所述组合物在促进纤维结缔组织修复或植入物部位纤维结缔组织形成中的一种或多种比较有用。根据本发明所述的组合物对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性，可包含结合于其上的纤维结缔组织诱导性生长因子。因此，例如，利用本发明所述的组合物来包被所采用缝合受损肌腱边缘的材料以及在修复部位存留和直接递送纤维结缔组织诱导性生长因子，且可有助于通过从所包被的缝线材料持续释放纤维结缔组织诱导性生长因子而促进纤维结缔组织的修复。这些生长因子从缝合材料释放可在缝合部位的局部直接刺激肌腱细胞的迁移和增生(例如，在需要进行纤维结缔组织修复的区域)。相反，在无靶向分子的情况下直接在肌腱修复部位推注生长因子，则更可能弥散入周围组织并刺激外在修复和异位组织形成。
因此，本发明涉及到的组合物包含对能够诱导纤维结缔组织形成的生长因子(“纤维结缔组织诱导性生长因子”)具有亲和性的肽，例如生长因子GDF-5、GDF-6和GDF-7(分别对应于BMP-14、BMP-13和BMP-12)中的一种或多种。在一个实施方式中，相比于GDF家族、BMP或TGF-β(转化生长因子β)超家族中除GDF-7之外的任何成员，该肽表现出对GDF-7(BMP-12)的优先结合。在一个实施方式中，该组合物包含由本发明所述肽构成的涂布组合物，特异性结合于纤维结缔组织诱导性生长因子。在该实施方式的一个实例中，所述涂布组合物可与植入物相接触，其中，该组合物的肽组分(例如对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽)在形成该植入物表面或其一部分的涂层时，偶联于植入物的表面(如构成该表面的材料)或其一部分。在该实施方式的另一个实例中，该涂布组合物包含至少一种对植入物表面(该表面优先包含聚合物)具有亲和性的肽，偶联于至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽，且可进一步包含纤维结缔组织诱导性生长因子，其结合于所述至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。在该后一种实例中，将该涂布组合物应用于(例如，与其相接触)待涂布的植入物表面，使得在形成该植入物表面上的涂层时，与该表面的特异性结合是该包含对表面具有亲和性的肽的组合物中的一个组分。
在本发明的另一方面，提供了一个共有结构和功能的肽家族，因为这些肽所包含的氨基酸序列具有共同的序列特征，且均对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性。还提供了本发明该方面相关的编码这些肽的核苷酸序列和载体。因此，在一个实施方式中，本发明提供一种用于从组合物持续释放纤维结缔组织诱导性生长因子的肽组合物，该释放主要涉及到纤维结缔组织诱导性生长因子从其结合(借助于该肽的亲和性)的肽解离。
本发明所述肽组合物可以包含治疗有效量的单一纤维结缔组织诱导性生长因子成员(例如GDF-5)或者可以包含治疗有效量的一种以上纤维结缔组织诱导性生长因子(例如GDF-5或GDF-7；或者GDF的任何组合)成员。作为一种以上GDF蛋白家族成员的组合，每一个成员均可以单体或多聚体存在，还可以异聚体(例如，由一种GDF家族成员(例如GDF-5)单体和另一种GDF家族成员(例如GDF-6)的二聚体构成)存在。如本文中将详细阐述的，用于生成本发明所述组合物非常有用的多种肽在其特异结合能力以及与一种或多种GDF蛋白优先结合能力方面有所不同(参见本文实施例1&2)。选择本发明所述组合物中包含GDF蛋白家族的单一成员还是包含该GDF蛋白家族的一种以上成员，将依赖于预期疗效以及待治疗症状。
本发明还提供一种将纤维结缔组织诱导性生长因子递送至植入物表面或其一部分的方法，其中需要将一种或多种纤维结缔组织诱导性生长因子定位于该表面。该方法包括将本发明所述肽组合物施予该表面，所述组合物包含对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽以及纤维结缔组织诱导性生长因子，其中所述肽和纤维结缔组织诱导性生长因子非共价偶联。在一个实施方式中，于植入前将纤维结缔组织诱导性生长因子递送至植入物表面(例如，在制备时或管理时)。将组合物施予该植入物可以其中该组合物已经完成的形式(例如，在形成该组合物时，该组合物的全部组分均为预装配的，然后将该组合物施予植入物)；或者可在其中该组合物在植入物表面上形成的步骤中将组合物施予该植入物(例如，在形成本发明所述组合物时，首先将一个组分(其对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性)偶联于植入物表面，然后在接下来的步骤中，将纤维结缔组织诱导性生长因子施予植入物表面，其上已偶联了一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽)。
在另一个实施方式中，本发明所述组合物可施予已植入患者体内或体表的植入物(例如，“正常位置”施予植入物)。在该实施方式的一个实例中，所述组合物可原位施予植入物，例如通过注射给予已植入的植入物部位；或者，如果在开放部位，可通过例如喷雾或其他方式将组合物恰当施予该植入物。优选的，该组合物以对于该症状(损伤、缺损、病症等)所需疗效非常有效的量而给予包括植入物部位的纤维结缔组织。例如，该组合物可以包含至少一种对植入物表面具有亲和性的肽，而该表面偶联于至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽，还可包含已结合于所述至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽的纤维结缔组织诱导性生长因子。
定义
尽管可以认为本领域中的普通技术人员均可以很好的理解下列术语，但还是列出了下列定义以有助于阐述本发明。
如本领域熟练技术人员已知的，用于本文说明书和权利要求中的的术语“纤维结缔组织”表示包含相当部分胶原(用于弹性和抗张强度)的纤维胶原组织；其中代表性的纤维结缔组织实例包括肌腱、韧带、皮肤的真皮以及眼睛的巩膜。
如本领域熟练技术人员已知的，用于本文说明书和权利要求中的术语“纤维结缔组织诱导性生长因子”表示能够诱导纤维结缔组织形成的生长因子，这些生长因子包括但不限于例如GDF-5、GDF-6、GDF-7(分别对应于BMP-14、BMP-13和BMP-12；“GDF”是生长和分化因子的首字母缩略词)、BMP-2(“BMP”是骨形态发生蛋白的首字母缩略词)和BMP-6(由于其可刺激参与组织修复的韧带纤维母细胞而包括在内)。在一个优选实施方式中，相比于GDF家族、BMP家族或TGF-β(转化生长因子β)超家族中除GDF-7之外的任何成员，该肽表现出对GDF-7(BMP-12)的优先结合。
用于本文说明书和权利要求中的术语“第一”和“第二”是为了在区分两种不同分子时便于阐述，而不是为了限制本发明的范围，除非另有特别指明，否则也不表示空间、时间或等级顺序。
用于本文说明书和权利要求中的术语“植入物”，在提到纤维结缔组织时，指的是一种材料或结构，(a)其可定位于患者体内或体表以预防、治疗、调整或缓解损伤或疾患或病症或症状、修复或恢复受损纤维结缔组织的功能，或者提供一种相对于纤维结缔组织区域的新功能；且(b)包括至少一个表面而能够施予本发明所述组合物。例如，植入物可用来促进需要该治疗的患者体内纤维结缔组织愈合和修复、治疗纤维结缔组织炎(例如肌腱炎)、治疗纤维结缔组织缺损和诱导纤维结缔组织形成中的一种或多种。代表性的实例包括但不限于缝线(例如用于纤维结缔组织损伤)、用来支持和/或提供用于纤维结缔组织形成的表面的基质(其可包括但不限于可生物降解的海绵、心脏修补网状织物、肌腱包绕(tendon wrap，束套)(例如，“包绕”表示理想的纤维结缔组织周围包裹的基质；本领域中有时也指“袖套”)、韧带包绕、用于纤维结缔组织的假体、胶原支架、胶原线、复合胶原毡圈(参见例如U.S.7,252,832)、韧带增强装置、合成的移植物(例如合成的韧带移植物、肌腱置换等)和巩膜扣带。构成植入物表面的材料可包含聚合物，且所述聚合物可包括合成的聚合物。例如，代表性的缝线、合成的韧带移植物、韧带假体和韧带增强装置通常由聚合物构成(例如，聚乙烯对苯二甲酸酯、聚四氟乙烯、聚酯和聚乳酸聚乙醇酸交酯共聚体中的一种或多种)，且形式通常为编织物、纤维或网状物。
用于本文说明书和权利要求中的术语“聚合物”表示由重复结构单位通过共价化学键连接而构成的分子或材料(一个结构单位通常指单体)。根据其预期用途，聚合物可为可生物降解的(如，体内自溶或可生物吸收或降解中的一种或多种)或非可生物降解的；或者合成的(制造的，自然界中不存在)或天然的(天然存在的，如植物和/或动物活组织中生成的)。
被描述为可生物降解的恰当合成聚合物的非限制性实例包括：多聚氨基酸；聚酐包括马来酸酐聚合物；多聚羧酸；某些聚乙烯，包括但不限于聚乙二醇、聚氧化乙烯；聚丙烯，包括但不限于聚丙二醇、聚富马酸二羟丙酯；聚乳酸或聚乙醇酸(及其共聚体和混合物，例如聚L-乳酸(PPLA)、聚D，L-乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、50/50(DL-乳酸-共-乙交酯))中的一种或多种；多正酯类；聚二氧六环酮；聚磷腈；聚缩酚酸酞；聚已酸内酯(及其共聚体和混合物，例如聚(D，L-乳酸-共-己内酯)或聚已酸内酯共-丙烯酸丁酯；聚羟基丁酸戊酯和混合物)中的一种或多种；某些聚碳酸盐(例如酪氨酸源性聚碳酸盐和芳基化物)、聚亚胺基碳酸盐、磷酸钙；氰基丙烯酸酯；某些聚酰胺(包括尼龙)；聚氨基甲酸酯；聚二甲基三甲基碳酸盐；合成的纤维质聚合物(例如醋酸纤维素、丁酸纤维素、玻璃纸)；以及前述中任何一种材料的混合物、组合物和共聚体。被描述为可生物降解的代表性天然聚合物包括大分子(如多糖，例如藻酸盐、淀粉、壳聚糖、纤维素或其衍生物(例如羟丙基甲基纤维素)；蛋白和多肽，例如明胶、胶原、白蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白素原)；聚糖胺聚糖(例如透明质酸、硫酸软骨素)；以及前述材料中任何一种的混合物、组合物、复合物(例如胶原-聚合物的复合底物)和共聚体。
被描述为非可生物降解的恰当合成聚合物的非限制性实例包括：惰性聚芳醚酮，包括聚醚醚酮(“PEEK”)、聚醚酮、聚醚酮酮和聚醚酮醚酮酮；聚氨基甲酸酯；聚苯乙烯和苯乙烯-乙烯/丁烯-苯乙烯封闭共聚体；聚异丁烯共聚体和苯乙烯-异丁烯-苯乙烯封闭共聚体；聚乙烯吡咯酮；聚乙烯醇；乙烯基单体的共聚体；聚乙烯醚；聚乙烯芳香剂；聚氧化乙烯；聚酯，包括聚乙烯对苯二甲酸酯；某些聚酰胺；聚丙烯酰胺；聚醚，包括聚醚砜；聚烷撑，包括聚丙烯、聚乙烯；乙烯与聚丙烯的共聚体；某些聚碳酸盐、硅酮和硅酮橡胶；硅氧烷聚合物；聚四氟乙烯；膨体聚四氟乙烯(e-PTFE)；尼龙及相关聚酰胺共聚体；尼龙；氟化乙烯丙烯；六氟丙稀、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；2-甲基丙烯酸2-羟基乙酯(PHEMA)；聚酰亚胺；聚乙烯对苯二甲酸酯；聚砜和多硫化物；以及前述材料中任何一种的混合物、组合物和共聚体(包括交联的共聚体)。
用于本文说明书和权利要求中的术语“亲和性”指肽(如本文所述的)具有亲和性的能力，其对一种靶分子或表面材料的亲和性高于另一种；例如对异源性分子群中一种特定分子的亲和性。例如，当相比于与另一种生物学组分或生长因子(例如，血小板源性生长因子)的结合，一种肽对纤维结缔组织诱导性生长因子表现出优先结合时，则该肽对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性。另一个实例中，当相比于与另一种表面分子如金属的结合，肽对聚合物表现出优先结合时，则该肽对包含聚合物的表面具有亲和性。这种优先结合可依赖于特殊构象、结构以及/或者该肽和/或对其具亲和性材料表面或内部的电荷。在某些实施方式中，对聚合表面或纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽以比该肽与例如另一种非聚合表面或非纤维结缔组织诱导性生长因子高10％的亲和性或者20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％的亲和性或者较高的百分比进行结合。例如，亲和性可通过一种分析加以测定，在该分析中，对代表肽与纤维结缔组织诱导性生长因子之间相对结合量的信号进行量化(例如荧光或比色)。在一个优选实施方式中，肽具有亲和性，其特征在于该相对亲和性可以10μM或更低的EC50进行测量，较优选1μM，更优选低于100nM。EC50可利用本领域中已知的任何形式的方法进行测定，例如通过从亲和分析而生成浓度反应曲线，该分析中肽的浓度用已知量的底物(肽对其具有亲和性)进行滴定。在该情况中，EC50表示分析中所观察到该肽最大结合50％的肽浓度。
