CN112957529A - 一种多层记忆型神经导管及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种多层记忆型神经导管及其制备方法和应用。所述方法包括如下步骤：S1、将胶原蛋白、黏多糖和酸溶液混合，制成乳化液；所述乳化液中胶原蛋白浓度为0.5‑0.7wt％，黏多糖浓度为0.04‑0.05wt％；S2、将所述乳化液进行真空冷冻干燥，制成第一胶原膜；S3、将所述第一胶原膜进行压制，制成第二胶原膜；S4、将所述第二胶原膜进行卷曲和定型，制成所述多层记忆型神经导管。本申请制备的多层记忆型神经导管具有制备工艺简单、使用方便如无需神经缝合、安全性好无毒性原料、对周围神经修复效果好等优点。

Description

一种多层记忆型神经导管及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种多层记忆型神经导管及其制备方法和应用。

背景技术

神经损伤尤其是周围神经损伤及脊髓损伤平面下的功能恢复是当今医学治疗的攻坚难题，日常生活中的机械损伤、意外事故等极易造成周神经系统不同深度的缺损，而周神经系统的损伤直接导致身体信号系统的传达中断，进而导致身体运动神经及感觉神经衰弱甚至缺失，并且相对于软组织及皮肤等部位的损伤，神经损伤的自我修复能力差，影响因素较多，进而导致伤口的处理能力更加困难，若神经断口未及时处理长合，在伤口处周围的结缔组织的分裂生长会破坏神经修复的微环境，导致在神经生长修复位置形成瘤状组织，形成不可逆的功能性障碍，给患者造成极大的不便。

根据患者受伤的严重程度可将周围神经的损伤分为短段神经损伤及长段神经损伤，短段神经有一定的自我修复能力，神经自身可无张力吻合，无需外在因素的帮助，而长段神经因为近端和远端距离较长，其自我修复能力较弱甚至无法自我修复，在这种前提下需要借助桥接物提供神经自我修复的微环境，促进神经近端的再生逐渐弥合周围神经，目前以神经导管桥接损伤神经的修复是当前研究的热点，可以有效作用于长段神经缺损的修复，新生的神经纤维在导管提供的微环境下由近端逐渐长入远端。

目前市面上应用到的生物神经修复材料多采用高分子复合材料及免疫反应较低的可降解类生物胶原蛋白类产品，但在临床应用中发现高分子材料较难降解，生物相容性差且有免疫排斥反应；胶原类神经导管在临床上神经修复效果明显，但存在降解速率较快，机械强度弱等问题，且当前市面上产品普遍存在缝合过程复杂，操作困难，目前大多数研究方向是增加机械强度以解决手术操作问题及防止软组织的植入。

针对生物相容性、机械强度、降解速率及临床易操作的产品，对周神经修复具有高效性及易缝合产品是当前临床应用过程新的研究方向。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种多层记忆型神经导管及其制备方法和应用。本发明提供的神经导管可以将受损的周围神经紧密结合，降低手术过程中受到的机械损伤。

一方面，本发明提供一种多层记忆型神经导管的制备方法，包括如下步骤：

S1、将胶原蛋白与黏多糖的酸溶液混合，制成乳化液，所述乳化液中胶原蛋白浓度为0.5-0.7wt％，黏多糖浓度为0.04-0.05wt％；

S2、将所述乳化液进行真空冷冻干燥，制成第一胶原膜；

S3、将所述第一胶原膜进行压制，制成第二胶原膜；

S4、将所述第二胶原膜进行卷曲和定型，制成所述多层记忆型神经导管。

在上述制备方法中，所述第一胶原膜的含水量为20～24％，该含水量可以保证后续卷曲和定型后导管无开裂现象；

和/或，所述第一胶原膜的厚度为3～5mm；

和/或，所述第一胶原膜的孔隙率为80～90％，孔径为30～50μm。

在上述制备方法中，所述真空冷冻干燥的出箱温度为1～10℃，优选1～6℃，更优选1～3℃。

该出箱温度低于环境温度，可以保证所述第一胶原膜的所述含水量即能均匀地保持上述含水量，使所述第一胶原膜的足够柔软，不需要进行额外的软化处理工艺，在后续的卷曲及定型过程中不会开裂。

