CN105233344A - 一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种便于手术操作，实现缺损神经快速桥接的复合修复材料及其支架的组成、制备和应用。该复合材料是由丝素层-胶原层-高分子聚合物层依次排列组成，应用时通过折叠或卷折形成丝素层为内层、胶原层为中层、高分子聚合物层为外层的神经桥接支架。本发明的复合修复材料及其支架采用分层式排布和特定的三维设计，发挥各种修复材料的优势，同时弥补其不足，手术操作时只需神经外膜的缝合或黏合法吻合，不需要进行神经束膜的缝合，极大地节省了缺损神经桥接手术的操作时间，降低了手术技术难度，提高安全性。

Description

一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架

技术领域

本发明涉及到一种实现神经快速桥接的修复材料，特别涉及一种便于手术操作，实现缺损神经快速桥接的复合修复材料及其支架的组成、制备和应用。

背景技术

临床上由于外伤导致的中枢和周围神经损伤非常常见，中长距离的神经缺损通常不能依靠端对端的缝合来弥补。临床上最常用的移植材料是自体神经，但供体直径细，可切取的数量非常有限，难以满足临床需要，因此必须依靠修复材料或移植支架来桥接修复。寻找和研制较为合适的修复材料或移植支架是解决缺损神经修复的关键。目前除了自体神经成为首选的神经缺损桥接移植物外，在人类自身仍未找到较为理想、并得到共认和在临床上广泛应用的神经移植替代材料。但自体神经移植的神经来源有限，并且存在神经的组织结构和尺寸难以匹配等原因，因此未能在临床上广泛使用。

随着组织工程学的出现和发展，为构建自体神经移植替代品提供了一条新的出路。近二十多年来，人们尝试了多种生物可降解高分子材料，其中包括聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、壳聚糖、明胶、硅胶等材料，但在实际使用中还都存在着各自不同的缺点。

丝素蛋白来自于天然蚕丝，是由18种氨基酸所组成。研究表明，丝素蛋白具有良好的生物亲和性.无毒，无污染，可生物降解，可望发展成为人工神经修复材料用于神经损伤治疗，为神经细胞的生长提供良好的诱导作用和必要的生长空间。

神经瘤是损伤神经修复过程中不希望出现的，一旦发生，很难逆转。神经瘤是由致密胶原基质中杂乱轴突、雪旺氏(Schwann)细胞、神经内膜细胞和神经束膜细胞与周围的成纤维细胞的混乱结构组成的。当向远端神经或靶器官的神经修复失败及神经纤维不适当和不规律地再生到周围疤痕组织时形成神经瘤。但将抗肿瘤药物加入到神经修复材料中，虽可抑制神经瘤形成，但同时抑制神经细胞的生长，形成神经细胞修复的屏障。

临床上主要靠直接缝合术来连接断端神经，但是对于缺损较大的神经，无法直接缝合。已有的再生或修复材料实现神经桥接所需的操作技术要求高、耗时长、容易复发性撕裂等。此外，合成的高分子聚合物作为修复材料，尽管力学强度好，但对于神经轴突的生长没有诱导作用。而胶原为基质的导管或支架，无法发挥神经信号传导功能，并且容易引起排异反应。以蚕丝为材料的丝素纤维，具有神经信号传导功能，可以发挥一定的暂时替代作用，但是对于防止神经瘤形成并不起到任何作用。

近年来，不少国家的研究机构和企业投入了大量人力、物力与资金对神经修复材料进行研究。但是已有报道的神经修复策略中缺乏一种理想的神经修复材料，既能为神经再生提供最佳的理化和生物学微环境，又能保证手术操作简便快捷，术后无复发性撕裂等问题，实现神经吻合操作的快捷、安全和预后好的多重目的。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种新型桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，既能为神经再生提供最佳的理化和生物学微环境，又能提供良好的力学性能，保证手术操作简便快捷的完成。

本发明人研究发现，神经损伤的治疗效果不理想，主要难题之一是没有一种材料可以同时实现理想的神经修复所需要的所有条件。发明人经过大量的实验，发现了一种符合神经吻合手术的复合修复材料及支架，可以满足理想的神经桥接和修复的需要。

本发明的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，所述的复合材料是由丝素层-胶原层-高分子聚合物层依次排列组成，高分子聚合层呈T型或长方形设计，应用时通过折叠或卷折形成丝素层为内层、胶原层为中层、高分子聚合物层为外层的神经桥接支架。

