KR101434041B1 - 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체조직 유래 소재를 분쇄하여 섬유형태로 제작한 후 필터 방법을 이용하여 멤브레인 형태로 제조되는 재생 유도용 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인 제조방법{ and method of preparing membrane for leading regeneration produced from material derived from biological tissue}

본 발명은 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체조직 유래 소재를 분쇄하여 섬유형태로 제작한 후 필터 방법을 이용하여 멤브레인 형태로 제조되는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법에 관한 것이다.

조직이나 장기가 손상을 받으면 정상적 치유과정에서 섬유상 흉터 조직 형성을 일으킨다. 이러한 섬유상 조직 형성은 정상 조직의 재생을 방해하는데 특히 골 조직 재생에서 주변 섬유조직의 침투는 정상적 골 형성을 방해하므로, 섬유조직 침투를 막고자 유도 골 재생(Guided Bone regeneration; GBR) 또는 유도 조직 재생(Guided Tissue Regeneration; GTR)술이 개발되었다. 또한, 신경 손상(특히, 말초신경)에서도 섬유조직 침투가 정상적 신경 조직 재생을 방해하므로 주변 섬유조직의 침투를 차단하는 신경재생용 멤브레인이 개발되었다.

이러한 멤브레인은 비분해성과 분해성으로 나눌 수 있는데, 최근 이차 제거가 불필요한 분해성 소재가 많이 연구되고 있다. 조직 유도 재생용 멤브레인의 특성으로는 생체적합성이 우수하여야 하고, 섬유 세포의 침투는 막고 영양분 공급은 가능한 반투과막 특성을 가지며, 정상 조직이 재생할 수 있도록 적절한 분해기간을 가져야 한다.

기존의 생체유래 소재 제품은 2차 가공이 어려워 채취된 조직의 형태와 물성과 유사하여 여러 적응증에 적용하기 어려운 문제점이 있다. 또한 콜라겐의 경우 원료의 단가가 높고 멤브레인으로 제조 시 물성이 약하다는 단점이 있다. 미국공개특허 제2011/10021754 A1호에서는 바이오폴리머를 이용하여 모든 방향에서 유사한 물리적 특성을 갖는 멤브레인의 제조 방법에 관한 것으로 두께 0.05 ~ 1.5 ㎜, 밀도 0.1 ~ 1.2 g/㎤, 변성온도 45 ~ 80 ℃, 봉합찢김강도 0.1 ~ 5 kgf, 인장강도 20 ~ 250 kg/㎠ 및 투과도 50 ~ 100,000 달톤을 갖는 멤브레인을 특징으로 한다. 미국특허 제5,837,278호는 조직유도재생용 흡수성 콜라겐 멤브레인에 관한 것으로 동물의 근막을 알칼리와 산을 처리하여 제조하는 것을 특징으로 한다. 미국특허 제6,713,085 B2호에서는 콜라겐 멤브레인을 이용한 점막조직 재생에 관한 것이며, 미국공개특허 제2010/0055149 A1호에서는 신경재생용 콜라겐 멤브레인에 관한 것을 특징으로 한다. 상기 선행 특허의 경우 근막 등의 조직 유래 소재를 알칼리와 산으로 처리하여 사용하거나, 콜라겐을 이용하여 조직재생용 멤브레인을 제작하는 것으로 조직 유래 소재의 경우 두께나 형태 조절이 어렵고, 콜라겐을 이용하는 경우 물성이 약한 단점이 있다.