具体地，所述真空冷冻干燥的过程如表1所示。

在上述制备方法中，所述第二胶原膜的厚度为1～1.5mm；

和/或，所述压制的时间为20～40s，压力强度为0.45～0.75MPa。

在上述制备方法中，所述卷曲的层数为2～4层，优选，3层，

该层数可以保证卷曲的神经导管在使用时展开，在放入神经导管后自动恢复卷曲的形状，且抗拉强度和抗顶破强度适中，修复过程中能够阻挡瘢痕组织长入导管内部，影响神经修复；

和/或，所述卷曲的最内层内径为0.1～1.0mm，优选，0.4-0.6mm；

和/或，所述卷曲的层间距为0.01～0.03mm，优选，0.01mm。

在上述制备方法中，所述定型的方式为高温真空固定、常压干燥或真空冷冻干燥，优选，高温真空固定；

所述高温真空固定的条件为温度103-107℃，压力-0.10～-0.09MPa，时间20-24h。

在上述制备方法中，所述定型后，还包括剪切和灭菌的步骤，优选的，所述灭菌的方法为环氧乙烷灭菌。

在上述制备方法中，所述胶原蛋白与所述黏多糖的质量比为(10-16):1，优选，(12-15):1，更优选，(13-14):1。

在上述制备方法中，所述胶原蛋白包括Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅺ型胶原蛋白、ⅩⅩⅩ型胶原蛋白、ⅩⅩⅩ型胶原蛋白或其任意组合，优选，Ⅰ型胶原蛋白，更优选的，所述Ⅰ型胶原蛋白来源于牛跟腱的Ⅰ型胶原蛋白。

在上述制备方法中，所述粘多糖为硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素或硫酸乙酰肝素，优选硫酸软骨素，具体为硫酸软骨素钠；

所述酸溶液包括乙酸溶液、盐酸溶液、和/或三氟乙酸；优选，乙酸溶液，更优选的，所述乙酸溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，更优选，0.03～0.07mol/L。

另一方面，本发明还提供一种多层记忆型神经导管，由包括以上任一所述方法制备得到。

另一方面，本发明还保护以上任一所述方法或所述多层记忆型神经导管在制备医用产品中的应用，所述医用产品具有神经损伤修复功能。

本发明的有益效果：

1、采用胶原蛋白材料易得，制作流程简单，不易受到供体来源及制作方式的制约，具有较好的组织相容性，低免疫原性，植入体内可在一定时间内自然降解，卷曲多层的结构提供了较强的力学强度；

2、与现有技术相比，本发明的卷曲式结构，避免了手术过程的缝合线的使用，同时降低了对周围神经及脊髓神经的机械损伤，其多层尤其是三层结构亦可保证神经导管具有较好的回弹及机械支撑性能，防止神经导管材料在体内微环境下结构的坍塌，同时层与层之间的孔隙有效防止结缔组织及分裂生长条件，避免影响正常细胞的分化增殖的桥接过程；

3、三层卷曲结构的设置及回弹性可根据神经的具体部位和尺寸自由调节导管直径以适应手术需要；

4、采用真空冷冻干燥技术获得的胶原膜具有稳定的三维立体结构，孔隙率在80～90％，孔隙大小30μm～50μm，具有良好的细胞粘附，增殖，迁移及生长的条件，促进神经轴突端由近端长入远端，刺激机体神经元的生长。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是多层记忆型神经导管示意图。

图2是多层记忆型神经导管横切面面扫描电镜图。

图3是多层记忆型神经导管纵切面面扫描电镜图。

图4是多层记忆型神经导管孔隙扫描电镜图。

图5是多层记忆型神经导管桥接模型。

具体实施方式：

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中使用的胶原蛋白为Ⅰ型胶原蛋白，来源于牛跟腱。

实施例1、多层记忆型神经导管的制备及性能检测

一、多层记忆型神经导管的制备

步骤1、乳化液制备

将胶原蛋白、硫酸软骨素钠和0.05mol/L冰醋酸溶液进行搅拌及均质，其中，胶原蛋白的浓度为0.6wt％，硫酸软骨素钠的浓度为0.044wt％，即胶原蛋白与硫酸软骨素钠的质量比为13.6:1，搅拌速度为30～50r/min，搅拌时间为5～10min，均质速度8000～10000r/min，均质40～50min，形成最终的胶原蛋白的乳化液。使用真空系统对乳化液进行空气抽取，去除乳化液内部的空气，避免后续真空冷冻干燥后的产品出现不平整。

步骤2、真空冷冻干燥：空气抽取后的乳化液用计量过的量筒量取乳化液倾倒至冻干模具(20cm*17.5cm)中，摇匀后置于冻干机板层，按表1所示参数进行真空冷冻干燥，通过低温升华去除胶原蛋白中的水分，在冷冻干燥工艺参数中出箱温度设置为1℃的低温出箱条件，得到第一胶原膜，其含水量为23.7％，厚度为4mm，孔隙率为80～90％，孔径为30～50μm。