提到本发明所述的肽时，用于本文说明书和权利要求中的术语“肽”，指包含至少一个结合区且长度不少于约10个氨基酸而不多于约100个氨基酸残基的氨基酸链，其中该氨基酸链可包括天然存在的氨基酸、合成的氨基酸、遗传编码的氨基酸、非遗传编码的氨基酸及其组合；然而，特别的，将抗体从具有本发明所述结合区的肽的范围和定义中排除。在另一个实施方式中，本发明所述包含至少一个结合区的肽可具有长度不少于约11个氨基酸且不多于约60个氨基酸残基，或者长度不少于约12个氨基酸且不多于约40或50个氨基酸残基。根据本发明所述的肽结合区包含一个长度不少于约10个氨基酸且不多于约30个氨基酸的相邻序列，且较优选包含长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25的氨基酸。本发明所述肽结合区包括表面结合区和纤维结缔组织诱导性生长因子的结合区。根据本发明所述的术语肽包括任何药用盐或其酯。根据本发明应用的肽可利用化学合成、重组表达、较大分子的生化或酶解断裂、较大分子的化学切割、前述方法的组合而生成，或者通常可通过本领域中的任何其他方法制备并优选是分离的。术语“分离的”表示该肽基本上游离于未成为该肽本身完整结构一部分的组分；例如，比如当通过重组技术生成时基本游离于细胞材料或培养基，或者当通过化学方法合成或者利用生化或化学方法生成时基本游离于化学前体或其他化学材料。
肽可包括L型氨基酸、D型氨基酸或其组合。代表性的非遗传编码氨基酸包括但不限于2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；β-氨基丙酸、2-氨基丁酸；4-氨基丁酸(哌啶酸)；6-氨基酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；锁链(赖氨)素；2.2’-二氨基庚二酸；2，3-二胺基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟(基)赖氨酸；别羟(基)赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链(赖氨)素；别异亮氨酸；N-甲基甘氨酸(肌氨酸)；N-甲基异亮氨酸；N-甲基撷氨酸；正撷氨酸；正亮氨酸；鸟氨酸和3-(3，4-二羟苯基)-L-丙氨酸(“DOPA”)。代表性的衍生氨基酸包括例如那些其中游离氨基酸已衍生形成盐酸铵、p-甲苯磺酰基、苄酯基、t-叔丁氧羟基、氯乙酰基团或甲酸基的分子。游离的羧基可衍生形成盐、甲基和乙基酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可衍生形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可衍生形成N-对-苯甲组氨酸。
此外，根据本发明所述的肽可通过例如化学基团的添加、氨基酸的替代、插入和缺失而加以修饰，其中在应用时，这些修饰可提供某些优势。因此，术语“肽”涵盖多种类型肽衍生物中的任何一种，包括例如酰胺、含蛋白的轭合物、环肽、多聚化肽、保守替代的变异体、类似物、片段、化学修饰的肽以及肽模拟物。具有本发明所述肽家族的预期结合特征的任何肽均可用于实施本发明。例如，一个化学基团当添加至合成肽的N末端氨基酸以封闭该肽氨基末端的化学反应性时，则构成N末端基团。这种用于保护肽氨基末端的N末端基团在本领域中为人熟知，且包括但不限于低级链烷酰基团、酰基、磺酰基和氨基甲酸酯形成基团。优选的N末端基团可包括乙酰基、Fmoc(芴甲基氯甲酸酯)和Boc(叔丁氧羰基)。一个化学基团当添加至合成肽的C末端氨基酸以封闭该肽羧基末端的化学反应性时，则构成C末端基团。这种用于保护肽羧基末端的C末端基团在本领域中为人熟知，且包括但不限于酯或酰胺基团。肽的末端修饰常常对于通过蛋白酶消化而降低易感性并从而当存在含蛋白酶的生物学液体时延长肽的半衰期非常有用。肽末端修饰还可包括脂肪酸修饰。可选的，如本文所述，肽可包括一个或多个已经修饰而包含一个或多个化学基团(例如，反应性官能团如氟、溴或碘)以促进将该肽连接于连接分子的氨基酸。如本文中使用的，术语“肽”还涵盖其中肽键中的一个或多个被拟肽键置换的肽，拟肽键包括但不限于碳键(CH2-CH2)、depsi键(CO-O)、羟基亚乙基键(CHOH-CH2)、酮亚甲基键(CO-CH2)、亚甲基氧键(CH2-O)、还原键(CH2-NH)、硫甲基(thiomethylene)键(CH2-S)、N修饰的键(-NRCO-)和硫肽键(CS-NH)。
对于本发明所述组合物非常有用的肽还可包括相对于本文中表1&3和SEQ ID NOs：1-71和73-76中披露的示例性肽序列而言，具有一个或多个残基替代、添加和/或缺失的肽，只要原始示例性肽的结合属性基本保留。因此，本发明包括其中约1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸(根据本文中披露的示例性肽的长度)不同于示例性序列的肽，以及与本文中披露的示例性序列具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列一致性的肽。序列一致性可手工计算或者可利用计算机执行数学算法例如GAP、BESTIFIT、BLAST和TFASTA进行计算。利用这些程序进行比对可利用默认参数而实施。具有基本由本文所披露示例性肽序列组成的氨基酸序列的肽可由于用功能类似的氨基酸残基取代示例性肽序列中的氨基酸残基而具有一个或多个差异氨基酸残基(“保守性取代”)，只要包含保守性取代的肽将基本保留不含该保守性取代的示例性肽的亲和性。保守性取代的实例包括将一种非极性(疏水的)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代为另一种非极性残基；将一种芳香残基如色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸取代为另一种芳香残基；将一种极性(亲水的)残基取代为另一种极性残基如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与门冬酰胺之间、苏氨酸与丝氨酸之间；将一种碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代为另一种碱性残基；或者将一种酸性残基如门冬氨酸或谷氨酸取代为另一种酸性残基。
在另一个实施方式中，本发明所述肽包括表1&3和SEQ ID NOs：1-71和73-76中披露的示例性肽序列，其羧基和/或氨基末端可包括其他氨基酸(例如在一个末端或两个末端具有1个至约40个其他氨基酸)，只要原始示例性肽的结合特征基本保留。例如，在一个或两个末端包含其他氨基酸的肽保留本文所述对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性或表面亲和性中的一种或两种。例如，如SEQ ID NOs：1-71和73-76所示出的示例性氨基酸序列的一个或两个末端包含其他氨基酸的肽将具有如本文所提供的对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性和/或亲和性，且将不具有任何构成对亲和性显著变化的特征(例如，包含亲和性高于约10至约100至约1000倍或更多差异的显著性变化)。
用于本文说明书和权利要求中的术语“药物可受载体”表示一种携带介质，其是一种用于给予和/或施予本发明所述组合物的恰当支持介质，且优选不显著改变本发明所述组合物(该载体将加入其中)的生物学活性。这种携带介质的实例包括但不限于含水溶液、含水或非含水溶剂、悬液、乳液、凝胶、糊剂等。如本领域中熟练技术人员已知的，恰当药物可受载体可包含一种或多种材料包括但不限于水、缓冲水、医用非胃肠媒剂、盐水、0.3％甘氨酸、含水酒精、等张含水缓冲液；且可进一步包括一种或多种材料如可溶于水的聚合物、甘油、聚乙二醇、甘油、油类、盐类如钠、钾、镁和铵、磷酸盐、碳酸酯、脂肪酸、糖、多糖、糖蛋白(用于增强稳定性)、赋形剂以及防腐剂和/或稳定剂(以延长保质期或者如有必要，适用于该组合物的制备和分布)。
用于本文说明书和权利要求中的术语“连接物”指作为分子桥来共价偶联至少两种不同分子的化合物或部分(例如，参照本发明，将至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子偶联于植入物表面或者偶联于对植入物表面具有亲和性的肽)。因此，例如，该连接物的一部分(例如，“第一”反应官能团)结合于至少一种对聚合物具有亲和性的肽，而该连接物的另一部分结合于至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。如本领域中熟练技术人员已知的，利用本领域中已知的方法，两种分子可逐步偶联于该连接物，或者可同时偶联于该连接物。对于连接物没有特殊的大小和含量限制，只要其可实现作为分子桥的目的，且本发明所述组合物中该肽的亲和性基本保留。
本领域中的熟练技术人员已知，连接物包括但不限于化学链、化合物(例如，试剂)等。所述连接物可包括但不限于同双功能连接物和异双功能连接物。异双功能连接物已为本领域中熟练技术人员所熟知，包含一个具有可特异性连接第一分子的第一反应官能团(化学基团或化学部分)的末端，以及具有可特异性连接第二分子的第二反应官能团的相对末端。对于本领域中熟练技术人员来说，很显然，多种双功能或多功能试剂、同-和异功能试剂(如那些在Poerece Chemical Co.，Rockford，III的目录中阐述的)、氨基酸连接物(典型的，3-15个氨基酸之间的短肽，且常常包含诸如甘氨酸和/或丝氨酸等的氨基酸)以及聚合物(例如聚乙二醇)均可用作根据本发明所述的连接物。在一个实施方式中，代表性的肽连接物包含多个可偶联于结合区的反应部位(例如聚赖氨酸、聚鸟苷酸、聚半胱氨酸、聚谷氨酸和聚门冬氨酸)或包含基本为惰性的肽连接物(例如，聚甘氨酸、聚丝氨酸、聚脯氨酸、聚丙氨酸和其他包含内氨酰、丝氨酰、脯氨酰和/或甘氨酰氨基酸残基的寡核苷酸)。连接物还可利用铜催化的叠氮-炔烃环加成(例如“点击化学”)或本领域中熟知的任何其他方法。连接物在本领域中已为人所知，且包括可切割的连接物(例如，通过加热、通过患者身体内部或体表存在的天然酶、通过pH敏感性)和可制备成对其他分子部分或其本身具有反应性而用于交联的连接物。有用于连接物的pH敏感性材料实例可包括但不限于醋酞纤维素、乙酸-1，2，4-苯三酸纤维素、聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯。根据诸如代连接的分子、实施连接的条件等因素，可改变连接物的长度和组成，用于优化某些特征诸如保持生物学功能、稳定性、对某些化学和/或温度参数的抗性以及保持充分的立体选择性或大小。例如，连接物不应显著干扰组合物充分结合表面(具有恰当的亲合力)或结合纤维结缔组织诱导性生长因子的能力。