이에 본 발명자들은 종래보다 우수한 가공성과 물성을 얻기 위한 연구와 실험을 거듭하여 본 발명을 제안하게 된 것으로, 본 발명의 목적은 재생 유도용 멤브레인 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 생체조직 유래 소재를 분쇄한 후 필터 방법을 사용하여 우수한 물성을 가진 다양한 크기와 두께의 재생 유도용 멤브레인 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

그리고 본 발명의 목적은 결손 되거나 기능이 저하된 조직의 수복 및 재생에 사용될 생체 소재로서, 두께 0.01 ~ 1.5 ㎜, 변성온도 40 ~ 95 ℃, 봉합찢김강도 1 ~ 20 kgf, 인장강도 0.1 ~ 3 N/㎟을 갖는 재생유도용 멤브레인 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적으로 생체조직 유래 소재는 면역 및 이물반응 유발 물질인 세포, 유전자, 지방 및 바이러스와 엔도톡신을 효율적으로 제거 가능한 탈세포 처리제로 처리함으로써 결과적으로 생체적합성이 우수하고, 생체 이식에 적합한 강도를 갖는 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 콜라겐을 주성분으로 가지며, 두께는 0.01 ~ 1.5㎜, 변성온도는 40 ~ 95℃, 봉합찢김강도는 1 ~ 20kgf, 인장강도는 0.1 ~ 3N/㎟임을 특징으로 하는 재생 유도용 멤브레인을 제공한다.

또한, 본 발명은 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인으로서 (a) 생체조직 유래 소재를 팽윤시키는 단계; (b) 상기 팽윤시킨 소재를 섬유상으로 분쇄하는 단계; 및 (c) 상기 분쇄된 섬유상을 필터를 이용하여 멤브레인을 제조하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 재생 유도용 멤브레인은 생체적합성이 우수할 뿐만 아니라, 다양한 두께나 형태로 가공하기 쉽고, 생체 이식에 적절한 강도 및 분해 기간을 가지고 있어, 연조직 재건 및 조직 재생용 차폐막으로 유용한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 재생 유도용 멤브레인의 사진이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 재생 유도용 멤브레인의 표면과 단면을 주사전자현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 재생 유도용 멤브레인과 종래기술에 따른 멤브레인의 인장강도를 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 재생 유도용 멤브레인과 종래기술에 따른 멤브레인의 봉합찢김강도를 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따라 제조된 재생 유도용 멤브레인의 용출물을 첨가한 실험군, 음성 대조군 및 배지 대조군의 세포 독성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 재생 유도용 멤브레인과 종래기술에 따른 멤브레인의 콜라게나아제 저항성 분석을 도시한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따라 제조된 재생 유도용 멤브레인의 변성온도를 열분석을 통하여 도시한 그래프이다.

본 발명은 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인의 제조방법으로서, (a) 생체조직 유래 소재를 팽윤시키는 단계; (b) 팽윤시킨 소재를 섬유상으로 분쇄하는 단계; 및 (c) 분쇄된 섬유상을 필터를 이용하여 멤브레인을 제조하는 단계;를 포함하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예로서 생체조직 유래 소재로부터 제조된 재생 유도용 멤브레인의 제조방법으로서, (a) 생체조직 유래 소재를 팽윤시키는 단계; (b) 상기 팽윤시킨 소재를 섬유상으로 분쇄하는 단계; (c) 상기 분쇄된 섬유상을 필터를 이용하여 멤브레인을 제조하는 단계; 및 (d) 상기 멤브레인을 가교 처리하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

상기 재생 유도용 멤브레인은 0.01㎜ 내지 1.5㎜의 두께를 가지며, 그 크기는 1㎠ 내지 100㎠인 것을 특징으로 한다.

이와 같은 처리를 통하여 수득된 재생 유도용 멤브레인은 콜라겐과 엘라스틴을 주성분으로 갖고 있으며, 두께 0.01 ~ 1.5㎜(구체적으로는 0.1 ~ 0.5㎜), 변성온도 40 ~ 95℃(구체적으로는 65 ~ 70℃), 봉합찢김강도 1 ~ 20 kgf(구체적으로는 7 ~ 12 kgf), 인장강도 0.1 ~ 3 N/㎟(구체적으로는 1 ~ 2 N/㎟)을 가지는 생체적합성이 우수하고, 세포 친화적인데다 면역적합성 또한 우수하다.