表1真空冷冻干燥参数

步骤3、压制：将低温出箱的第一胶原膜取出置于压合机上压制，每张胶原膜单独压制，压制时间为30s，压力强度范围0.6±0.15MPa，压制厚度1.2±0.2mm，得到第二胶原膜。

步骤4、卷曲和定型：将第二胶原膜固定住一端，以316L材质不锈钢柱(长25cm，直径0.5mm)为中心轴逐层卷曲在不锈钢柱外表面，且各层间的胶原膜紧紧贴合，为保证其具有回弹效果，对其进行如下的高温真空固定(DHT)：温度105±2℃，压力-0.09MPa，高温固定24h。

在105±2℃的高温条件下胶原蛋白分子内部螺旋结构的氢键作用和胶原蛋白分子间作用力会增强胶原的机械性能，如抗拉强度及回弹膜量的增加，在此温度下胶原蛋白的交联及变性同时发生，但以交联为主。

步骤5、裁剪及灭菌：将步骤4中经过定型的导管利用灭菌的不锈钢刀片自内层往外取三层裁减，长度10～30mm，封入双层吸塑包装盒内，再进行环氧乙烷灭菌确保达到无菌保证水平。

二、性能检测

步骤一得到的多层记忆型神经导管如图1-4所示。将步骤一得到的多层神经导管做为样品按如下如下步骤1-4的性能检测。

1、抗拉强度：使用拉力机按GB/T528-2009方法检测样品抗拉强度性能，经过形变测量的安装来测量试样在测试的过程中发生的形变物理值。在该安装上有两个夹头，在经过一系列传感器与装在测量安装顶部的光电编码器连在一起，当两夹头之间的间隔发生转变的时候，带动光电编码器的轴扭转，光电编码器就会有脉冲旌旗灯号输出；其中，取五根裁切好样品，长度30mm，间距15mm，以10mm/min的速度进行试验，结果：抗拉强度平均为33.5N。

2、回弹模量：使用延展的方法检测回弹膜量，即神经导管经完全展开后可恢复至原样品的程度，取制作好的试样，记录原始最外层切面位置，做好标记，将试样延展开保持1min，待试样自然回弹后，再次记录外层切面位置，量取两次记录标记之间的距离，计算对应弧长占整个圆周的比例，减去此比例即为回弹膜量，结果：回弹膜量在95％以上。

3、胀破强力：使用胀破仪按YY0050-2004中8.3.3.1进行试验，运用液压递增法原理，使用微电脑检测控制系统和数字信号处理技术测定试样胀破强度，将试样平整放在橡胶模上，使压盘下降紧锁试样，然后均匀对橡胶膜施加压力，使试样随着橡胶膜膨胀两个凸起，直至试样破裂为止，然后读取胀破强度值；其中，试验面积7.3cm²，液体体积增长速率100cm³/min，取5根样品，每根样品分别检测5次胀破压力并连续检测5次胶膜压力，计算平均胀破压力和平均胶膜压力，样品的平均胀破压力减去平均胶膜压力，得到胀破强力，结果：平均胀破强力为43.8KPa。

4、支撑性能：使用YY0050-2004中8.3.3.1检测机械支撑性能，依据步骤3胀破强力的方法实施，根据断裂状态下试样移动的高度(mm)判断试样的支撑性能，结果：平均支撑性能为4.9mm。

三、神经修复检测

将步骤一得到的多层记忆型神经导管展开，将成年大鼠坐骨神经缺损处放入展开的导管内，用止血钳固定神经断裂处和导管的连接处，并使导管恢复展开前的多层卷曲状态，2min后取下止血钳，无神经缝合操作，对术后大鼠的神经缺损处的修复效果进行连续12周动态评估，以未经上述神经修复的正常大鼠为对照。

结果：大鼠坐骨神经在术后60天修复，且下肢至足部行动恢复正常，与正常大鼠对照无明显区别，神经导管桥接如图5所示，导管的多层结构中层与层之间的孔隙能够有效防止结缔组织分裂生长条件，神经能够正常桥接。

对比例1、出箱温度过高对导管性能的影响

按实施例1步骤一的方法制备神经导管，不同之处在于：出箱温度为15℃。

按实施例1步骤二的方法进行性能检测抗拉强度和胀破强力，结果如下：

抗拉强度平均值为15N，明显低于实施例1的33.5N，

胀破强力23.1KPa，明显低于实施例1的43.8KPa。

结果表明：与实施例1相比，出箱温度过高，导致了第一胶原膜含水量降低为15.4％，软化程度较低，在压制、卷曲和定型步不能紧密卷曲，致神经导管层与层之间孔隙较大，导管内径变大，因过于干燥致卷曲过程使第一胶原膜出现部分裂纹，进而导致机械性能降低如原膜较脆，最终导致机械性能变化如抗拉强度和胀破强力降低。

