CN109106981A - 双重修饰的胶原支架及在修复脊髓损伤的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双重修饰的胶原支架及在修复脊髓损伤的产品中的应用。所述双重修饰的胶原支架包括胶原支架材料，以及修饰在所述胶原支架材料上的EGFR抗体和微管稳定分子。本发明将EGFR抗体西妥昔和微管稳定分子紫杉醇共同修饰线性有序胶原支架材料，不仅可以通过封闭EGFR信号通路的活化有效拮抗髓鞘相关抑制分子等对神经再生的抑制作用，促进脊髓损伤部位产生更多的神经元，利于神经纤维的髓鞘化，还可以通过稳定微管的结构促进轴突的再生并减少损伤区抑制性瘢痕成分的沉积，阻碍抑制性瘢痕的形成，从而重建脊髓神经回路，最终实现脊髓损伤后更好的行为功能恢复。

Description

双重修饰的胶原支架及在修复脊髓损伤的产品中的应用
技术领域
本发明涉及一种双重修饰的胶原支架，具体涉及一种用于修复脊髓损伤的线性有序胶原支架及其制备方法，以及其在制备修复脊髓损伤的产品中的应用，属于生物医学材料技术领域。
背景技术
脊髓损伤是临床上常见的严重中枢神经系统损伤，往往造成损伤平面以下永久性感觉和运动功能障碍，给患者和家人带来巨大痛苦。而且，目前脊髓损伤的治疗仍面临重大挑战。
胶原是细胞外基质的主要成分，具有生物相容性好、免疫原性低的特性。胶原材料可以作为用于引导神经再生的生物材料。之前本案发明人研发了一种专门用于脊髓神经损伤修复的线性有序胶原支架材料，它作为复合治疗体系构建的基础，首先充当了载体的作用，将再生因子带入损伤部位；其次可以通过占据损伤横截组织的腾空抑制瘢痕相关成分的沉积；另外，它有序的线性结构还可以引导神经纤维的定向生长。
目前，脊髓损伤后引导神经再生的修复策略越来越多，但是针对某一单一因素而进行的脊髓损伤修复研究都只能在一定程度上促进损伤后的神经再生。仅仅针对某项特定因素而进行的修复手段最终能观察到的神经元再生和功能恢复均不乐观。近年来，越来越多的研究转向针对两种或多种不同因素的综合治疗手段来修复脊髓损伤，复合治疗手段比单一治疗手段显示了明显的优势，得到了更好的修复效果。因此，针对不同影响脊髓损伤后再生的因素，整合有利于脊髓损伤修复的不同因素，构建一个包含多种修复因素的支架体系是脊髓损伤修复较有希望的策略。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种双重修饰的胶原支架、其制备方法与其在制备修复脊髓损伤的产品中的应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了双重修饰的胶原支架在制备修复脊髓损伤的产品中的应用；
其中，所述双重修饰的胶原支架包括胶原支架材料，以及修饰在所述胶原支架材料上的EGFR抗体和微管稳定分子。
在一些实施例中，所述EGFR抗体和微管稳定分子通过物理吸附的方式均匀分布于所述胶原支架材料的内部和表面。
优选的，所述EGFR抗体包括西妥昔。
优选的，所述微管稳定分子包括紫杉醇。
本发明实施例还提供了一种双重修饰的胶原支架，其包括胶原支架材料，以及修饰在所述胶原支架材料上的EGFR抗体和微管稳定分子。
本发明实施例还提供了前述双重修饰的胶原支架的制备方法，其包括：
将EGFR抗体和微管稳定分子同时溶于选定溶剂中，然后滴加到胶原支架材料上，并于4～20℃孵育过夜，获得双重修饰的胶原支架。
本发明实施例还提供了一种修复脊髓损伤的功能产品，其包含前述的双重修饰的胶原支架。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