上述的丝素层的组成为蚕丝提取的丝素蛋白纤维，按照与对接缺损神经平行方向的方式排列，高度上呈波谷状分布。

上述的的胶原层中包含微管蛋白抑制剂、神经营养因子、透明质酸一种或几种组合。

上述的胶原层或丝素层中包含干细胞、羊毛甾醇、蜗牛蛋白酶一种或几种组合。

上述的高分子聚合物采用生物相容性可降解高分子材料，包括聚乳酸、聚羟基乙酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙交酯-丙交酯、聚羟基丁酸酯、聚已内酯、聚乙醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酯、聚碳酸酯、聚氨酯及它们的共聚物。

上述的微管蛋白抑制剂选自：埃博霉素及其同类物或衍生物、紫杉醇及其同类物或衍生物、秋水仙碱及其同类物或衍生物、长春碱及其同类物或衍生物中的一种或几种组合。

上述的神经营养因子选自：神经生长因子、脑源性神经生长因子、神经分裂素、睫状神经营养因子、白细胞介素-6、成纤维细胞生长因子、白细胞抑制因子、类胰岛素生长因子、胰岛素淀粉肽、表皮生长因子、胶质源性神经营养因子、血小板源性生长因子、转化生长因子β中的一种或几种组合。

上述的干细胞选自：许旺细胞、骨髓间充质细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、神经干细胞或诱导多能干细胞中的一种或几种组合。

一种如上述的用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架料的制备方法，包括如下步骤：

(1)以易挥发有机溶剂配制浓度为0.05-0.8g/ml的高分子聚合物溶液，倒入模具自然晾干，得到厚度为50-800um的高分子聚合物膜，高分子聚合层呈T型或长方形；

(2)配制浓度为5-20mg/ml的胶原溶液，倒在铺有高分子聚合物膜的玻璃片上使均匀，自然晾干得到胶原--高分子聚合双层膜；

(3)利用三维打印技术或高压静电纺织技术将丝素蛋白平行铺展在上述复合膜的胶原层表面，形成与对接神经方向平行的方式排列，并且高度上呈波谷状分布的内层。

上述的丝素层-胶原层-高分子聚合物层的复合材料及其支架，用于中枢神经或周围神经的修复，结合缝合法或黏合法实现缺损神经的快速桥接和修复。

本发明的新型桥接缺损神经的复合修复材料及其支架的优点体现在采用分层式排布和特定的三维设计，发挥各种修复材料的优势，同时弥补其不足：①丝素层的独特设计，不仅引导神经修复，而且隔开不同神经，防止形成神经瘤。②胶原层提供神经轴突生长所需的各种养分。③高分子聚合物层，具有良好的力学性能，提供手术缝合或吻合所需的力学强度，并且防止周围神经的侵入，防止纤维疤痕的形成。④只需神经外膜的手术缝合或黏合法吻合，不需要进行神经束膜的缝合，极大地节省了缺损神经桥接手术的操作时间，降低了手术技术难度，提高安全性。

附图说明

图1是本发明的一种用于桥接缺损神经的丝素-胶原-高分子聚合物的复合材料平展时侧面结构示意图(A：分子聚合物层呈T型；B：分子聚合物层为长方形)

图2是本发明的一种用于桥接缺损神经的丝素-胶原-高分子聚合物的复合材料平展时俯视图(A：分子聚合物层呈T型；B：分子聚合物层为长方形)

图3是本发明的一种用于桥接缺损神经的丝素-胶原-高分子聚合物的复合材料不同方式卷折时侧面结构示意图(A和B：折叠方式，可以进一步卷成同心的多层圆筒结构支架；C和D：卷折方式，可以卷成同心的多层圆筒结构支架)

具体实施方式

下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1.神经损伤动物建模和评价

a.犬坐骨神经损伤模型

选用幼年比格犬，腹腔内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉，取右侧股后部纵形切口，切开皮肤，分离肌肉显露右侧坐骨神经，用双面刀片切断坐骨神经。

b.犬脊髓横断模型

选用幼年比格犬，腹腔内注射戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉，在消毒条件下切开皮肤，分离肌肉，切除T9和T10脊柱椎板，并在T9椎板中位半横断脊髓(此处位于T9和T10脊髓节段分界处)，并切除右半侧2mm脊髓组织块，清除损伤腔内残留的神经纤维。