对比例2、定型方式不同对导管性能的影响

按实施例1的方法进行，不同之处在于：定型采用常温常压固定方法进行。

按实施例1步骤二的方法进行性能检测，结果：常温常压固定下抗拉强度为9.6N，常温下固定虽然导致胶原蛋白变性的比例比较低但同时亦使交联度明显降低，使产品的力学性能下降明显，即定型方式和条件不同，导致导管抗拉性能明显降低。

对比例3、定型方式不同对导管性能的影响

按实施例1的方法进行，不同之处在于：定型采用高温常压固定方法进行。

高温常压固定下抗拉强度为27.6N，和高温真空固定条件下有差别，但差别不大，真空状态能更快速的取出产品中的水分子，促进自由-NH2官能团到-NH官能团的转变，常压下由于水分子逸出速度降低导致官能团的转换速率降低，进而影响了交联速度，结果：需要固定的时间延长了约1倍。

对比例4、乳化液组成不同对导管性能的影响

按实施例1步骤一的方法进行，不同之处在于：乳化液中硫酸软骨素钠的含量为0.03wt％，胶原蛋白的含量为0.6wt％，胶原蛋白与硫酸软骨素钠的质量比为20:1。

按实施例1步骤二的方法进行性能检测，结果：抗拉强度为11.2N，胶原蛋白与硫酸软骨素钠的质量比过高时，不能完全结合形成纤维状，导致导管粘性、抗拉性能明显降低。

按实施例1步骤三的方法进行神经修复检测，结果：神经与导管之间不能有效粘合，神经缺损处容易脱落，无法正常修复。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种多层记忆型神经导管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将胶原蛋白、黏多糖和酸溶液混合，制成乳化液，所述乳化液中胶原蛋白浓度为0.5-0.7wt％，黏多糖浓度为0.04-0.05wt％；

S2、将所述乳化液进行真空冷冻干燥，制成第一胶原膜；

S3、将所述第一胶原膜进行压制，制成第二胶原膜；

S4、将所述第二胶原膜进行卷曲和定型，制成所述多层记忆型神经导管。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一胶原膜的含水量为20—24％；

和/或，所述第一胶原膜的厚度为3～5mm；

和/或，所述第一胶原膜的孔隙率为80～90％，孔径为30～50μm。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥的出箱温度为1～10℃，优选，1～6℃，更优选，1～3℃。

4.如权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，所述第二胶原膜的厚度为1～1.5mm；

和/或，所述压制的时间为20～40s，压力强度为0.45～0.75MPa。

5.如权利要求1-4中任一所述的制备方法，其特征在于，所述卷曲的层数为2～4层，优选，3层；

和/或，所述卷曲的最内层的内径为0.1～1.0mm，优选，0.4-0.6mm；

和/或，所述卷曲的层间距为0.01～0.03mm，优选，0.01mm。

6.如权利要求1-5中任一所述的制备方法，其特征在于，所述定型的方式为高温真空固定、常压干燥或真空冷冻干燥，优选，高温真空固定；

所述高温真空固定的条件为温度103-107℃，压力-0.10～-0.09MPa，时间20-24h。

7.如权利要求1-6中任一所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白与所述黏多糖的质量比为(10-16):1，优选，(12-15):1，更优选，(13-14):1。

8.如权利要求1-7中任一所述的制备方法，其特征在于，所述胶原蛋白包括Ⅰ型胶原蛋白、Ⅱ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、Ⅺ型胶原蛋白、ⅩⅩⅩ型胶原蛋白、ⅩⅩⅩ型胶原蛋白或其任意组合，优选，Ⅰ型胶原蛋白，更优选，来源于牛跟腱的Ⅰ型胶原蛋白；

所述粘多糖为硫酸软骨素、透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸角质素或硫酸乙酰肝素，优选，硫酸软骨素；

所述酸溶液包括乙酸溶液、盐酸溶液、和/或三氟乙酸；优选，乙酸溶液，更优选的，所述乙酸溶液的浓度为0.01-0.1mol/L，更优选，0.03～0.07mol/L。

9.一种多层记忆型神经导管，其特征在于，由包括权利要求1-8中任一所述方法制备得到。

10.权利要求1-8中任一所述方法或权利要求9所述多层记忆型神经导管在制备医用产品中的应用，所述医用产品具有神经损伤修复功能。

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