恰当的聚合连接物在本领域中已为人所知，可包括合成聚合物或天然聚合物。代表性的合成聚合物包括但不限于聚醚(例如，聚乙二醇(“PEG”)、10个单位的聚乙二醇(“P10”)、mini-PEG，其是Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(“MP”))、聚酯(例如聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA))、多胺、聚酰胺(例如，尼龙)、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸酯(例如，聚甲基丙烯酸甲酯；PMMA)、聚丙烯酸、聚苯乙烯、聚己酸、柔性螯合剂如EDTA、EGTA和其他合成的聚合物，其优选具有约20道尔顿至约1,000千道尔顿的分子量。代表性的天然聚合物包括但不限于透明质酸、藻酸盐、硫酸软骨素、纤维蛋白素原、纤维连接蛋白、白蛋白、胶原、钙调蛋白，以及其他优选具有约200道尔顿至约20,000千道尔顿(表示组分单体)的天然聚合物。聚合连接物可包括二嵌段聚合物、多嵌段共聚体、梳形聚合物、星形聚合物、数值形或分支聚合物、杂合线性-树枝形聚合物、由赖氨酸组成的分支链或随机共聚物。连接物还可包含巯基(氨基)羧酸、丙烯酰胺羧酸、丙烯酰胺-氨基三乙烯乙醇酸、7-氨基苯甲酸及其衍生物。
在另一个实施方式中，本发明所述连接物可为脂肪酸。本发明所述脂肪酸包括饱和和不饱和脂肪酸，诸如但不限于丁酸、己酸、辛酸、癸酸、十一烷酸(AUD)、十二烷酸、肉豆蔻酸、软脂酸、硬脂酸、花生酸、萮树酸、木蜡酸、二十(烷)酸、二十二(烷)酸、二十四烷酸、(肉)豆蔻脑酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。例如，在某些实施方式中，所述脂肪酸连接物用作表面结合肽与纤维结缔组织诱导性生长因子结合肽之间的连接基团。在其他实施方式中，除了用作连接物，本发明所述脂肪酸分子可用来修饰表面结合肽和纤维结缔组织诱导性生长因子结合肽。例如，在某些实施方式中，脂肪酸用来修饰该肽组合物的氨基和/或羧基末端，该组合物包括表面结合肽和纤维结缔组织诱导性生长因子结合肽。
提到本发明所述组合物和底物(包括其结合或偶联的植入物)时，用于本文说明书和权利要求的术语“有效量”表示足以介导该组合物与底物结合的组合物的量；促进该组合物与底物的连接。本文中，提到本发明所述组合物用于修复纤维结缔组织缺损或诱导纤维结缔组织形成中的一种或多种时或者用于说明书和权利要求时，表示该组合物中纤维结缔组织诱导性生长因子用于调节、预防、减缓或治疗包含待治疗纤维结缔组织的疾患和/或病症的量。
按照本发明，用于本文说明书和权利要求时，术语“肽组合物”指一种肽组合物，其包含对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽，而该生长因子已偶联于对由植入物构成的聚合物底物具有亲和性的肽。对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽与对聚合物底物具有亲和性的肽可发生于两个方向。例如，对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽可发生于该肽组合物的氨基末端或羧基末端。类似的，对聚合物底物具有亲和性的肽可发生于两个末端。该肽组合物可进一步包括已结合的纤维结缔组织诱导性生长因子和一种或多种偶联于本发明所述肽的连接物、一种或多种本发明所述氨基和/或羧基末端修饰、一种药物可受载体及其组合。因此，本发明所述肽组合物可由通式I表示：SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP，其中SBP是一种10-100个氨基酸的肽，包含(i)10-30个氨基酸的表面结合区和(ii)对植入物的聚合表面材料的亲和性；GDFBP是一种10-100个氨基酸的肽，包含(i)10-30个氨基酸的纤维结缔组织诱导性生长因子结合区和(ii)对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性；以及L可存在或缺失，且包含SBP与GDFBP之间的共价连接物，其中如果L缺失，则SBP与GDFBP直接连接在一起。
SBP和GDFBP可以各自均保持其亲和性的方式偶联在一起。这种偶联可包括形成多聚分子，其包含两个或多个对植入物表面具有亲和性的肽、两个或多个对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽及其组合。例如，利用肽化学领域中已知的标准试剂和方法，两种肽通过侧链-侧链键合(例如，其中每一种肽均具有一个侧链氨(例如，如赖氨酸的ε氨))、侧链-N末端键合(例如，偶联一种肽的N末端氨与另一种肽的侧链)、侧链-C末端键合(例如，偶联一种肽的C末端化学部分(例如，羧基)与另一种肽的侧链氨)、N末端-N末端键合、N末端-C末端键合、C末端-C末端键合及其组合。在合成或重组表达中，可通过将两种肽均作为单一肽合成或表达，可将对植入物表面具有亲和性的肽直接偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。两种或多种肽可通过连接物进行偶联。
[正式定义部分结束]
本发明提供对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽家族；包含本发明所述肽的肽组合物；通过将本发明所述肽组合物施予植入物而涂布该植入物的方法；以及已涂布的植入物，其中该涂层包含根据本发明所述的肽组合物；本发明所有这些与对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽相关的方面。对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的示例性肽包含由选自由SEQ ID NOs：1-11、73、74或75、对SEQ ID NOs：1-11、73、74或75中任何一种或多种具有95％一致性的肽、其保守取代的变异体、其修饰肽(即，该肽经修饰包含一种或多种末端修饰以及促进连接的修饰)及其组合组成组的氨基酸组成的组。
提供下列实施例是为了进一步阐述本发明的某些方面而不是为而来限制本发明。
实施例1
本实施例中示出的是多种用于利用噬菌体展示技术生成对本发明所述纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽的方法。本发明所述涂布组合物中多种包含结合区的肽(即，对植入物表面具有亲和性的肽和对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽)最初利用噬菌体展示技术开发，随后通过肽设计和肽合成而改善结合特征。
噬菌体筛查和选择
噬菌体展示技术在本领域中已为人熟知，可用来尝试鉴定对筛查中所用特定靶底物具有亲和性的噬菌体展示肽。通常，利用噬菌体展示，可提供针对靶底物的多种肽文库，且可选择特异性结合该底物的肽，用作结合区。可采用多轮系列选择(称为“筛选”)。如本领域中已知的，多种文库和筛选(panning)方法中的任何一种均可用于实施噬菌体展示技术。筛选方法可包括例如液相筛选、固相筛选或基于细胞的筛选。一旦鉴定出候选结合区，则可采用序列的定向或随机突变来优化该结合区的结合特征(包括一种或多种亲和性和亲合力)。
例如，可在多个不同噬菌体展示文库中筛查结合已选定靶底物(例如，一种已选出来寻找本发明中非常有用的结合区的底物)的肽。根据所选出的底物，将该底物结合于容器或置于容器(96孔微滴定板的孔或微量离心管)中。容器表面上的非特异性结合位点用包含牛血清白蛋白(“BSA”；例如1％-10％)的缓冲液进行封闭。随后用容纳含TweenTM20的缓冲盐水(“缓冲液-T”)的缓冲液洗涤该容器5次。每一个文库均在缓冲液-T中稀释，并以1010pfu/ml的浓度共加入100μl。室温下以50rpm振荡孵育(1-3小时)后，通过用缓冲液T多次洗涤而除去未结合的噬菌体。随后已结合的噬菌体可用来在生长培养基中感染大肠杆菌细胞。该细胞和含噬菌体培养基通过以200rpm在振荡器中37℃过夜孵育。将培养物离心后，收集含噬菌体的上清液。利用前一轮中扩增的噬菌体作为输入物(input)，以类似于第一轮选择的方式进行第二轮和第三轮筛选。为了检测特异性结合已选出底物的噬菌体，利用轭合于检测分子的抗噬菌体抗体进行酶联免疫吸附(ELISA型)试验，随后对该试验中结合的检测分子检测并定量。然后测定该噬菌体中特异性结合已选出底物的肽的DNA序列；即编码该肽的序列作为插入子定位于噬菌体基因组中，且可经测序得到展示于噬菌体表面上的相应氨基酸序列。
作为一个特别的例证性实例，利用几种不同的噬菌体文库，将GDF用作实施噬菌体选择的底物。将GDF-7利用两种不同的方法包被用于噬菌体选择。在第一种方法中，采用溶于0.1M NaCO3中的GDF-7(4pmol/孔，每孔100μl)预涂布微滴定板的孔。在第二种方法中，采用抗GDF抗体(1ug/ml，每孔100μl)的缓冲液预包被微滴定板的孔，随后将GDF-7(4pmol/孔)加入抗体预包被的微滴定板孔中。预包被常常需在4℃过夜孵育，随后用缓冲液T洗涤几次。微滴定板孔表面内的非特异性结合位点用1％牛血清白蛋白(BSA)/0.1M NaCO3进行封闭。将该板在室温下以50rpm振荡孵育1小时。随后将孔用300μl缓冲液T洗涤5次。
每一个文库均用含1％BSA的高盐(0.5M NaCl)缓冲液T进行稀释，并以1010pfu/ml的浓度加入微滴定板的每一个孔内，每孔100μl。室温下以50rpm振荡孵育2小时后，用缓冲液T洗涤5次除去未结合的噬菌体。将该噬菌体加入2xYT培养基中对噬菌体感染敏感的大肠杆菌细胞中，将噬菌体感染的细胞转移至含2xYT培养基的新管中并在振荡培养箱中37℃过夜孵育。以8500g离心10分钟收集噬菌体上清液。利用前一轮中扩增的噬菌体作为输入物(input)，以类似于第一轮选择的方式进行第二轮和第三轮筛选。每一轮选择均利用ELISA样试验和噬菌体滴定监测GDF-7结合肽的富集程度。将表现出噬菌体(其展示结合于GDF-7的肽)富集的文库铺种于大肠杆菌细胞的菌苔上，挑取单个噬菌斑并通过ELISA试验测定对纤维结缔组织诱导性生长因子的结合。对于ELISA，利用本文中描述的方法，将GDF直接包被或通过已吸附抗体包被于微滴定板的孔表面上。将噬菌体(25μl噬菌体稀释液)与75μl含1％BSA的高盐缓冲液T一起加入孔内，随后在室温下孵育1小时。用缓冲液T洗涤几次后，加入轭合于辣根过氧化物酶的抗M13噬菌体抗体，随后加入生色剂ABT(2，2’-联氮-双(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸))，20分钟后测定405nm处的读数。每一孔得到的吸光度值与结合于GDF-7的噬菌体量相关。
采用针对插入位点两侧噬菌体载体序列的引物来测定编码每一组中用于噬菌体的肽的DNA序列。编码肽插入子的序列翻译后得到噬菌体表面上展示的相应氨基酸序列。测定利用GDF-7所分离肽的DNA序列并示于表1中。尽管通常这些与所展示肽相邻的噬菌体氨基酸对该肽的亲和性无显著性贡献，根据本发明所述肽的氨基酸序列中，其N末端和C末端还可包括这些与该肽相邻的噬菌体氨基酸(例如，表1中标为ss和sr)。
表1.通过利用GDF-7的噬菌体选择而分离的肽序列
  SEQ ID NO：   氨基酸序列
  1   ssGPREIWDSLVGVVNPGWsr
  2   ssGGVGGWALFETLRGKEVsr
  3   ssVAEWALRSWEGMRVGEAsr
  4   ssWEETGWRDFNSLRGREVsr
  5   SREAHVGWGVFEALQGVTVsr
  6   ssVGWDEFMSLRGVEKGWsr
  7   ssPSWDQFQSLVGVPTWAAsr
  8   ssGLLGGWSGLQGVELWS Ssr
根据通过噬菌体选择在包被的GDF-7上所鉴定肽的氨基酸序列进行比对，构建了一个共有氨基酸序列(SEQ ID NO：9)，如下：SEQ ID NO：9：X1XaaXaaX2X3X4X5X6X7XaaX8，其中Xaa是任何氨基酸；X1是W、R或L；X2是F或W；X3是E、D、N、M、Q或S；X4是S、T、G或A；X5是L或M；X6是R、Q或V；X7是G或V；X8是E、V、T或P。
SEQ ID NO：10：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中X1是W、R或L；X2是A、E或R；X3是L、I或S；X4是F或W；X5是E、D、N、M、Q或S；X6是S、T、G或A；X7是L或M；X8是R、Q或V；X9是G或V；X10是K、R、V或G；X11是E、V、T或P。