상기 생체조직 유래 소재를 사용하여 만든 재생 유도용 멤브레인은 탈장 치료용 생체막, 피부 재생용, 연골 재생용, 경막 재생용, 성형 보형용, 내부 장기 및 연조직 재생용 등과 같은 연조직 재건용도 혹은 조직 수복 용도의 이식재로 사용될 수 있으며, 세포 또는 성장인자 등의 전달체로서 사용될 수도 있다.

본 발명은 생체유래 소재를 사용하여 생체 친화성 및 물성이 우수한 재생 유도용 멤브레인의 제조하기 위하여 다음과 같은 공정을 거친다.

(a) 생체조직 유래 소재를 팽윤시키는 단계;

(b) 상기 팽윤시킨 소재를 섬유상으로 분쇄하는 단계;

(c) 상기 분쇄된 섬유상을 필터 방법을 이용하여 부직포 형태의 멤브레인을 제조하는 단계; 및

(d) 물성과 분해기간을 증진시키기 위하여 가교 처리하는 단계로 이루어진다.

본 발명에 있어서, 상기 생체조직 유래 소재는 소, 돼지 또는 말의 뼈, 연골, 치아, 혈관, 근막, 심근막, 소장점막하조직, 양막, 경막, 피부, 방광 및 인대로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 팽윤시키는 단계는 정제수, 산 용액, 알칼리 용액에서 실시 될 수 있는데, 상기 산은 염산, 아세트산 및 퍼아세트산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 상기 알칼리는 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 분쇄시키는 단계는 블렌드, 그라인딩 밀, 호모게나이저 등을 사용할 수 있으며, 분쇄한 섬유 크기는 10 ~ 2,000 ㎛일 수 있으며, 더 적절하게는 1000 ㎛ 정도의 섬유 크기일 수 있다.

본 발명에 있어서, (c) 필터를 이용하여 멤브레인을 제조하는 단계는 스테인레스 스크린 및 진공을 사용하여 수분을 제거할 수 있으며, 상기 스크린의 메쉬 크기는 10 ~ 1,000㎛인 것이 사용하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (d) 가교 처리 단계는 화학적 가교 처리 또는 열가교 처리 등으로 처리할 수 있다.

화학적 가교 처리는 헥사메틸렌디이소시아네이트, 에폭시 그룹, 카르보이미드, 또는 아실아자이드 등과 같은 화학적 가교제를 이용하여 처리할 수 있다.

열가교는 50 ~ 100torr 진공도에서 50 ~ 200℃ 사이에서 실시하여 처리할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 재생 유도용 멤브레인의 제조방법에 의하여 제조된 재생 유도용 멤브레인을 제공한다.

상기 재생 유도용 멤브레인은 콜라겐을 주성분으로 가지며, 변성온도는 40 ~ 95℃, 봉합찢김강도는 1 ~ 20kgf, 인장강도는 0.1 ~ 3N/㎟임을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[실시예]

실시예 : 재생유도용 멤브레인의 제조

<생체조직 유래 소재의 팽윤>

생체조직 유래 소재를 가위나 칼 또는 분쇄기를 사용하여 1㎠ 내외로 자르거나 분쇄하였다. 분쇄한 샘플은 정제수에 무게비로 2%의 농도로 넣은 후 4℃ 냉장고에서 팽윤시키기 위하여 24시간 방치하였다.

<섬유상 분쇄>

팽윤된 생체조직 유래 소재를 블랜더나 호모게나이저를 이용하여 약 5분간 3회 정도 분쇄하였다. 분쇄한 샘플은 눈금 크기 1㎜ 메쉬 망을 이용하여 분쇄되지 않은 샘플을 제거하였다.

<멤브레인의 제조>

직경 12㎝ 뷰흐너 깔대기에 50메쉬 스테인레스 스크린을 받치고 분쇄된 조직유래 섬유 50㎖ 넣고 1000psi 정도로 감압하여 수분을 제거하였다. 수분 제거 후 - 20℃에서 동결한 후 동결건조 하였다. 이때 제조한 샘플 두께는 200 ~ 300㎛ 사이로 측정되었다.