本发明提供的双重修饰的胶原支架材料将可以促进神经干细胞向神经元分化的EGFR抗体西妥昔和能够促进轴突生长并抑制瘢痕形成的微管稳定分子紫杉醇共同修饰线性有序胶原支架材料，不仅可以通过封闭EGFR信号通路的活化有效拮抗髓鞘相关抑制分子等对神经再生的抑制作用，促进脊髓损伤部位产生更多的神经元，利于神经纤维的髓鞘化，还可以通过稳定微管的结构促进轴突的再生并减少损伤区抑制性瘢痕成分的沉积，阻碍抑制性瘢痕的形成。另外，胶原支架材料本身也可以通过物理占据而抑制瘢痕相关成分的沉积。总之，双重修饰胶原支架可以促进脊髓损伤部位产生更多的神经元、再生神经纤维的髓鞘化及新生神经元成熟为功能性神经元，同时具有促进神经元分化、利于神经纤维再生以及抑制瘢痕相关成分沉积的多重功能，从而重建脊髓神经回路，最终实现脊髓损伤后更好的行为功能恢复。
附图说明
图1a-图1d为本发明一典型实施例提供的双重修饰的胶原支架的结构示意图；
图1e为本发明一典型实施例提供的双重修饰的胶原支架的制备过程及用于脊髓损伤修复的过程示意图；
图2a和图2b为本发明一典型实施例提供的双重修饰的胶原支架移植入大鼠脊髓T10全横断部位后大鼠运动功能恢复情况示意图；
图3a为本发明对照组、材料组和双重修饰胶原支架材料组动物损伤部位Tuj-1阳性的早期神经元情况照片；
图3b为损伤区Tuj-1阳性神经元的定量结果分析图；
图3c为本发明对照组、材料组和双重修饰胶原支架材料组动物损伤部位Map2阳性的成熟神经元情况照片；
图3d为损伤区Map2阳性神经元的定量结果分析图；
图4a、图4d和图4e为本发明一典型实施例提供的双重修饰的胶原支架材料组动物损伤区内神经纤维被髓鞘化的示意图；
图4b、图4c和图4f为本发明一典型实施例提供的双重修饰的胶原支架材料组动物损伤区内产生特定能效的神经元的示意图；
图5a为本发明各治疗组Vimentin免疫荧光代表图片；
图5b为本发明各治疗组损伤区Vimentin阳性信号的定量结果分析图；
图6a为本发明各治疗组Fibronectin免疫荧光代表图片；
图6b为本发明各治疗组损伤区Fibronectin阳性信号的定量结果分析图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
本发明设计了一种复合治疗体系，将EGFR抗体西妥昔(Cetuximab)和微管稳定分子紫杉醇(Taxol)共同修饰线性有序胶原支架材料，制备出一种新型的双重修饰的胶原支架材料。这种双重修饰胶原支架材料不仅可以通过封闭EGFR信号通路的活化有效拮抗髓鞘相关抑制分子等对神经再生的抑制作用，还可以通过稳定微管的结构促进轴突的再生并阻碍抑制性瘢痕的形成。另外，胶原支架材料本身也可以通过物理占据而抑制瘢痕相关成分的沉积。体内试验证明，双重修饰胶原支架材料移植减少了脊髓损伤部位抑制性瘢痕成分的沉积，促进了脊髓损伤部位产生更多的神经元、再生神经纤维的髓鞘化及新生神经元成熟为功能性神经元，从而重建脊髓神经回路，最终实现脊髓损伤后更好的行为功能恢复。
本发明实施例的一个方面提供的双重修饰的胶原支架在制备修复脊髓损伤的产品中的应用。
其中，所述双重修饰的胶原支架包括胶原支架材料，以及修饰在所述胶原支架材料上的EGFR抗体和微管稳定分子。
在一些实施例中，所述EGFR抗体和微管稳定分子通过物理吸附的方式均匀分布于所述胶原支架材料的内部和表面。
优选的，所述EGFR抗体和微管稳定分子的质量比为4～6μg：200～300ng。
优选的，所述EGFR抗体包括西妥昔。
优选的，所述微管稳定分子包括紫杉醇。
进一步的，所述胶原支架材料包括有序胶原支架材料，优选为线性有序胶原支架材料，尤其优选为牛肌肉筋膜。