实施例2不同修复材料的制备

a.丝素蛋白导管

将蚕丝溶解在氯化钙、乙醇和水的三元体系中(摩尔比是氯化钙∶乙醇∶水＝1∶2∶8)，80℃加热处理5小时，将溶解的混合溶液装入纤维素膜袋，用蒸馏水透析，得到丝素蛋白溶液，注入模具，干燥后进行成型加工。再将初步成型的丝素蛋白导管放入体积比未50∶50的甲醇和氢氧化钠溶液处理2小时，然后先后用1mol/L的氢氧化钠溶液、50mmol/L磷酸盐缓冲液及蒸馏水清洗，得到丝素蛋白导管。

b.胶原蛋白支架

制备浓度为25mg/ml的胶原溶液，倒入模具后于-15℃冷冻80min，再放入冷冻干燥机中真空-60℃冻干25min，取出得长1.2cm直径1.2mm的柱状胶原材料，用拉制设备以每秒钟1.4mm的速度缓慢拉伸至原长度的2.5倍，然后在拉伸状态，将其置于-15℃冷冻80min，再放入真空-80℃进行二次冷冻干燥1.5h，得到内部含有有序细微管道的线型支架，即得胶原蛋白支架。

c.PLGA神经导管

乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA制备的神经导管制备如下：

①在烧瓶中将PLGA和1，4-二氧六环混合，混合比例为每克PLGA添加10mL1，4-二氧六环，在60℃下水浴搅拌加热，并冷凝回流约2h，得到均一溶液；

②将步骤①获得的溶液倒入两个试管中，分别加入直径为10μm以下的氯化钠颗粒和直径在50μm的氯化钠颗粒，用玻璃棒搅拌均匀，得到均匀混合物，其中PLGA溶液与直径为10μm以下的氯化钠颗粒的体积质量比1∶1；PLGA溶液与直径为50±20μm的氯化钠颗粒的体积质量比1∶3。

③用直径1.5mm的不锈钢棒蘸取加有10μm以下的氯化钠颗粒混合物，吹干，该操作重复一次。继续蘸取加有50μm的氯化钠颗粒混合物，吹干，该操作重复1次。置于通风橱中风干12h。将支架浸入去离子水中浸泡72h，洗出氯化钠颗粒。将不锈钢棒从已成型的支架上抽出。用双面刀片修剪支架两端至长度为12mm，得到直径为1.5mm、长度为12mm、管壁厚度为0.25mm的PLGA神经导管，置于干燥器内保存。

实施例3丝素-胶原-高分子聚合物的神经修复材料及其支架的制备

a.丝素-胶原-PLGA复合材料支架的制备：

(1)以易挥发有机溶剂配制浓度为0.05g/ml的PLGA溶液，倒入模具自然晾干，得到外观呈T型的厚度为50um的PLGA膜；

(2)配制浓度为5mg/ml的胶原溶液，倒在PLGA膜的玻璃片上，自然晾干得到附图2A型式的胶原-PLGA双层膜；

(3)将蚕丝溶解在氯化钙、乙醇和水的三元体系中(摩尔比是氯化钙∶乙醇∶水＝1∶2∶8)，80℃加热处理5小时，将溶解的混合溶液装入纤维素膜袋，用蒸馏水透析，得到丝素蛋白溶液，利用三维打印技术或高压静电纺织技术将丝素蛋白平行铺展在上述复合膜的胶原层表面，形成平行排列方式，并且高度上呈波谷状分布。

注：PLGA为乳酸-羟基乙酸共聚物。

b.丝素-胶原-PLA复合材料支架的制备：

(1)以易挥发有机溶剂配制浓度为0.2g/ml的PLA溶液，倒入模具自然晾干，得到外观呈T型的厚度为200um的PLA膜；

(2)配制浓度为10mg/ml的胶原溶液，倒在铺有PLA膜的玻璃片上，自然晾干后形成附图2A型式的胶原-PLA双层膜；

(3)将蚕丝溶解在氯化钙、乙醇和水的三元体系中(摩尔比是氯化钙∶乙醇∶水＝1∶2∶8)，80℃加热处理5小时，将溶解的混合溶液装入纤维素膜袋，用蒸馏水透析，得到丝素蛋白溶液，利用三维打印技术或高压静电纺织技术将丝素蛋白平行铺展在上述复合膜的胶原层表面，形成平行排列方式，并且高度上呈波谷状分布。