<가교 처리>

물성 및 분해기간을 증진하기 위하여 가교 처리를 수행하였다. 가교는 화학적 가교제인 헥사메틸렌디이소시아네이트(hexamethylene di-isocyanate, HMDI)를 사용하였다. 순도 99% 이상 아세톤에 1% 농도의 HMDI를 넣어 200 ㎖의 가교제 용액을 제조한 후 제조된 멤브레인을 넣고 30 ℃에서 48시간 가교 하였다. 가교 후 아세톤으로 3회 세척 하고 정제수로 다시 3회 세척하여 잔존 가교제 및 아세톤을 제거하였다.

[시험예]

상기 실시예에서 제조된 재생 유도용 멤브레인은 도 1과 같으며, 하기와 같은 방법을 이용하여 멤브레인의 물성을 측정하였다.

<인장강도 측정>

만능물성측정기(Universal Testing Machine, 3366, Instron)를 이용하여 생체친화형 멤브레인의 인장강도를 측정하였다. 제조한 생체친화형 멤브레인을 5㎜ × 20㎜ 크기로 절단한 후 PBS에 24시간 수화 시킨 후 인장 강도를 측정하였다. 수화된 시편의 단면적을 측정한 후 로드셀에 연결된 지그에 장착하고 20㎜/min 의 속도로 잡아 당겨 파손될 때의 최대 인장 강도와 변형률을 측정하였다. 측정된 최대 인장 강도를 단위 면적당 강도로 계산한 최대 인장 응력으로 비교를 진행하였다. 시험 결과(도 3) 자사 멤브레인의 경우 평균 2.07N/㎟, 근막 유래 제품인 G사 멤브레인은 1.76 N/㎟, 콜라겐 유래 제품인 O사 멤브레인은 2.67 N/㎟를 나타내었다.

<봉합찢김강도 측정>

만능물성측정기(Universal Testing Machine, 3366, Instron)를 이용하여 생체친화형 멤브레인의 봉합강도를 측정하였다. 제조한 생체친화형 멤브레인을 5㎜ × 20㎜ 크기로 절단한 후 PBS에 24시간 수화 시킨 후 봉합찢김강도를 측정 하였다. 시편에서 2 ~ 3㎜부분에 4-0 나일론 봉합사를 멤브레인에 봉합한 후 멤브레인과 봉합사를 로드셀에 연결된 지그에 장착하고 20 ㎜/min 의 속도로 잡아 당겨 멤브레인이 찢어질 때의 최대 강도를 측정하였다. 시험 결과(도 4) 자사 멤브레인의 경우 평균 1.13N, G사 멤브레인은 1.32N, O사 멤브레인은 0.37N을 나타내었다. 콜라겐 멤브레인의 경우 인장강도는 강하지만 봉합찢김강도가 약해 시술 시 멤브레인에 직접 봉합하는 것이 어려울 수 있었다.

<SEM 이미지 분석>

주사전자현미경(scanning electron microscope, JEOL, JSM-6380, 일본; 20KV)을 이용하여 생체친화형 멤브레인의 미세구조를 분석하였다. 멤브레인의 표면과 단면을 촬영한 결과(도 2) 대부분 막힌 구조와 미세한 다공을 관찰할 수 있었다.

<세포독성 분석>

제조된 멤브레인의 생물학적 안전성을 확인하기 위하여 ISO 10993-5를 근거로 세포 독성 시험을 실시하였다. 구체적으로는 세포주(cell lines)로서 American Type Culture Collection CCL1(NCTC clone 929)을 배양액 (DMEM + 10%FBS +1% 페니실린-스트렙토마이신)으로 배양하였다. ISO 10993-12를 근거로 실시예 1, 비교예 1과 2에서 수득된 생체 재료를 37도에서 24시간 동안 용출하였으며 이를 이용하여 세포 독성 평가를 진행하였다.