SEQ ID NO：11：X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11，其中X1是W、R或L，优选W；X2是A、E或R；X3是L、I或S；X4是F或W；X5是E或D；X6是S、T或G；X7是L或M；X8是R或V；X9是G或V；X10是K、V或G；X11是E或V。利用该共有序列，共有肽可包含基本由WXXFE(S/T)LXGXEX(SEQ ID NO：12)组成的氨基酸序列，其中X是任何氨基酸。
因此，本文提供了一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的分离肽，该肽包含选自由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11组成的组的共有氨基酸序列、包含对SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11进行多达2个氨基酸添加、缺失或置换(SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的“取代的变异体”)的氨基酸序列、其包含一种或多种末端修饰以及一种促进肽连接的修饰的修饰氨基酸序列。因此，这种肽具有的氨基酸序列可选自由SEQ ID NOs：1-8、12、73、74和75组成的组。优选的，本发明所述肽可具有对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性，对GDF-7的相对亲和性由低于1μM较优选低于100nM的EC50表示。在一个优选实施方式中，所述取代的变异体与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中任何一种具有至少90％的一致性。
实施例2
在该实施例中，进一步示出了对本发明所述肽的鉴定。本发明所述肽可利用本领域中熟练技术人员已知的任何方法合成，包括但不限于固相合成、液相合成、线性合成及其组合。在该实施例中，肽利用标准的固相肽合成技术在利用标准Fmoc化学的肽合成仪上进行合成。所有残基均偶联后，通过用复合三氟醋酸(TFA)进行处理，同时进行切割和侧链去保护。粗制肽用冷乙醚进行沉淀，并通过利用线性水/含0.1％TFA的乙腈梯度的高效液相色谱法(HPLC)加以纯化。合成肽的均质性利用分析性反相-HPLC进行评价，肽的特性(identity)则用质谱法进行确认。
亲和性鉴定
本发明所述代表性肽对纤维结缔组织诱导性生长因子的相对亲和性通过测定肽的系列稀释液对纤维结缔组织诱导性生长因子的结合而测定。针对每一种 肽序列的浓度范围，对所观察到的吸光度进行绘图，得到该肽对纤维结缔组织诱导性生长因子的结合曲线，从中可确定EC50(即，该结合曲线中可产生最大信号50％的肽浓度)。优选以EC50小于或等于约1μM较优选纳摩尔范围(例如＜100nM)的亲和性结合纤维结缔组织诱导性生长因子的肽。因此，在一个优选实施方式中，在本发明所述方法和组合物中，优选的肽表现出对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性为EC50小于或等于约1μM，较优选＜100nM。对纤维结缔组织诱导性生长因子的典型结合试验可按照下列步骤实施。
简单而言，包含SEQ ID NOs：1-3中每一种氨基酸序列的肽经生物素化可促进在抗生蛋白链菌素涂布的96孔板上进行包被。微滴定板通过加入50μl 10ug/ml的抗生蛋白链菌素/0.1M NaHCO3溶液而用抗生蛋白链菌素进行涂布，并孵育至少3小时。该板的孔通过加入150μl的1％BSA/0.1MNaHCO3溶液进行封闭，并将板储存于4℃直至使用。使用前，在缓冲液T中彻底洗涤，随后每孔加入20pmol肽(溶于含500mM的100μl高盐缓冲液T中)，随后在室温下通过振荡孵育1小时。加入150μl的0.5mM生物素(溶于水)封闭残余的抗生蛋白链菌素位点，并将板再孵育1小时。随后用TBS-T洗涤板，以去除过量生物素和肽。向每一个孔中加入生长因子(包括纤维结缔组织诱导性生长因子GDF-7、GDF-5、BMP-2和BMP-6；以及除纤维结缔组织诱导性生长因子之外的生长因子，如BMP-5、TGF-β1、TGF-β3或PDGF-BB)的系列稀释液(溶于高盐缓冲液T)，浓度范围在0.01nM与100nM之间。板在室温下振荡孵育1小时，然后用TBS-T洗涤几次。生长因子随后利用100ul恰当稀释的针对该生长因子的特异性第一抗体进行检测。用缓冲液T洗涤后，每孔均加入100μl碱性磷酸酶轭合的第二抗体，并在室温下孵育45分钟。过量第二抗体通过用缓冲液T反复洗涤而除去，孔中残留的碱性磷酸酶的量利用pNPP(磷酸对硝基苯酯)酶显色定量分析进行检测。该肽所捕获生长因子的量通过测定碱性磷酸酶反应的有色产物在405nm处的吸光度而测定。测定每一种肽相对于多种生长因子的亲和性EC50，如表2中所示。
表2
  生长因子  SEQ ID O：1EC50   SEQ ID NO：2EC50   SEQ ID NO：3EC50
  GDF-7   ＜1nM   ＜1nM   ＜1nM
  GDF-5   ＜10nM   ＜10nM   ＜10Nm
  BMP-2   ＜10nM   ＜10nM   ＜10nM
  BMP-6   ＜10nM   ＜10nM   ＜10nM
  BMP-5   ＜100nM   ＜100nM   ＜100nM
  TGF-β1   ndb   ndb   ndb
  TGF-β3   ndb   ndb   ndb
  PDGF-BB   ndb   ndb   ndb
ndb-无可检测到的结合(例如，相对于阴性对照和试验背景)。
因为认为GDF也是BMP蛋白家族的成员，因此共有显著的氨基酸序列同源性，且注意到本发明所述肽与BMP-5具有某些结合方面的交叉反应性。然而，表2中列出的所有生长因子均属于TGF-β超家族，因此共有序列同源性；然而，本发明所述肽主要表现为对纤维结缔组织诱导性诱导性生长因子而非TGF-β超家族中其他除BMP/GDF生长因子家族成员的亲和性。我们实施了进一步的结合研究，从中测定了本发明所述肽对不同生长因子的结合优先性。对于具有氨基酸序列SEQ ID NOs：1或3的肽，亲和优先性(相对亲和性从最高到最低)如下：GDF-7＞GDF-5、BMP-2＞BMP-6＞BMP-5＞TGF-β1、TGF-β3或PDGF-BB(后3种未对该肽表现出可检测性结合)。对于具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的肽，则亲和优先性如下：GDF-7＞GDF-5、BMP-2和BMP-6＞BMP-5＞TGF-β1、TGF-β3或PDGF-BB(相比于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：，3该肽对后3种生长因子未表现出可检测性结合，但对GDF-7则表现出比BMP-2、BMP-6和GDF-5中任何一种都显著较高的结合)。因此，本发明所述肽表现出对GDF-7的优先结合，且表现出对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性。
实施竞争性实验来确定具有氨基酸序列SEQ ID NOs：1、2和3的肽是否在相似或重叠位点结合GDF-7。如上所述实施结合试验，其中所包被的肽为SEQ ID NOs：1、2或3的其中一种；但除了加入GDF-7，还以过量达所包被肽1000倍的摩尔浓度向反应溶液中加入竞争肽(SEQ ID NOs：1、2或3的其中一种)。如果相比于所包被的肽，该竞争肽以高亲和性在GDF-7上的相似位点结合GDF-7，则将需要相对较低浓度的竞争肽来抑制GDF-7与所包被肽的结合。根据这些研究，可显示具有氨基酸序列SEQ ID NOs：1、2和3的肽具有GDF-7上的相似结合位点。
实施例3
表3示出了对植入物表面材料具有亲和性的示例性肽(“表面结合肽”)。例如，表面结合肽包括具有表面结合区且对包括但不限于例如聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚乙醇酸、聚碳酸盐、尼龙、
Figure GPA00001043248600231
聚乙烯对苯二甲酸酯纤维和基于胶原的底物等材料具有亲和性的肽。示例性的表面结合肽包括SEQ ID NOs：13-71。在某些实施方式中，在生成本发明所述组合物时，可将至少一种表面结合肽偶联于至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。
表3
Figure GPA00001043248600241
实施例4
该实施例示出了一种制备本发明所述组合物的方法，包括将至少一种对植入物表面材料具有亲和性的肽与至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽偶联在一起。形成本发明所述用于涂布植入物的组合物时，利用本文中描述的方法以及本领域中熟知的将两种分子偶联在一起(直接或通过使用连接物)的方法，例如，可将对植入物表面具有亲和性的肽偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。对于本领域中熟练技术人员来说很明显的，用于偶联或连接两种分子的优先方法将随每一种分子上存在的反应官能团而有所不同。如本领域中熟练技术人员所知，可用于共价偶联的反应性官能团所包含的化学基团可选自由马来酰亚胺、硫醇、羧基、氢、磷酰基、酰基、羟基、乙酰基、醛、疏水的、胺、氨基、丹酰、巯基、琥珀酰亚胺(包括但不限于琥珀酰亚胺酯或琥珀酰亚胺碳酸酯)、卤素、硫醇-反应性化学基团、胺反应性化学基团、羧基反应性化学基团、羟基反应性化学基团及其组合组成的组。
为了说明该实施方式，采用连接物来偶联对植入物表面具有亲和性的肽和对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。因为多种市售缝线均由编织的聚乙烯对苯二甲酸酯纤维构成，且包含氨基酸序列SEQ IDNO：67的肽对该缝合材料(例如，植入物的表面材料)具有亲和性，因此选择该肽作为代表性表面结合肽，包含入内作为本发明所述组合物中的一个组分。类似的，具有氨基酸序列SEQ ID NOs：1-3的肽也可单独作为对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的代表性肽，且包含入内作为本发明所述组合物中的一个组分。
利用用于肽合成的标准方法，合成包含SEQ ID NO：1-3和SEQ IDNOs：67的氨基酸序列，以在C末端包含一个氨基酸连接序列(例如，GSSGK，SEQ ID NO：72)，其中生物素连接于C末端(借助于赖氨酸残基)。参见例如SEQ ID NOs：73-76。将抗生蛋白链菌素(具有4个生物素结合位点)与生物素在生物素化肽上一起应用，可形成该两种不同肽组分之间的连接物。尽管多种摩尔比均可成功应用，但在一个示例性实例中，表面结合肽与对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽之间以2∶1的摩尔比用于该偶联反应中。因此，将1416pmol表面结合肽与708pmol对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽在30μl H2O中混合，将30μl1mg/ml的抗生蛋白链菌素储存液加入该混合物中，并将其在室温下孵育10分钟。随后该反应混合物在冰上冷却达45分钟。为了封闭抗生蛋白链菌素上任何未占据的生物素结合位点，将0.5mM生物素/440μl高盐缓冲液T加入反应混合物中。这样，可形成本发明所述组合物，包含至少一种表面结合肽，而其偶联于至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。
在该实施例中，通过使植入物与组合物(例如，将该植入物浸于包含该组合物的溶液中)接触达足够长的时间，而将本发明所述组合物施予该植入物，实现该组合物与该植入物的结合。将由聚乙烯对苯二甲酸酯纤维构成的商品化缝线切成0.5cm的长度，并置于96孔板的孔内。随后在高盐缓冲液T中用1％BSA室温封闭这些孔达30分钟。用作实验阴性对照(“对照轭合物”)的肽轭合物通过将生物素化表面结合肽结合于抗生蛋白链菌素而制备(即，不包含对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽)。