优选的，所述有序胶原支架材料的长度为2～6mm，尤其优选为3～5mm，直径为1～3mm，尤其优选为1.5～2.5mm。
进一步的，所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。
进一步的，所述产品至少具有促进神经干细胞向神经元分化的功能。
进一步的，所述产品至少具有促进轴突生长并阻碍抑制性瘢痕沉积的功能。
本发明实施例的另一个方面提供了一种双重修饰的胶原支架，其包括胶原支架材料，以及修饰在所述胶原支架材料上的EGFR抗体和微管稳定分子。
在一些实施例中，所述EGFR抗体和微管稳定分子通过物理吸附的方式均匀分布于所述胶原支架材料的内部和表面。
优选的，所述EGFR抗体和微管稳定分子的质量比为4～6μg：200～300ng。
优选的，所述EGFR抗体包括西妥昔。
其中，表皮生长因子受体(EGFR)是一个巨大的跨膜糖蛋白，具有配体诱导的酪氨酸蛋白激酶活性。许多研究证明EGFR参与了髓鞘相关抑制分子和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)调节的神经干细胞向胶质细胞分化的过程。髓鞘相关抑制分子主要包括Nogo-A，髓鞘相关糖蛋白(MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)。髓鞘相关抑制分子和CSPG不仅具有抑制轴突生长的特性，也能阻碍神经干细胞向神经元分化。髓鞘相关抑制分子和CSPG与各自受体结合会通过升高胞内钙离子浓度激活EGFR信号通路，从而抑制轴突生长和神经干细胞向神经元分化。由于活化EGFR信号通路会抑制神经再生，那么衰减EGFR信号可能会促进神经再生。抗体与抗原高度结合，可以覆盖抗原的主要表位从而直接阻止其生物学活性，这已被广泛用于肿瘤治疗。比如，EGFR抗体和EGFR的高度结合可以通过封闭EGFR信号通路而实现抑制肿瘤细胞的增殖。因此，可以利用EGFR抗体(比如西妥昔，Cetuximab)和EGFR的高度亲和性来衰减EGFR信号从而促进轴突生长及神经干细胞向神经元分化。
优选的，所述微管稳定分子包括紫杉醇。
紫杉醇(Taxol)是临床批准的抗癌药物，通过稳定微管干扰细胞分裂期间微管的正常分解。在低浓度时，紫杉醇改变微管动力学并在正端促进微管聚合。有研究表明Taxol能够阻止脊髓损伤后轴突回缩小泡的形成，并可以克服体外培养条件下神经突生长的髓鞘抑制作用。另外，微管动力学调节瘢痕形成中的关键过程，包括细胞增殖、迁移和分化，以及细胞外基质分子的细胞内运输和分泌。因此，适度的微管稳定既可以防止脊髓神经纤维横断后轴突的回缩和膨胀，又可以阻碍脊髓损伤部位抑制性瘢痕的形成，从而可能促进损伤脊髓神经功能的恢复。
前述胶原支架材料可优选自有序胶原材料，例如细丝状的线性有序胶原材料，尤其优选为牛肌肉筋膜，其良好的生物相容性可以支持细胞粘附生长，有序的结构可以定向引导神经丝的延伸，并且可以通过占据损伤横截组织的腾空而在一定程度上抑制瘢痕的沉积。
优选的，所述有序胶原支架材料的长度为2～6mm，尤其优选为3～5mm，直径为1～3mm，尤其优选为1.5～2.5mm。
本发明实施例还提供了前述双重修饰的胶原支架的制备方法，其包括：
将EGFR抗体和微管稳定分子同时溶于选定溶剂中，然后滴加到胶原支架材料上，并于4～20℃孵育过夜，获得双重修饰的胶原支架。
进一步的，所述制备方法还包括：以理化脱细胞方法对所述胶原支架材料进行预处理。
进一步的，所述溶剂包括磷酸盐缓冲液(PBS)。
本发明实施例还提供了一种修复脊髓损伤的功能产品，其包含前述的双重修饰的胶原支架。