용출물의 세포독성에 대한 정량적 측정법으로 MTT cytotoxicity test를 사용하였다. 본 특허에서 제작된 생체 재료에 대한 세포 독성 결과는 도 5에 나타내었다. 본 특허에서 제작된 생체 재료의 용출물을 첨가한 실험군과 음성 대조군, 배지 대조군을 각각 비교하였을 때 실시예에서 수득한 생체 재료에 대한 세포 독성은 없는 것을 확인하였다.

<콜라게나아제 저항성 분석>

콜라게나아제 저항성은 콜라겐 유래 제품의 분해기간을 생체외 환경에서 분석할 수 있는 방법으로 콜라게나아제 저항성이 높을수록 생체내 분해기간이 길다고 예상할 수 있다. 콜라게나아제 용액은 PBS에 Collagenase (260U/mg, Worthington, 4169)를 30U/㎖의 농도로 녹여 준비하였다. 샘플을 일정크기(5 × 5㎜)로 잘라 15㎖의 튜브에 담은 후 샘플 무게 대비 10㎎/㎖의 콜라게나아제 용액을 넣은 후 37℃ 50rpm의 교반 항온기에 넣어 처리 하였다. 4, 8, 및 12시간 후 샘플을 수거하여 정제수로 세척 한 후 동결 건조하여 무게를 측정하였다. 시험 결과(도 6) 자사 멤브레인이 가장 우수한 콜라게나아제 저항성을 보였다.

<변성온도 측정>

열분석을 통해 재생유도 멤브레인이 가진 변성온도를 분석하였다. 열분석기(METTLER TOLEDO, DSC1 STARe SYSTEM)를 통하여 온도 변화에 따른 시료의 무게 변화를 측정하여 분석하는 방법으로 온도와 무게 변화량으로 재생유도 멤브레인의 열변화 특성을 확인할 수 있다.

재생유도 멤브레인 칭량 후 셀에 넣고 기준물질을 넣은 후 검체와 기준물질 간에 발생하는 온도차를 측정하였다.(공기 중 산소와 고분자 시료의 반응 등을 방지하기 위해 질소가스를 30㎖/min로 공급하고 Heat rate를 5℃/min로 하여 분석한다). 분석 결과 67℃ 내외의 변성온도를 확인할 수 있었다.

Claims (11)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. (a) 소, 돼지 또는 말의 뼈, 연골, 치아, 혈관, 근막, 심근막, 소장점막하조직, 양막, 경막, 피부, 방광 및 인대로 이루어진 군으로부터 선택된 생체조직(인간 제외) 유래 소재 자체를 용매에 침지시켜 팽윤시키는 단계;
   (b) 상기 팽윤시킨 소재를 블렌드 또는 호모게나이저를 사용하여 입자 크기 10 내지 2000 ㎛의 콜라겐 섬유상으로 분쇄하는 단계; 및
   (c) 상기 분쇄된 콜라겐 섬유상을 필터를 사용하여 용매를 제거하여 두께가 200 내지 300㎛인 부직포 형태의 멤브레인을 제조하는 단계;를 포함하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 (c) 단계 이후에 상기 멤브레인을 가교 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법.
7. 제 5항에 있어서,
   상기 (a) 단계는 정제수, 산 용액 또는 알칼리 용액에서 수행되며, 상기 산은 염산, 아세트산 및 퍼아세트산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되고, 상기 알칼리는 수산화나트륨, 수산화칼륨 및 수산화칼슘으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법.
8. 삭제
9. 제 5항에 있어서,
   상기 (c) 단계는 10 ~ 1,000㎛ 메쉬 크기의 스크린 및 진공을 사용하여 수분을 제거하는 것을 특징으로 하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법.
10. 제 5항에 있어서,
    상기 (c) 단계를 실시함으로써 용매를 제거한 멤브레인에 1,000 ~ 5,000psi의 압력을 가하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 재생 유도용 멤브레인의 제조방법.
11. 제 6항에 있어서,
    상기 가교 처리는 화학적 가교 처리 또는 열가교 처리인 것을 특징으로 하는 재생 유도용 멤브레인의 제조방법.

Images