本发明所述三种代表性组合物中的每一种均以不同浓度(从该组合物的终浓度为100nM；0.5μM的轭合物开始)分别与高盐缓冲液T一起加入各个包含缝线且包含GDF-7的孔中，并在室温下孵育1小时。该缝线随后用高盐溶液T洗涤几次，利用抗GDF-7的抗体-第二抗体-AP轭合物通过利用pNPP酶显色定量分析进行检测，而实施定位并存留于缝线上的GDF-7检测。该肽轭合物，如阴性对照所预期的，对GDF-7未表现出可估计的结合(例如，相对于分析背景而言)。对所述三种代表性组合物中每一种均生成一条结合曲线，用于测定EC50值，作为每一种代表性组合物对GDF-7亲和性的一个衡量标准，尽管所述反应性组合物结合于植入物(例如，缝线)。从该结合曲线，该三种代表性组合物中的每一种(每一种均已固定于植入物表面上)均展示出对GDF-7的亲和性，EC50低于10nM。用于结合试验的条件可以变化，包括足以使最大量GDF-7结合于本发明所述已固定于植入物表面上的组合物的时间。可以确定，在这些实验中，生长因子与组合物的最大结合发生在最初几分钟内(例如，在5-10分钟的时间内)，且与植入物接触达1小时的时间内，似乎不再有更多的GDF-7存留于植入物表面上。这些以及其他数据表明，在将本发明所述组合物施予植入物表面时，足以将组合物结合于该植入物(以及将纤维结缔组织诱导性生长因子结合于该组合物)的时间可包括使该植入物与组合物接触(或者使组合物与纤维结缔组织诱导性生长因子接触)最少几分钟。
为了测定本发明所述组合物在植入物表面上的存留，采用一种利用标准Western印迹技术的方法检测GDF-7。将GDF-7结合于本发明所述组合物(包括一种含氨基酸序列SEQ ID NO：67的表面结合肽，其偶联于一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽，其包含氨基酸序列SEQ IDNO：2)，随后使该组合物在微量离心管中与缝线接触并施予缝线，如本文之前所述。随后在存在100％人血浆的情况下，孵育缝线达0、1、3或6天。在恰当的时间点，去除管中的血浆，简单洗涤缝线，加入凝胶电泳样品缓冲液，并将缝线在样品缓冲液中煮沸以洗脱任何借助该组合物结合于缝线的GDF。样品利用标准凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳，随后通过电印迹转移至膜上。采用抗GDF-7抗体和第二抗体与碱性磷酸酶(AP)的轭合物以及随后的显色，利用标准的Western印迹技术检测GDF-7。该试验中还包括已知的GDF量(例如，100ng、50ng、25ng、12.5ng)，这使得可利用Western印迹的密度分析构建标准曲线。除了前述利用肽抗生蛋白链菌素轭合物测定缝线上GDF-7存留的实验之外，还可利用用于肽合成的标准方法合成表面结合肽(SEQ ID NO：71)以及其共价结合的对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽(SEQ ID NO：2)。GDF-7存留实验(retentionexperiment)可类似于包含共价连接结合区的肽而实施，仅做了极小的修改。
利用该试验，超过50ng/cm GDF-7可通过肽与抗生蛋白链菌素的轭合物而存留，而利用共价连接的肽组合物则有超过80ng/cm的GDF-7存留，且最初固定于所孵育的缝线上。与第0天相比，到第3天时，抗生蛋白链菌素轭合物释放出最初结合于缝线上GDF-7中的约一半，到第6天时，则释放出最初结合于缝线上GDF-7中的约三分之二。到第4天时，共价肽组合物即释放出最初结合于缝线上GDF-7中的约三分之二。因此，通过该实施例，可表明纤维结缔组织诱导性生长因子借助于本发明所述组合物在植入物表面上的存留和定位，以及纤维结缔组织诱导性生长因子从结合于该植入物(其定位于该植入物)的组合物缓慢释放。此外，还表明生物学相关量的纤维结缔组织诱导性生长因子通过本发明所述组合物存留于植入物表面(据报道，对于缝线而言，估计用于诱导肌腱组织愈合的纤维结缔组织诱导性生长因子的生物学有效浓度为约40ng/cm)。另外，实验数据表面相当量的本发明所述组合物(包括已结合的纤维结缔组织诱导性生长因子)可持续偶联于缝线表面，即使在缝线穿过肌腱组织几次之后。
实施例5
在该实施例中，进一步阐释用于将本发明所述组合物施予植入物的方法。该方法包括使组合物与所述将该组合物施予其的至少一种植入物表面(例如，将用组合物涂布的表面)与一定量可有效促进纤维结缔组织形成的组合物相接触(例如，通过在植入物部位释放纤维结缔组织诱导性生长因子)。该组合物的有效量可由医师通过考虑如下因素而确定，包括但不限于：待递送纤维结缔组织诱导性生长因子的类型，待治疗、修复、缓解的纤维结缔组织病症或指征，组织损伤区域的大小，植入物大小，植入物类型以及希望形成的纤维结缔组织量。利用本领域中已知的方法，还可根据利用本发明所述组合物的临床前研究和临床研究结果确定有效剂量。由本发明组合物所诱导纤维结缔组织形成的过程或评估可通过本领域中已知的方法进行监测，例如多种成像技术(例如，X线、计算机辅助的断层技术(CAT扫描)、磁共振成像(MRI)、关节镜检查)。
该组合物可施予植入物，其中该组合物包含在施予所述植入物时已结合于该组合物的纤维结缔组织诱导性生长因子。在另一个实施方式中，当该组合物施予植入物时，对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽尚未结合于纤维结缔组织诱导性生长因子。关于后一种情况，随后在进一步的涂布步骤中，在适于纤维结缔组织诱导性生长因子结合于已结合于植入物表面的组合物的条件下使其上已施予组合物的表面材料与足够量的纤维结缔组织诱导性生长因子相接触(体外或体内)。在一个实例中，将本发明所述组合物施予植入物，随后将该植入物定位于正常位置。
在另一个实例中，将本发明所述组合物施予正常位置的植入物。例如，如果该植入物通过身体的开放部位暴露(例如，在手术过程中)，则医师可通过喷雾或其他方式将该组合物施予正常位置的植入物。在另一个实例中，如果植入物不易于通过诸如喷雾涂层而施予，本发明所述组合物可通过在植入物部位注射而给予，从而使该组合物与植入物相接触。为了便于组合物的注射，该组合物进一步包含一种药物可受载体。可采用本领域中已知的方便过程将本发明所述涂布组合物施予一种或多种待涂布的表面(使涂布组合物与所述一种或多种表面相接触时)。根据待涂布植入物的性质，已知这种过程包括但不限于浸透、混合、泡入、刷涂、喷雾和气相淀积。例如，包含所述涂布组合物的溶液或悬液可通过喷雾装置的喷管施予，从而得到可涂布将涂布植入物表面的液滴。将所涂布植入物干燥，随后在使用前进一步处理(例如，在溶液(如水或等张缓冲液)中洗涤除去过量涂布组合物；如果用于体内用途，通过利用本领域中用于消毒聚合物的方法中任何一种进行消毒；等等)。可替代的，涂布过程之前，所述涂布组合物和植入物各自均进行消毒，且施予过程在无菌条件下进行。
在另一种用于将涂布组合物施予待涂布植入物一个或多个表面的过程中，将植入物表面泡入包含涂布组合物(其量可有效涂布该植入物)的液体(例如，溶液或悬液，含水或溶剂)中。例如，将该表面泡入或浸入含所述组合物的水浴中。用于施予该涂布组合物的恰当条件包括使待涂布表面与包含涂布组合物的液体在恰当温度(例如，从10℃至约50℃；较优选的，从室温至37℃)持续接触恰当时间(例如，从约5分钟至约12小时；较优选的，从约5分钟至约60分钟)。如应用所必需的，随后可对所涂布植入物进一步处理(例如，洗涤、消毒等)。这些用于将涂布组合物施予植入物的示例性过程并非专有的，因为其他涂布和消毒方法也可采用(如本领域中的熟练技术人员将能够选择可符合特定植入物和目标需求的组合物和方法)。
此外，在一种根据本发明所述的方法中，植入物表面上包含该涂布组合物的涂层可通过例如空气干燥而消毒。然而，这些处理并非专有的，其他涂布和稳定方法也可采用。恰当的涂布和稳定方法在本领域中已经为人所知。例如，将利用本发明所述涂布组合物进行涂布的所述至少一个植入物表面可在涂布步骤前进行预处理以增强以下一种或多种：具有亲和性的肽与待涂布表面材料的结合；以及涂层的连贯性和均一性。
实施例6
在该实施例中，合成本发明所述包含对植入物表面材料具有亲和性的肽(偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽)的肽组合物，包含一种或多种脂肪酸末端修饰、脂肪酸连接物、PEG连接物以及氨基酸连接物。本发明所述示例性肽以及根据本发明所述方法合成的肽均示于表4中。这些化合物均以线性序列列出，其中“AUD”表示氨基十一烷酸；“MYR”表示肉豆蔻酸；“Ahx”表示含氨基己酸的脂肪酸；“B”表示生物素；“NH2”表示已酰胺化的修饰C末端氨基酸。偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽且对植入物表面材料具有亲和性的肽C末端进一步包含生物素化连接物，以利于功能研究中的检测。
表4
  肽编号   肽线性序列
  710P   SEQ ID NO：2-(AUD)6-SEQ ID NO：71-GSSGK-B-NH2
  720P   SEQ ID NO：71-(AUD)6-SEQ ID NO：2-GSSGK-B-NH2
  730P   (AUD)4-SEQ ID NQ：2-(MP)2-SEQ ID NO：71-GSSGK-B-NH2
  740P   MYR-Ahx-SEQ ID NO：2-(MP)2-SEQ ID NO：71-GSSGK-B-NH2
  750P   SEQ ID NO：71-(MP)2-SEQ ID NO：2-GSSGK-B-NH2
  760P   SEQ ID NO：2-(MP)2-SEQ ID NO：71-GSSGK-B-NH2
  770P   SEQ ID NO：2-P10-SEQ ID NO：71-GSSGK-B-NH2
  780P   SEQ ID NO：67-GSSG-SEQ ID NO：2-GSSGK-B-NH2
  790P   SEQ ID NO：2-GSSG-SEQ ID NO：67-GSSGK-B-NH2
  800P   SEQ ID NO：2-(MP)2-SEQ IDNO：67-GSSGK-B-NH2
  810P   SEQ ID NO：2-P1O-SEQ ID NO：67-GSSGK-B-NH2
  820P   SEQ ID NO：2-(AUD)6-SEQ ID NO：67-GSSGK-B-NH2
  830P   SEQ ID NO：2-GSSG-SEQ ID NO：71-GSSGK-B-NH2
下列首字母缩略词在本文中用来描述用于制备本发明所述化合物的方法中。Mtt是4-甲基三苯甲基；TATU是2-(7-Aza-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐；DIEA是二异丙基乙胺；NMP是1-甲基-2-吡咯(烷)酮；DCM是二氯甲烷；DMF是二甲基酰胺；TFA是三氟醋酸；TIS是三异丙基硅烷；TBTU是O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐；HOBt是O-Pfp酯/1-羟基苯并三唑；NMM是N-甲基吗啉；RP-HPLC是反相高效液相色谱；Fmoc是9-芴甲氧羰基；tBU是t-丁酰；mini-PEG是Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸；MALDI-TOF是基质辅助的激解吸电离-飞行时间质谱；试剂A是水/TFA(0.1％TFA)；试剂B是乙腈/TFA(0.1％TFA)；Fmoc-PAL-PEG树脂是[5-(4-Fmoc-氨甲基-3，5-二甲氧基苯基)戊酸]-聚乙二醇-聚苯乙烯树脂。