注：PLA为聚乳酸。

c.丝素-胶原-PGA复合材料支架的制备：

(1)以易挥发有机溶剂配制浓度为0.8g/ml的PGA溶液，倒入模具自然晾干，得到外观呈长方形的厚度为800um的PGA膜；

(2)配制浓度为20mg/ml的胶原溶液，倒在铺有PGA膜的玻璃片上，自然晾干后形成附图2B型式的胶原-PGA双层膜；

(3)将蚕丝溶解在氯化钙、乙醇和水的三元体系中(摩尔比是氯化钙∶乙醇∶水＝1∶2∶8)，80℃加热处理5小时，将溶解的混合溶液装入纤维素膜袋，用蒸馏水透析，得到丝素蛋白溶液，利用三维打印技术或高压静电纺织技术将丝素蛋白平行铺展在上述复合膜的胶原层表面，形成平行排列方式，并且高度上呈波谷状分布。

注：PGA为聚乙交酯。

以上各复合材料中还可以添加神经营养因子、微管蛋白抑制剂、羊毛甾醇或蜗牛蛋白酶，加入方式为：将这些成分溶解于胶原溶液中，然后再制备胶原膜。

实施例4实验对照组制备

a.胶原-PLGA复合材料支架：按照实施例3a丝素-胶原-PLGA复合材料支架的制备中的(1)和(2)方法，制备胶原-PLGA复合材料支架。

b.胶原-PLA复合材料支架：按照实施例3b丝素-胶原-PLA复合材料支架的制备中的(1)和(2)方法，制备胶原-PLA复合材料支架。

c.丝素-胶原复合材料支架：按照实施例3a丝素-胶原-PLGA复合材料支架的制备中的(1)和(2)方法，以玻璃片代替PLGA膜，制备丝素-胶原复合材料支架。

d.丝素-PLGA复合材料支架：按照实施例3a丝素-胶原-PLGA复合材料支架的制备中的(1)和(3)方法，以高分子聚合物膜代替胶原层进行丝素蛋白平行铺展，制备丝素-PLGA复合材料支架。

e.丝素-PLA复合材料支架：按照实施例3b丝素-胶原-PLA复合材料支架的制备中的(1)和(3)方法，以高分子聚合物膜代替胶原层进行丝素蛋白平行铺展，制备丝素-PLA复合材料支架。

f.丝素-PLA-胶原复合材料支架：采用实施例3b丝素-胶原-PLA复合材料支架的制备方法，但是分层设计改为丝素为内层、PLA为中层、胶原为外层，制备丝素-PLA-胶原复合材料支架。

g.胶原-PLGA-丝素复合材料支架：采用实施例3a丝素-胶原-PLGA复合材料支架的制备方法，但是分层设计改为胶原为内层、PLGA为中层、丝素为外层，制备胶原-PLGA-丝素复合材料支架。

h.PGA-丝素-胶原复合材料支架：采用实施例3c丝素-胶原-PGA复合材料支架的制备方法，但是分层设计改为PGA为内层、丝素为中层、胶原为外层，制备PGA-丝素-胶原复合材料支架。

以上各组，在实验中还可组合微管蛋白抑制剂、神经营养因子、透明质酸、羊毛甾醇和蜗牛蛋白酶等应用，具体应用见表1。

实施例5实验操作和效果评价

丝素-胶原-高分子聚合物的神经修复材料及其支架组：先从正常部分显露需行桥接的缺损神经的近心端和远心端，再逐步向损伤、粘连处剥离，游离两残端。如两残端已有假性神经瘤形成，则用锐刀片将残端神经瘤切除，至见到清楚的神经束为止。将神经外膜对称点用5-0丝线牵引后，轻轻向两侧呈袖套样翻转，显露两端神经束，正确辨认对应神经束后，将对应的神经束依次平行排列在同一凹槽内的丝素层，注意留有一定间隔，卷成同心的多层圆筒结构支架，或采用先折叠方式，而后进一步卷成同心的多层圆筒结构支架，最后将外层的高分子聚合物层与神经外膜进行手术缝合或黏合法吻合。缝合完毕后，充分止血后，逐层缝合肌肉和皮肤。术后每只动物腹腔内注射青霉素5万单位/d，连续注射3d，必要时给与补液，每天人工排尿。

其他实验组和对照组的操作，参考以上方法进行。

神经修复的效果评价指标如下：

犬坐骨神经损伤模型：随后的8周内，每周取受损部神经置于福尔马林液固定，然后石蜡包埋，在吻合部左右两端各1cm处做横切片，吻合部中段做纵切片，经染色后进行组织学观察，重点观察神经瘤是否形成、神经轴突再生程度和神经修复的速度。

犬脊髓横断模型：随后6周内，每周进行组织学观察，取损伤/移植区前后共1cm长的脊髓进行纵切片，切片隔5取1，检测移植区内部细胞迁移情况，重点观察神经瘤是否形成、神经轴突再生程度和神经修复的速度。