综上所述，本发明为了补充脊髓损伤部位丢失的神经元，促进神经纤维的再生，及消除脊髓损伤后瘢痕相关成分的抑制作用，通过将可以促进神经干细胞向神经元分化的EGFR抗体西妥昔，和能够促进轴突生长并抑制瘢痕形成的微管稳定分子紫杉醇修饰线性有序胶原支架材料，制备出一种双重修饰的胶原支架材料。体内试验证明，双重修饰胶原支架材料可以促进脊髓损伤部位产生更多的神经元，利于神经纤维的髓鞘化，并减少损伤区抑制性瘢痕成分的沉积。这对脊髓神经损伤后神经元回路的重建和运动功能的恢复都起到良好的效果。这是第一次将EGFR抗体西妥昔和微管稳定分子紫杉醇共同修饰胶原支架，同时具有促进神经元分化、利于神经纤维再生以及抑制瘢痕相关成分沉积的多重功能。
以下通过若干实施例并结合附图进一步详细说明本发明的技术方案。然而，所选的实施例仅用于说明本发明，而不限制本发明的范围。
一、线性有序胶原支架材料的制备
线性有序胶原支架材料获取自牛肌肉筋膜。选取新鲜牛筋膜，仔细剔除筋膜上附着的肌肉和脂肪，切成适当体积大小，使用一系列理化脱细胞方法处理。冻干，即得到本发明中使用的线性有序胶原支架材料。
二、双重修饰的胶原支架材料的制备
请参阅图1所示，将5μg西妥昔和256ng紫杉醇同时溶于20μL PBS中，然后滴加于长4mm、直径2mm的线性有序胶原支架材料束上，于4℃条件下孵育过夜，组合成具有多重功能的双重修饰的胶原支架材料。
三、双重修饰的胶原支架材料在脊髓损伤动物模型中的治疗评价
1.大鼠脊髓T10全横断动物模型的建立
SD大鼠购自南京斯科瑞生物科技有限公司，所有试验动物均使用雌性大鼠，体重190-210g。所有动物均提前一周同批次订购，控温控湿控照明条件下饲养一周以适应新环境。
所有动物均使用腹腔注射10％水合氯醛(0.5g/kg)的方式麻醉，背部剃毛，使用碘伏消毒皮肤，手术刀开约2cm的切口，暴露胸椎T9-T11，咬骨钳撬掉T10椎板，暴露脊髓，完全横断约4mm的脊髓以制造大鼠脊髓T10完全横断创伤。损伤后立即进行分组治疗，不移植、单独移植胶原支架材料、移植5μg西妥昔修饰的胶原支架材料、移植256ng紫杉醇修饰的胶原支架材料、或移植5μg西妥昔和256ng紫杉醇共同修饰的胶原支架材料。
2.双重修饰的胶原支架材料促进大鼠脊髓损伤后行为功能的恢复
在脊髓损伤大鼠接受治疗后的第1-8周，分别对每只动物进行下肢行为学观察。行为学评分标准参考文献报道，采用BBB评分等级法进行，分为0-21级，共22级。21分为下肢行为功能正常，0分为下肢行为功能完全丧失。评分结果显示，在8周的观察期内，双重修饰胶原支架材料组的动物表现出较好的下肢运动功能恢复，除第2周外，该组动物的行为学评分呈现出较对照组和材料组显著性的统计学差异(参见图2a)。在8周的观察期满后，双重修饰胶原支架材料组的动物表现出最好的行为功能恢复，其行为学评分极显著高于对照组，并显著高于材料组，而单因子修饰胶原支架材料组动物的行为学评分仅仅显著高于对照组(参见图2b)，其中，*P<0.05，**P<0.01，由one-way ANOVA分析确定。上述结果表明，双重修饰的胶原支架材料组动物的行为恢复表现出了一定的协同效应，具有最好的行为功能恢复效果，优于单因子修饰的胶原支架材料的治疗效果。
3.双重修饰支架材料促进脊髓损伤部位神经元的发生