利用AA/TBTU/HOBt/NMM(1∶1∶1∶2)作为偶联剂的标准Fmoc/t-Bu化学可用来合成示例性肽740P。基础树脂，Fmoc-PAL-PEG-PS(～0.20mmol/g)用于合成包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列，随后是两个mini-PEG连接物，随后是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。合成循环中采用5倍过量的氨基酸，且所有残基均为双重或三重偶联。偶联反应通过凯泽茚三酮试验(Kaiserninhydrin test)或绿醌试验(chloranil test)进行监测。为了抑制肽聚集，采用假脯氨酸肽Fmoc-Ser-Ser(PsiMe，Me pro)-OH，并以5倍过量进行双重偶联。Fmoc-Lys(生物素)-OH和Fmoc-Mini-PEG-CO2H利用上述偶联条件进行手工双重偶联。Fmoc去保护反应利用20％哌啶在含0.1M HOBt的DMF中实施。将氨基己酸(Ahx)引入树脂结合肽的N末端，随后利用TBTU活化法进行肉豆蔻酸的双偶联。
室温下，利用试剂K(TFA∶EDT∶H2O∶酚∶苯甲硫醚＝82.5∶2.5∶5∶5∶5)将该化合物从树脂切割达4小时。粗制产物在冷醚中沉淀。离心后得到的沉淀用冷醚洗涤两次，并低压冻干得到白色固体即粗制肽。粗制线性肽利用3％DMSO在10mM PBS(pH7.4)缓冲液环化48小时(肽浓度～0.065-0.075mM)。将粗制环化肽在RP-HPLC柱(C18；250x21.2mm)上利用流动洗脱剂(A＝HO/TFA(0.1％TFA)，B＝乙腈/TFA(0.1％TFA))采用15％B至55％B的梯度以10Ml/min@220nm进行纯化。收集包含所需产物的馏分，并低压冻干得到一种松散的白色粉末，并用MALDI-TOF分析确认所需产物。
利用与本文中肽740P所述类似的方法和试剂，合成肽NOs：710P-830P。
实施例7
缝线上的GDF-7捕获
实施下列步骤检测本发明所述示例性肽组合物捕获缝线上GDF-7的能力，所述肽组合物包含对植入物表面材料具有亲和性的肽，而其偶联于对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。实施例6中描述的肽组合物(SEQ ID NOS：710P-830P)如下进行检测。用保险刀片将ETHIBONDEXCEL 1缝线(ETHICON)切成0.5cm长的段，并置于96孔聚丙烯板的孔内。该板用1％BSA/TBS(高盐)室温振荡1小时而封闭。在TBST高盐中制备1μM肽组合物并按照100μl/孔/缝线加入将该肽溶液，板在室温下振荡孵育30min。该板用250μl TBST高盐手工洗涤4次。在TBST高盐中将GDF-7(R&D SYSTEMS)溶液制备成50nM的浓度，并以1∶4系列稀释加入96孔板中，浓度范围为0.01nM-50nM。该板室温振荡孵育1小时并用250μl TBST高盐手工洗涤4次。GDF-7用抗GDF-7的抗体-第二抗体-AP轭合物通过利用pNPP酶显色定量分析进行检测。测定通过肽组合物捕获GDF的相对EC50值。EC50值总结于图2中。
实施例8
对于本领域中熟练技术人员来说，很显然，可根据本发明所述肽(包含对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的氨基酸序列)的氨基酸序列来合成或构建编码该肽(或如本文所述的其变异体)的多核苷酸(核酸分子)，且可通过采用重组DNA技术作为一种制备方式(例如，在缝线中)和/或通过体内引入这种多核苷酸进行体内生成而得到这种肽。例如，对于本领域中熟练技术人员来说，很显然，一种以上多核苷酸序列可编码本发明所述的肽，且这些多核苷酸可根据已知编码该肽氨基酸的三联密码子、第三碱基简并性和选择无细胞表达系统或宿主细胞(通常为原核细胞或真核细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌细胞；酵母菌细胞；哺乳动物细胞；禽类细胞；两栖动物细胞；植物细胞；鱼类细胞和昆虫细胞；位于体外或体内，希望在这些细胞中进行表达)偏向的三联密码子选择而合成。对于本领域中的熟练技术人员来说，生成上述简并变异体，例如，以优化用于特定宿主的密码子表达(例如，将细菌mRNA中的密码子更改为哺乳动物、植物或其他细菌宿主如大肠杆菌偏向的密码子)是常规的。
出于说明而非限制的目的，本文提供了SEQ ID NOs：77-79，其为编码氨基酸序列SEQ ID NOs：1、2和3的多核苷酸，对于本领域熟练技术人员来说，很显然，分别来自这些多核苷酸的密码子选择通常将适用于编码本发明所述对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽的多核苷酸。因此，例如，利用SEQ ID NO：77并结合(in relation to)SEQ ID NO：1，本领域中的熟练技术人员可易于构建编码SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列的变异体的多核苷酸，或推论编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多核苷酸序列。在本发明的一个优选实施方式中，编码对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性肽的氨基酸序列的多核苷酸包括的核酸分子所编码的肽基本由对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽的氨基酸序列组成，或由与对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性肽的氨基酸序列具有至少95％一致性(较优选的，至少90％一致性)的氨基酸序列组成，只要所编码的肽对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性。
在一种示例性实施方式中，提供了一种重组载体，其包含的多核苷酸编码按照本发明所述而应用且对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽；且提供了所述重组生成对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽的用途。在一个实例中，该多核苷酸可加入本领域中已知的无细胞表达系统用于生成肽或多肽。在另一个实例中，该多核苷酸可定位于于表达载体内，使得当宿主细胞中生成该肽时，其作为一种与其他氨基酸序列(例如，其有助于该肽的纯化；或重组性偶联于表面结合区)的融合蛋白或作为该肽的多拷贝或多联体而得到。例如，已有一些序列为本领域中的熟练技术人员所知，作为含需表达肽的融合蛋白的一部分，其促进在用于表达的原核细胞胞浆内生成包涵体和/或有助于纯化包含该序列的融合蛋白。包涵体可通过本领域中已知的方法与其他原核细胞组分分离，包括变性剂以及分部分离(例如，离心、柱层析等)。在另一个实例中，存在一些商品化载体，其中可插入将表达为蛋白或肽的所需感兴趣核酸序列，这样一旦表达，即可利用本领域中的标准方法实现基因产物的纯化。
对于本领域中的熟练技术人员来说，很显然，可将编码本发明所述对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽的核酸序列插入核酸分子中，包括质粒或除质粒之外的载体；并成为其一部分。还可采用其他表达系统，包括但不限于用噬菌体载体转染的细菌或粘粒DNA；包含酵母的酵母载体；包含真菌的真菌载体；感染病毒(例如杆状病毒)的昆虫细胞系；以及已引入(例如转染或电击穿孔)质粒或病毒表达系统或者已感染重组病毒(例如，痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒等)的哺乳动物细胞系。肽的成功表达需要包括该肽编码序列的重组核酸分子或载体本身包含转录和翻译所必需的控制元件，其与用于表达的特定宿主系统相容并被其识别。
利用分子生物学领域中已知的方法，包括上述方法，可将多种启动子和增强子整合入载体内或包含编码序列的重组核酸分子内，以增加肽的表达，只要该肽的表达增加与所采用的特定宿主系统相容(例如，对其无毒性)。对本领域熟练技术人员来说，很显然，选择启动子将依赖于所采用的表达系统。启动子的强度即促进转录的能力有所不同。通常，为了表达已克隆基因，需要采用较强启动子以获得该基因的高水平转录及表达为基因产物。例如，本领域中已知的细菌、噬菌体或质粒启动子(从其已观察到宿主细胞系统包括大肠杆菌中的高水平转录)包括lac启动子、trp启动子、T7启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、P.sub.R和P.sub.L启动子、lacUV5、ompF、bla、lpp等，可用来提供编码合成肽的插入核苷酸序列的转录。用于哺乳动物表达系统的表达载体中通常采用的哺乳动物启动子是来自哺乳动物病毒基因的启动子。实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子以及CMV启动子。
如果在某些情况下肽的表达对宿主细胞是致死性的或有害的，则可选择该宿主细胞株/系和表达系统，使得该启动子的活化被抑制直至被特异性诱导。例如，在某些操纵子中，加入特殊诱导子对于高效转录所插入DNA是必需的(例如，lac操纵子可通过加入乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(“IPTG”)而诱导；当生长培养基中缺乏色氨酸时，trp操纵子被诱导；而四环素可用于具有tet敏感性启动子的哺乳动物表达载体中)。因此，通过在控制编码序列表达的启动子不被诱导的条件下培养转化或转染细胞而延缓该肽表达，而当生长培养基中的细胞达到合适密度时，可诱导该启动子用于该编码序列的表达。本领域中熟知的其他用于高效基因转录或信使翻译的控制元件包括增强子、转录或翻译起始信号、转录终止和多腺苷酸化序列，等等。
实施例9
在该实施例中，示出了一个包含本发明所述组合物的试剂盒。该试剂盒的组成部分可包括一个容纳组合物的容器，而该组合物包含至少一种对植入物表面材料具有亲和性的肽，其已偶联于至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。可选的，该组合物可包括所述已结合于纤维结缔组织诱导性生长因子的对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。优选的容器类型是瓶，例如那些通常用于药剂溶液或冻干粉末、药用的、药物、贴片等的容器。
可替代的，该试剂盒中的一个组成部分可以为容纳纤维结缔组织诱导性诱导性生长因子的第一容器以及容纳组合物的第二容器，该组合物包含至少一种对植入物表面材料具有亲和性的肽，而该肽已偶联于至少一种对纤维结缔组织诱导性生长因子具有亲和性的肽。因此，可在将该组合物施予植入物表面的步骤中将所述纤维结缔组织诱导性生长因子加入本发明所述组合物中，而非作为包含纤维结缔组织诱导性生长因子的已完成组合物的一部分；或者可在将组合物施予植入物表面之前与本发明所述组合物混合。该试剂盒的其他组成部分可包括但不限于用于重溶(重建)的液体(一个或多个容纳可用来重溶试剂盒组成部分的稀释剂或液体，例如用于重溶本发明所述组合物和/或可包装为冻干或粉末形式的纤维结缔组织诱导性生长因子)；用于将该组合物施予植入物的供给装置(applicator device)(例如浸湿盘(soaking tray)、刷子、涂药器衬垫(applicator pad)、注射器、注射针头或其组合)、试剂盒使用说明书、将施予本发明所述组合物的植入物以及其组合。试剂盒包含的这些组成部分可包装在一起，例如在单个无菌容器中(例如，盒子、浅箱、小药袋或其他形式的便利包装)。该试剂盒还可包括多个独立包装的组成部分，而这些独立包装随后可容纳于单个较大容器中。为了用于医学领域或牙科领域，优选这些组成部分在包装或容器中进行消毒以使其可立即在无菌环境中应用。
为了说明，已对前文所述本发明的特殊实施方式进行了详细阐述。根据说明书和举例，本领域中的其他熟练技术人员可通过应用现有知识而方便的修改和/或改良本发明用于多种应用而不背离本发明的基本概念；因此，认为这些修改和/或改良也在附属权利要求的含义和范围内。
序列表
<110>本杰明·马库斯·比勒保罗·西奥多·汉密尔顿达莉亚·伊索尔德·祖米尼师库玛·阿布杰克森·奈尔陈玉琛
 