各试验组以不同时间的组织切片观察结果进行综合评分，对照未经任何处理的神经损伤同时期的情况，将修复情况划分为6级，“-”表示无神经修复效果或有较大神经瘤出现，*表示有神经修复效果，*越多表示神经修复的综合评分越高。

表1中对于含有胶原材料的各实验组，神经营养因子、微管蛋白抑制剂、干细胞、透明质酸、羊毛甾醇或蜗牛蛋白酶采用溶解于胶原溶液中的方式加入，对于不含胶原材料的各实验组，采用浸吸方式吸附于内层材料中。以占干燥后修复材料总质量的质量百分比计算，酸性成纤维细胞因子或角化细胞生长因子的质量百分比为的0.01％；微管蛋白抑制剂的质量百分比：埃博霉素B为0.5％、埃博霉素D为0.1％、沙戈匹隆(一种埃博霉素B的衍生物)为0.01％、紫杉醇为0.05％；透明质酸、羊毛甾醇和蜗牛蛋白酶的百分比值见表中数据。

从犬坐骨神经修复效果和犬脊髓神经修复效果两项评分结果可见，本发明所保护的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，能长时间维持神经再生最佳的理化和生物学微环境，具有明显的抑制神经瘤形成作用，并保持高效的神经轴突再生和神经修复的速度，明显高于已有报道的修复材料和非本发明的材料组合，差异结果具有显著性。

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于，所述复合材料是由丝素层-胶原层-高分子聚合物层依次排列组成，高分子聚合层呈T型或长方形设计，应用时通过折叠或卷折形成丝素层为内层、胶原层为中层、高分子聚合物层为外层的神经桥接支架。

2.根据权利要求1所述的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于：所述的丝素层的组成为蚕丝提取的丝素蛋白纤维，按照与对接缺损神经平行方向的方式排列，高度上呈波谷状分布。

3.根据权利要求1所述的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于：所述的胶原层中包含微管蛋白抑制剂、神经营养因子、透明质酸一种或几种组合。

4.根据权利要求1所述的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于：所述的胶原层或丝素层中包含干细胞、羊毛甾醇、蜗牛蛋白酶一种或几种组合。

5.根据权利要求1所述的一种用于桥接缺损神经的复合材料，其特征在于：所述的高分子聚合物采用生物相容性可降解高分子材料，包括聚乳酸、聚羟基乙酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙交酯-丙交酯、聚羟基丁酸酯、聚己内酯、聚乙醇酸、脂肪族聚酯、聚磷酸酯、聚碳酸酯、聚氨酯及它们的共聚物。

6.根据权利要求3所述的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于：所述的微管蛋白抑制剂选自：埃博霉素及其同类物或衍生物、紫杉醇及其同类物或衍生物、秋水仙碱及其同类物或衍生物、长春碱及其同类物或衍生物中的一种或几种组合。

7.根据权利要求3所述的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于：所述的神经营养因子选自：神经生长因子、脑源性神经生长因子、神经分裂素、睫状神经营养因子、白细胞介素-6、成纤维细胞生长因子、白细胞抑制因子、类胰岛素生长因子、胰岛素淀粉肽、表皮生长因子、胶质源性神经营养因子、血小板源性生长因子、转化生长因子β中的一种或几种组合。

8.根据权利要求3所述的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于：所述的干细胞选自：许旺细胞、骨髓间充质细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、神经干细胞或诱导多能干细胞中的一种或几种组合。

9.一种如权利要求1所述的用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)以易挥发有机溶剂配制浓度为0.05-0.8g/ml的高分子聚合物溶液，倒入模具自然晾干，得到厚度为50-800um的高分子聚合物膜，高分子聚合层呈T型或长方形；

(2)配制浓度为5-20mg/ml的胶原溶液，倒在铺有高分子聚合物膜的玻璃片上使均匀，自然晾干得到胶原--高分子聚合双层膜；

(3)利用三维打印技术或高压静电纺织技术将丝素蛋白平行铺展在上述复合膜的胶原层表面，形成与对接神经方向平行的方式排列，并且高度上呈波谷状分布的内层。

10.根据权利要求1所述的一种用于桥接缺损神经的复合修复材料及其支架，其特征在于，所述的丝素层-胶原层-高分子聚合物层的复合材料及其支架，用于中枢神经或周围神经的修复，结合缝合法或黏合法实现缺损神经的快速桥接和修复。