8周的观察期满后，对各组动物进行取材分析。通过免疫荧光染色检测脊髓损伤部位神经元再生的情况。本申请发明人发现在双重修饰胶原支架材料组动物损伤区能检测到最多的Tuj-1阳性的新生神经元和Map2阳性的成熟神经元，在对照组动物损伤区内能检测到的神经元细胞数量最少，而在材料组动物损伤区内检测到的神经元细胞数量与对照组无显著性差异，并且两个单因子修饰胶原支架材料治疗组动物损伤区内神经元细胞数量之间没有明显差别却均低于双重修饰胶原支架材料组(参见图3a-图3d)。结果表明，双重修饰的胶原支架材料移植能够较好地协同促进脊髓损伤区新生神经元的产生，可在一定程度上解释双重修饰的胶原支架材料治疗组动物得到更好行为功能恢复的原因。
4.双重修饰的胶原支架材料在脊髓损伤部位诱导新生神经元成熟为功能性神经元
大量的神经元可以在双重修饰的胶原支架材料组动物损伤区内再生，由于神经纤维的髓鞘化是实现神经兴奋传递的必要条件之一，本申请发明人检测了双重修饰胶原支架材料组动物损伤区内新生神经纤维的髓鞘化情况。通过神经丝蛋白特异标志物NF和髓鞘相关糖蛋白MAG或髓鞘碱性蛋白MBP以及透射电镜分析，发现一些再生到损伤区的神经纤维可以有效地被髓鞘化(参见图4a、图4d、图4e)。
接着，本申请发明人检测了双重修饰的胶原支架材料组动物损伤区新生神经元能否进一步成熟为不同能效的神经元以参与脊髓损伤的修复。通过免疫荧光染色分析，发现在双重修饰的胶原支架材料组动物损伤区内能够检测到一些5-HT阳性的运动神经元、TH阳性的多巴胺能神经元和ChAT阳性的胆碱能神经元(参见图4b、图4c、图4f)。以上这些都是能够发挥特定能效的功能性神经元，表明双重修饰的胶原支架材料能够促进损伤部位的新生神经元进一步成熟为功能性神经元。
5.双重修饰的胶原支架材料抑制脊髓损伤部位瘢痕相关成分的沉积
很多报道表明，脊髓损伤后在损伤区产生或沉积的抑制性瘢痕相关成分会阻碍脊髓神经再生及功能恢复。因此，本申请发明人检测了各治疗组动物损伤区内瘢痕相关成分的沉积情况。采用Vimentin特异性标志物表征胶质瘢痕主要成分之一波形蛋白，结果显示双重修饰胶原支架材料组动物损伤区具有最少的Vimentin阳性信号，而对照组最多，材料组次之，两个单因子修饰胶原支架材料组动物损伤区内Vimentin阳性信号数量居中，均多于双重修饰的胶原支架材料组(参见图5a和图5b)，其中*P<0.05，**P<0.01，由one-wayANOVA分析确定。但从趋势上来看，西妥昔比紫杉醇具有更好地抑制Vimentin阳性的胶质瘢痕成分波形蛋白沉积的效果。上述结果表明，胶原支架、西妥昔和紫杉醇三者在抑制胶质瘢痕特定成分沉积方面具有加和的效应。
除了胶质瘢痕成分，瘢痕组织的另外一种主要成分是纤维性瘢痕，它主要是由侵入到损伤部位的成纤维细胞聚集而成。研究发现成纤维细胞在损伤区沉积后主要分泌一些细胞外基质成分，如Ⅳ型胶原(CollagenⅣ)、层黏连蛋白(Laminin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)等。基于移植的支架材料的主要成分是胶原，所以可以选择层黏连蛋白或纤维连接蛋白而非胶原蛋白来表征纤维性瘢痕以查看其在损伤区的沉积情况。免疫荧光分析显示，仅在施加有Taxol的治疗组动物损伤区呈现出显著减少的Fibronectin阳性信号(参见图6a和图6b)，其中，*P<0.05，**P<0.01，由one-way ANOVA分析确定，说明紫杉醇在降低损伤区纤维性瘢痕沉积方面起了主导作用。
总之，本发明构建的双重修饰的胶原支架材料不仅显著降低胶质瘢痕相关成分而且能够阻止纤维瘢痕在损伤区的沉积，不同因子对瘢痕的不同成分产生的影响不同，这也在一定程度上体现出了复合治疗的必要性。