<120>用于将生长因子递送至纤维结缔组织的方法和组合物
 
<130>PL00016
 
<150>US 60/969748
<151>2007-09-04
 
<160>79
 
<170>PatentIn version 3.4
 
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>1
 
Ser Ser Gly Pro Arg Glu Ile Trp Asp Ser Leu Val Gly Val Val Asn
1               5                   10                  15
 
Pro Gly Trp Ser Arg
            20
 
<210>2
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>2
 
Ser Ser Gly Gly Val Gly Gly Trp Ala Leu Phe Glu Thr Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
 
Lys Glu Val Ser Arg
 
            20
<210>3
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>3
 
Ser Ser Val Ala Glu Trp Ala Leu Arg Ser Trp Glu Gly Met Arg Val
1               5                   10                  15
 
Gly Glu Ala Ser Arg
            20
 
<210>4
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>4
 
Ser Ser Trp Glu Glu Thr Gly Trp Arg Asp Phe Asn Ser Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
 
Arg Glu Val Ser Arg
            20
 
<210>5
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>5
Ser Arg Glu Ala His Val Gly Trp Gly Val Phe Glu Ala Leu Gln Gly
1               5                   10                   15
 
Val Thr Val Ser Arg
            20
 
<210>6
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>6
 
Ser Ser Val Gly Trp Asp Glu Phe Met Ser Leu Arg Gly Val Glu Lys
1               5                   10                  15
 
Lys Gly Trp Ser Arg
            20
 
<210>7
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>7
 
Ser Ser Pro Ser Trp Asp Gln Phe Gln Ser Leu Val Gly Val Pro Thr
1               5                   10                  15
 
Trp Ala Ala Ser Arg
            20
 
<210>8
<211>21
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>人工序列
 
<400>8
 
Ser Ser Gly Leu Leu Gly Gly Trp Ser Gly Leu Gln Gly Val Glu Leu
1               5                   10                  15
 
Trp Ser Ser Ser Arg
            20
 
<210>9
<211>11
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>X1是W，R或L；X2是任意氨基酸；X3是任意氨基酸；X4是F或W；X5是E，D，N，M，Q或S；X6是S，T，G或A；X7是L或M；X8是R，Q或V；X9是G或r V；X10是任意氨基酸；以及X11是E，V，T或P
 
<400>9
 
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
 
<210>10
<211>11
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>X1是W，R或L；X2是A，E或R；X3是L，I或S；X4是F或W；X5是E，D，N，M，Q或S；X6是S，T，G或A；X7是L或M；X8是R，Q或V；X9是G或V；X10是K，R，V或G；以及X11是E，V，T或P
 
<400>10
 
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
 
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>X1是W，R，或L，优选W；X2是A，E或R；X3是L，I或S；X4是F或W；X5是E或D；X6是S，T或G；X7是L或M；X8是R或V；X9是G或V；X10是K，V或G；以及X11是E或V
<400>11
 
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
 
<210>12
<211>12
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(12)
<223>X是任意氨基酸
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>X6是丝氨酸或苏氨酸
 
<400>12
 
Trp Xaa Xaa Phe Glu Xaa Leu Xaa Gly Xaa Glu Xaa
1               5                   10
 
<210>13
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>13
 
Phe Leu Ser Phe Val Phe Pro Ala Ser Ala Trp Gly Gly
1               5                   10
 
<210>14
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>14
 
Phe Tyr Met Pro Phe Gly Pro Thr Trp Trp Gln His Val
1               5                   10
 
<210>15
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>15
 
Leu Phe Ser Trp Phe Leu Pro Thr Asp Asn Tyr Pro Val
1               5                   10
 
<210>16
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>16
 
Phe Met Asp Ile Trp Ser Pro Trp His Leu Leu Gly Thr
1               5                   10
 
<210>17
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>17
 
Phe Ser Ser Leu Phe Phe Pro His Trp Pro Ala Gln Leu
1               5                   10
 
<210>18
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>18
 
Ser Cys Ala Met Ala Gln Trp Phe Cys Asp Arg Ala Glu Pro His His
1               5                   10                  15
 
Val Ile Ser
 
<210>19
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>19
 
Ser Cys Asn Met Ser His Leu Thr Gly Val Ser Leu Cys Asp Ser Leu
1               5                   10                  15
 
Ala Thr Ser
 
<210>20
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>20
 
Ser Cys Val Tyr Ser Phe Ile Asp Gly Ser Gly Cys Asn Ser His Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Ser
 
<210>21
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>21
 
Ser Cys Ser Gly Phe His Leu Leu Cys Glu Ser Arg Ser Met Gln Arg
1               5                   10                  15
 
Glu Leu Ser
 
<210>22
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>22
 
Ser Cys Gly Ile Leu Cys Ser Ala Phe Pro Phe Asn Asn His Gln Val
1               5                   10                  15
 
Gly Ala Ser
<210>23
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>23
Ser Cys Cys Ser Met Phe Phe Lys Asn Val Ser Tyr Val Gly Ala Ser
1               5                   10                  15
 
Asn Pro Ser
<210>24
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>24
 
Ser Cys Pro Ile Trp Lys Tyr Cys Asp Asp Tyr Ser Arg Ser Gly Ser
1               5                   10                  15
 
Ile Phe Ser
<210>25
<211>18
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>25
 
Ser Cys Leu Phe Asn Ser Met Lys Cys Leu Val Leu Ile Leu Cys Phe
1               5                   10                  15
 
Val Ser
<210>26
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>26
 
Ser Cys Tyr Val Asn Gly His Asn Ser Val Trp Val Val Val Phe Trp
1               5                   10                  15
 
Gly Val Ser
 
<210>27
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>27
 
Ser Cys Asp Phe Val Cys Asn Val Leu Phe Asn Val Asn His Gly Ser
1               5                   10                  15
 
Asn Met Ser
 
<210>28
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>28
 
Ser Cys Leu Asn Lys Phe Phe Val Leu Met Ser Val Gly Leu Arg Ser
1               5                   10                  15
 
Tyr Thr Ser
<210>29
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>29
 
Ser Cys Cys Asn His Asn Ser Thr Ser Val Lys Asp Val Gln Phe Pro
1               5                   10                  15
 
Thr Leu Ser
 
<210>30
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>30
 
Phe Phe Pro Ser Ser Trp Tyr Ser His Leu Gly Val Leu
1               5                   10
 
<210>31
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>31
 
Phe Phe Gly Phe Asp Val Tyr Asp Met Ser Asn Ala Leu
1               5                   10
 
<210>32
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>32
 
Leu Ser Phe Ser Asp Phe Tyr Phe Ser Glu Gly Ser Glu
1               5                   10
 
<210>33
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>33
 
Phe Ser Tyr Ser Val Ser Tyr Ala His Pro Glu Gly Leu
1               5                   10
 
<210>34
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>34
 
Leu Pro His Leu Ile Gln Tyr Arg Val Leu Leu Val Ser
1               5                   10
 
<210>35
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>35
 
Ser Cys Tyr Val Asn Gly His Asn Ser Val Trp Val Val Val Phe Trp
1               5                   10                  15
 
Gly Val Ser
 
<210>36
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>36
 
Ser Cys Asn Ser Phe Met Phe Ile Asn Gly Ser Phe Lys Glu Thr Gly
1               5                   10                  15
 
Gly Cys Ser
 
<210>37
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>37
 
Ser Cys Phe Gly Asn Leu Gly Asn Leu Ile Tyr Thr Cys Asp Arg Leu
1               5                   10                  15
 
Met Pro Ser
 
<210>38
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
<400>38
 
Ser Cys Ser Phe Phe Met Pro Trp Cys Asn Phe Leu Asn Gly Glu Met
1           5                       10                  15
 
Ala Val Ser
 
<210>39
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>39
 
Ser Cys Phe Gly Asn Val Phe Cys Val Tyr Asn Gln Phe Ala Ala Gly
1               5                   10                  15
 
Leu Phe Ser
 
<210>40
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>40
 
Ser Cys Cys Phe Ile Asn Ser Asn Phe Ser Val Met Asn His Ser Leu
1               5                   10                  15
 
Phe Lys Ser
 
<210>41
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>41
 
Ser Cys Asp Tyr Phe Ser Phe Leu Glu Cys Phe Ser Asn Gly Trp Ser
1               5                   10                  15
 
Gly Ala Ser
 
<210>42
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>42
 
Ser Cys Trp Met Gly Leu Phe Glu Cys Pro Asp Ala Trp Leu His Asp
1                5                 10                  15
 
Trp Asp Ser
 
<210>43
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>43
 
Ser Cys Phe Trp Tyr Ser Trp Leu Cys Ser Ala Ser Ser Ser Asp Ala
1               5                   10                  15
 
Leu Ile Ser
 
<210>44
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>44
 
Ser Cys Phe Gly Asn Phe Leu Ser Phe Gly Phe Asn Cys Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
 
Leu Gly Ser
 
<210>45
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>45
 
Ser Cys Leu Tyr Cys His Leu Asn Asn Gln Phe Leu Ser Trp Val Ser
1               5                   10                  15
 
Gly Asn Ser
 
<210>46
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>46
 
Ser Cys Phe Gly Phe Ser Asp Cys Leu Ser Trp Phe Val Gln Pro Ser
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser
 
<210>47
<211>19
<212>PRT    
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>47
 
Ser Cys Asn His Leu Gly Phe Phe Ser Ser Phe Cys Asp Arg Leu Val
1               5                   10                  15
 
Glu Asn Ser
 
<210>48
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>48
 
Ser Cys Gly Tyr Phe Cys Ser Phe Tyr Asn Tyr Leu Asp Ile Gly Thr
1               5                   10              15
 
Ala Ser Ser
 
<210>49
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>49
 
Ser Cys Asn Ser Ser Ser Tyr Ser Trp Tyr Cys Trp Phe Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
 
Ser Pro Ser
 
<210>50
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>50
 
Phe Gly His Gly Trp Leu Asn Thr Leu Asn Leu Gly Trp
1               5                   10
 
<210>51
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>51
Phe Ser Pro Phe Ser Ala Asn Leu Trp Tyr Asp Met Phe
1               5                   10
 
<210>52
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>52
 
Val  Phe Val Pro Phe Gly Asn Trp Leu Ser Thr Ser Val
1            5                       10
 
<210>53
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>53
 
Phe Trp Asn Val Asn Tyr Asn Pro Trp Gly Trp Asn Tyr
1               5                   10
 
<210>54
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>54
 
Phe Tyr Trp Asp Arg Leu Asn Val Gly Trp Gly Leu Leu
1               5                   10
 
<210>55
<211>13
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>55
 
Leu Tyr Ser Thr Met Tyr Pro Gly Met Ser Trp Leu Val
1               5                   10
 
<210>56
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
<400>56
 
Ser Cys Phe Tyr Gln Asn Val Ile Ser Ser Ser Phe Ala Gly Asn Pro
1               5                   10                  15
 
Trp Glu Cys
 
<210>57
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>57
 
Ser Cys Asn Met Leu Leu Asn Ser Leu Pro Leu Pro Ser Glu Asp Trp
1               5                   10                  15
 
Ser Ala Cys
 
<210>58
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>58
 
Ser Cys Pro Phe Thr His Ser Leu Ala Leu Asn Thr Asp Arg Ala Ser
1               5                   10                  15
 
Pro Gly Cys
 
<210>59
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>59
 
Ser Cys Phe Glu Ser Asp Phe Pro Asn Val Arg His His Val Leu Lys
1               5                   10                  15
 
Gln Ser Cys
 
<210>60
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>60
 
Ser Cys Val Phe Asp Ser Lys His Phe Ser Pro Thr His Ser Pro His
1              5                   10                  15
 
Asp Val Cys
 
<210>61
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>61
 
Ser Cys Gly Asp His Met Thr Asp Lys Asn Met Pro Asn Ser Gly Ile
1               5                   10                  15
 