综合分析以上结果，本申请发明人成功制备了一种双重修饰的胶原支架材料，将EGFR抗体、微管稳定分子和线性有序胶原材料三者针对不同的方面组合起来达到协同复合治疗的目的，并采用动物实验的方法证实三者的加和效应，本发明是第一次将三者联合应用于脊髓损伤修复。并且通过试验证明，这种西妥昔和紫杉醇共同修饰的胶原支架材料不仅可以促进脊髓损伤部位产生更多的神经元及新生神经元的进一步成熟，同时还能有效抑制瘢痕相关成分的沉积；并且，利用本发明制备的双重修饰的胶原支架材料实现了大鼠脊髓损伤后更有效的行为功能恢复。
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (14)

1.双重修饰的胶原支架在制备修复脊髓损伤的产品中的应用；
所述双重修饰的胶原支架包括胶原支架材料，以及修饰在所述胶原支架材料上的EGFR抗体和微管稳定分子。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述EGFR抗体和微管稳定分子通过物理吸附的方式均匀分布于所述胶原支架材料的内部和表面。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述EGFR抗体和微管稳定分子的质量比为4～6μg：200～300ng；和/或，所述EGFR抗体包括西妥昔；和/或，所述微管稳定分子包括紫杉醇。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胶原支架材料包括有序胶原支架材料，优选为线性有序胶原支架材料，尤其优选为牛肌肉筋膜；优选的，所述有序胶原支架材料的长度为2～6mm，尤其优选为3～5mm，直径为1～3mm，尤其优选为1.5～2.5mm。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有修复脊髓损伤的功能。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有促进神经干细胞向神经元分化的功能。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：所述产品至少具有促进轴突生长并阻碍抑制性瘢痕沉积的功能。
8.一种双重修饰的胶原支架，其特征在于包括胶原支架材料，以及修饰在所述胶原支架材料上的EGFR抗体和微管稳定分子。
9.根据权利要求8所述的双重修饰的胶原支架，其特征在于：所述EGFR抗体和微管稳定分子通过物理吸附的方式均匀分布于所述胶原支架材料的内部和表面。
10.根据权利要求8或9所述的双重修饰的胶原支架，其特征在于：所述EGFR抗体和微管稳定分子的质量比为4～6μg：200～300ng；和/或，所述EGFR抗体包括西妥昔；和/或，所述微管稳定分子包括紫杉醇。
11.根据权利要求8或9所述的双重修饰的胶原支架，其特征在于：所述胶原支架材料包括有序胶原支架材料，优选为线性有序胶原支架材料，尤其优选为牛肌肉筋膜；优选的，所述有序胶原支架材料的长度为2～6mm，尤其优选为3～5mm，直径为1～3mm，尤其优选为1.5～2.5mm。
12.权利要求8-11中任一项所述的双重修饰的胶原支架的制备方法，其特征在于包括：
将EGFR抗体和微管稳定分子同时溶于选定溶剂中，然后滴加到胶原支架材料上，并于4～20℃孵育过夜，获得双重修饰的胶原支架。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于还包括：以理化脱细胞方法对所述胶原支架材料进行预处理。
14.一种修复脊髓损伤的功能产品，其特征在于包含权利要求8-11中任一项所述的双重修饰的胶原支架。
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