Ser Gly Cys
 
<210>62
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>62
 
Ser Cys Asp Phe Phe Asn Arg His Gly Tyr Asn Ser Gly Cys Glu His
1               5                   10                  15
 
Ser Val Cys
 
<210>63
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>63
 
Ser Cys Gly Asp His Met Thr Asp Lys Asn Met Pro Asn Ser Gly Ile
1               5                   10                  15
 
Ser Gly Cys
 
<210>64
<211>19
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>64
 
Ser Cys Tyr Tyr Asn Gly Leu Val Val His His Ser Asn Ser Gly His
1               5                   10                  15
Lys Asp Cys
 
<210>65
<211>18
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>65
 
Cys Trp Ser Arg Phe Arg Leu Phe Met Leu Phe Cys Met Phe Tyr Leu
1               5                   10                  15
 
Val Ser
 
<210>66
<211>18
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>66
 
Cys Ile Lys Tyr Pro Phe Leu Tyr Cys Cys Leu Leu Ser Leu Phe Leu
1               5                   10                  15
 
Phe Ser
 
<210>67
<211>16
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>67
 
Ser Trp Trp Gly Phe Trp Asn Gly Ser Ala Ala Pro Val Trp Ser Arg
1               5                   10                  15
 
<210>68
<211>20
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>68
 
Ser Trp Asp Phe Arg Ser Leu Arg Asp Trp Trp Pro Pro Ala Pro Ser
1               5                   10                  15
 
Leu Ser Ser Arg
            20
 
<210>69
<211>16
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>69
 
Ser Ile Phe Ser Thr Trp Asn Pro Trp Ser Pro Tyr Ser Val Ser Arg
1               5                   10                  15
 
<210>70
<211>15
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>70
 
Ser Phe Gly Ser Trp Trp Trp Gly Ser Gly Ala Ala Ser Ser Arg
1               5                   10                  15
 
<210>71
<211>17
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>71
 
Tyr Phe Arg Ala Phe Arg Lys Phe Val Lys Pro Phe Lys Arg Ala Phe
1               5                   10                  15
 
Lys
 
<210>72
<211>5
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>72
 
Gly Ser Ser Gly Lys
1               5
 
<210>73
<211>26
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>73
 
Ser Ser Gly Pro Arg Glu Ile Trp Asp Ser Leu Val Gly Val Val Asn
1               5                   10                  15
 
Pro Gly Trp Ser Arg Gly Ser Ser Gly Lys
            20                  25
<210>74
<211>26
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>74
 
Ser Ser Gly Gly Val Gly Gly Trp Ala Leu Phe Glu Thr Leu Arg Gly
1               5                   10                  15
 
Lys Glu Val Ser Arg Gly Ser Ser Gly Lys
            20                  25
 
<210>75
<211>26
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>75
 
Ser Ser Val Ala Glu Trp Ala Leu Arg Ser Trp Glu Gly Met Arg Val
1               5                   10                  15
 
Gly Glu Ala Ser Arg Gly Ser Ser Gly Lys
            20                  25
 
<210>76
<211>21
<212>PRT
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>76
 
Ser Trp Trp Gly Phe Trp Asn Gly Ser Ala Ala Pro Val Trp Ser Arg
1               5                   10                  15
 
Gly Ser Ser Gly Lys
            20
 
<210>77
<211>93
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>77
 
tcgagtgggc cgagggagat ttgggatagt ttggttggtg tggtgaatcc ggggtggtct    60
agaggt taco catacgacgt cccagactac gct                                93
 
<210>78
<211>93
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
<400>78
tcgagcggtg gtgttggtgg gtgggcgttg tttgagactc tgcgtggtaa ggaggtgtct    60
agaggttacc catacgacgt cccagactac gct                                 93
 
<210>79
<211>96
<212>DNA
<213>人工
 
<220>
<223>人工序列
 
<400>79
tcgagcgttg ctgagtgggc tttgaggagt tgggagggca tgcgggttgg ggaggcgtct    60
agaggttacc catacgacgt cccagactac gctggg                              96

Claims (42)

1.一种具有通式：SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP的肽组合物，其中SBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的表面结合区和(ii)对植入物的聚合表面材料的亲和性；
GDFBP是10-100个氨基酸的肽，包含(i)10-30个氨基酸的纤维结缔组织诱导性生长因子结合区和(ii)对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性；以及
L可存在或缺失，且包含SBP与GDFBP之间的共价连接物，其中如果L缺失，SBP与GDFBP直接连接在一起。
2.根据权利要求1所述的肽组合物，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子的结合区是SEQ ID NO：9。
3.根据权利要求1所述的肽组合物，其中所述表面结合区是SEQ IDNO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：9。
4.根据权利要求1所述的肽组合物，其中所述表面结合区是SEQ IDNO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：2。
5.根据权利要求1所述的肽组合物，其中所述组合物进一步包含药物可受载体。
6.根据权利要求1所述的肽组合物，进一步包含结合于GDFBP的纤维结缔组织诱导性生长因子。
7.根据权利要求6述的肽组合物，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子是GDF-7。
8.根据权利要求2所述的肽组合物，其中L存在并选自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10个单位的聚乙二醇(“P10”)、6个单位的聚乙二醇(“MP”)、脂肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸组成的组。
9.根据权利要求1所述的肽组合物，包含氨基末端的脂肪酸修饰。
10.一种用肽组合物涂布植入物的方法，所述方法包括
(a)通式为SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP的肽组合物与植入物的表面接触，
其中SBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的表面结合区和(ii)对植入物的聚合表面材料的亲和性；
GDFBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的纤维结缔组织诱导性生长因子结合区和(ii)对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性；以及
L可存在或缺失，且包含SBP与GDFBP之间的共价连接物，其中如果L缺失，SBP与GDFBP直接连接在一起，
其中所述肽组合物的至少一部分借助于表面结合区对所述植入物的聚合表面材料的亲和性而结合于所述植入物。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括纤维结缔组织诱导性生长因子接触GDFBP。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子是GDF-7。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述植入物的聚合物表面材料选自由可生物降解性聚合物、合成聚合物、天然聚合物、胶原、聚对苯二甲酸乙酯、聚四氟乙烯、聚酯、聚乳酸聚乙醇酸交酯共聚物、其混合物、其复合物、其共聚物及其组合组成的组。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述植入物选自由缝线、可生物降解性海绵、心脏修补网状织物、肌腱包绕、韧带包绕、纤维结缔组织假体、胶原支架、胶原线、复合胶原毡圈、合成的移植物、韧带移植物、韧带假体、韧带增强装置和巩膜扣带组成的组。
15.一种涂布通式为SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP的肽组合物的植入物：
其中SBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的表面结合区和(ii)对植入物的聚合表面材料的亲和性；
GDFBP是10-100个氨基酸的肽，所述包含(i)10-30个氨基酸的纤维结缔组织诱导性生长因子结合区和(ii)对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性；以及
L可存在或缺失，且包含SBP与GDFBP之间的共价连接物，其中如果L缺失，SBP与GDFBP直接连接在一起。
16.根据权利要求15所述的植入物，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子的结合区是SEQ ID NO：9。
17.根据权利要求15所述的植入物，所述表面结合区是SEQ IDNO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：9。
18.根据权利要求15所述的植入物，所述表面结合区是SEQ IDNO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：2。
19.根据权利要求15所述的肽组合物，其中L存在并选自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10个单位的聚乙二醇(“P10”)、6个单位的聚乙二醇(“MP”)、脂肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸组成的组。
20.根据权利要求15所述的肽组合物，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子结合于GDFBP。
21.根据权利要求20所述的肽组合物，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子是GDF-7。
22.根据权利要求15所述的植入物，其中所述肽组合物包含氨基末端的脂肪酸修饰。
23.一种用于刺激患者纤维结缔组织产生的方法，所述方法包括：
(a)将包含聚合物表面材料的植入物置于患者靶部位，所述聚合物表面材料的至少一部分已结合通式为SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP的肽组合物：
其中SBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的表面结合区和(ii)对植入物的聚合表面材料的亲和性；
GDFBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的纤维结缔组织诱导性生长因子结合区和(ii)对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性；
L可存在或缺失，且包含SBP与GDFBP之间的共价连接物，其中如果L缺失，SBP与GDFBP直接连接在一起；以及
其中通过结合于靶部位的GDFBP限制所述纤维结缔组织诱导性生长因子刺激了纤维结缔组织的产生。
24.根据权利要求23所述的方法，其中置于靶部位的所述植入物包含结合于GDFBP的纤维结缔组织诱导性生长因子。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子是GDF-7。
26.根据权利要求23所述的植入物，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子的结合区是SEQ ID NO：9。
27.根据权利要求23所述的植入物，所述表面结合区是SEQ IDNO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：9。
28.根据权利要求23所述的植入物，所述表面结合区是SEQ IDNO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：2。
29.根据权利要求23所述的方法，其中L存在并选自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10个单位的聚乙二醇(“P10”)、6个单位的聚乙二醇(“MP”)、脂肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸组成的组。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述肽组合物包含氨基末端的脂肪酸修饰。
31.一种将纤维结缔组织诱导性生长因子递送至所述包含聚合物表面材料的植入物表面的方法，所述方法包括：
(a)将肽组合物与植入物的表面接触充足的时间以使所述表面的至少一部分结合于所述肽组合物，其中，所述肽组合物的通式为SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP，
其中SBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的表面结合区和(ii)对植入物的聚合表面材料的亲和性；
GDFBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的纤维结缔组织诱导性生长因子结合区和(ii)对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性；
L可存在或缺失，且包含SBP与GDFBP之间的共价连接物，其中如果L缺失，SBP与GDFBP直接连接在一起，且其中纤维结缔组织诱导性生长因子结合于GDFBP。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子是GDF-7，且以可有效促进一种过程的量递送GDF-7，所述过程选自由纤维结缔组织修复、纤维结缔组织形成及其组合组成的组。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述纤维结缔组织诱导性生长因子的结合区是SEQ ID NO：9。
34.根据权利要求31所述的方法，所述表面结合区是SEQ ID NO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：9。
35.根据权利要求31所述的方法，所述表面结合区是SEQ ID NO：71，纤维结缔组织诱导性生长因子结合区是SEQ ID NO：2。
36.根据权利要求31所述的方法，其中L存在并选自由聚合物、合成的聚合物、聚醚、聚乙二醇(“PEG”)、10个单位的聚乙二醇(“P10”)、6个单位的聚乙二醇(“MP”)、脂肪酸、十一烷酸(AUD)、肉豆蔻酸和氨基酸组成的组。
37.根据权利要求31所述的植入物，其中所述肽组合物包含氨基末端的脂肪酸修饰。
38.一种包含肽组合物组成部分的试剂盒，所述肽组合物组成部分具有对植入物表面材料的结合亲和性和对纤维结缔组织诱导性生长因子的结合亲和性，其中所述肽组合物通式为：SBP-L-GDFBP或GDFBP-L-SBP，
其中SBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的表面结合区和(ii)对植入物的聚合表面材料的亲和性；
GDFBP是10-100个氨基酸的肽，所述肽包含(i)10-30个氨基酸的纤维结缔组织诱导性生长因子结合区和(ii)对纤维结缔组织诱导性生长因子的亲和性；以及
L可存在或缺失，且包含SBP与GDFBP之间的共价连接物，其中如果L缺失，SBP与GDFBP直接连接在一起。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述肽组合物进一步包含结合于GDFBP的纤维结缔组织诱导性生长因子。
40.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含独立包装的第二组成部分，所述第二组成部分含所述纤维结缔组织诱导性生长因子。
41.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含其他组成部分，选自由用于重溶的液体、供给装置、所述试剂盒的使用说明书、待施予所述肽组合物的植入物及其组合组成的组。
42.一种分离的肽，包含的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQID NO：67和SEQ ID NO：71组成的组。
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