KR101848289B1

KR101848289B1 - 동물 유래 조직을 이용한 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법

Info

Publication number: KR101848289B1
Application number: KR1020160062153A
Authority: KR
Inventors: 최형배
Original assignee: 디엠씨휴먼사이언스 주식회사
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2016-05-20
Publication date: 2018-04-12
Also published as: KR20170131032A

Abstract

본 발명은 천연 하이드록시 아파타이트를 포함하는 골 이식재 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물유래 조직을 활용함에도 지방질 및 단백질을 비롯한 유기 물질의 완전한 제거가 가능하고, 염증 및 질환을 유발하는 감염성 위해 인자로부터 안정성이 확보되는 동시에 뼈를 구성하는 무기질 성분 중 주성분인 천연 하이드록시 아파타이트만이 순수한 형태로 포함된 골 이식재 제조 방법을 제공하는 것이다.

Description

동물 유래 조직을 이용한 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법{Animal-derived tissue manufacturing method using the natural hydroxy apatite}

본 발명은 천연 하이드록시 아파타이트를 포함하는 골 이식재 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물 유래 조직에 포함된 천연 하이드록시 아파타이트가 순수한 상태로 포함되면서 면역거부반응이 없고, 바이러스 및 광우병을 유발하는 프라이온 단백질이 완전히 제거된 동물 유래 조직을 이용한 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법에 관한 것이다.

골 이식재는 다양한 외상, 질병, 퇴화 및 치과 질환 등에 의해 뼈 조직의 결손부가 생긴 경우, 이를 대체하여 뼈 조직 내 공간을 충진시키고, 신생골 형성의 촉진을 위해 사용되는 것을 말한다. 골 이식재는 생체 유래의 자가골, 동종골, 이종골 및 인공적으로 제조되는 합성 골이식재로 크게 분류된다.

이중 합성 골이식재는 바이러스 및 질병의 감염 가능성은 없으나, 생체유래골에 비하여 골재생능이 떨어지고, 흡수가 너무 빠른 문제가 있다. 따라서 생체유래의 골이식재가 더욱 관심을 받고 있는바, 자가골의 경우 수술이 요구되고 체내 흡수가 매우 빠르며, 동종골은 면역반응의 우려와 바이러스 및 질병의 감염 가능성이 있으므로, 사람의 뼈와 비슷한 구조를 가진 동물의 뼈에서 유래된 이종골 이식재의 사용이 주목받고 있으며, 공개특허 제10-2001-0048219호, 미국등록특허 제5,167,961호, 미국등록특허 제5,417,975호 등의 다수의 기술들이 있다.

그런데 동물의 뼈에서 이종골 이식재를 사용하기 위해서는 이종단백질을 비롯한 여러 불순물을 제거하여 인체의 골조직 성분과 유사한 화학 조성을 지니도록 제조하고, 순수한 아파타이트만이 존재하도록 하는 것이 매우 중요하다.

종래 국내 등록특허 제10-0871396호에서는 유기용매에 침적한 동물 뼈를 건조하고, 건조된 동물 뼈를 이온 교환 시킨 후 열처리함으로써 체내 임플란트 시 염화 아파타이트가 용해되면서 탄산 아파타이트가 스스로 수산화아파타이트 표면에 생성되도록 하는 생체활성 염화/수산화 이중구조형 아파타이트 및 이의 제조 방법이 제시된 바 있다.

국내 등록특허 제10-1348335호 및 제10-1348335호에서는 뼈 분말에 유기용매 및 열처리함으로써 지방질과 단백질을 3차례에 걸쳐 제거하고, 제거된 뼈 분말의 표면을 산성 아미노산으로 처리한 방법이 제시된 바 있다.

그러나, 상기 기술들은 지방질과 단백질을 비롯한 여러 부유 물질의 제거에 있어서 단지 유기용매 및 열처리를 하는 정도에 불과하여, 유기용매로 분해되어 녹아들지 못한 지방질이 해당 뼈 분말에 여전히 잔여하거나 변형되어, 체내 임플란트 시 면역거부반응 및 다른 질병을 유발하거나 골의 성장을 방해하는 문제점이 있다.

Broz, J. J, et al., J. Mater. Sci. Mater. Med., 8:395, 1997

상기의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 동물유래 조직을 활용함에 있어 지방질 및 단백질을 포함하는 유기 물질의 완전한 제거를 하는데 목적이 있다.

또 본 발명은 염증 및 질환을 유발하는 감염성 위해 인자로부터 안정성이 확보되고, 뼈를 구성하는 무기질 성분 중 주성분인 천연 하이드록시 아파타이트만이 순수한 형태로 포함된 골 이식재 제조 방법을 제공하는 데 또 다른 목적이 있다.

상기의 목적을 해결하기 위한 본 발명의 특징은 동물 뼈로부터 블럭형 골 조직을 분리하여 세척하는 전처리 단계(S10); 에틸에테르, 아세톤, 헵탄, 메탄올, 알코올 중 2개 이상을 선택하고, 상기 선택된 유기용매 내에 각각 초음파를 제공하면서 상기 S10의 블럭형 골 조직을 순차적으로 투입하는 1차 유기질 제거 단계(S20); 상기 S20의 블럭형 골 조직을 건조 및 분쇄하는 단계(S30); 에틸에테르, 아세톤, 헵탄, 메탄올, 알코올 중 2개 이상을 선택하고, 상기 선택된 유기용매 내에 각각 초음파를 제공하면서 상기 S30의 골 조직 분말을 순차적으로 투입하고, 탈 이온수 세척하는 2차 유기질 제거 단계(S40); 상기 S40의 골 조직 분말을 0.1M~1.0M 강알칼리 용액에 침적한 후 0.5N~1N 강산 용액에 침적하여 면역원 및 바이러스를 제거하고 세척하는 단계(S50); 상기 S50의 골 조직 분말을 분당 1~5℃ 승온한 100℃~700℃의 고온에서 40시간 이상 고온 처리하는 3차 유기질 제거 단계(S60); 상기 S60의 골 조직 분말을 분리하여 멸균하는 후처리 단계(S70);를 포함하여 이루어지는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 상기 S10 단계는 블럭형 골 조직을 1~2bar 조건에서 100℃~150℃에서 30분~2시간동안 고압증기 세척을 진행하고, 이어서 1~3시간 동안 초음파가 제공되는 조건에서 탈 이온수 100 중량부 기준 10~30 중량부의 블록형 골 조직을 상기 탈 이온수에 투입하여 세척하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 S20단계에서는 100% 에틸에테르에 S10 단계의 블럭형 골 조직을 침적하여 4시간 동안 초음파 처리하여 1차 분획한 후, 1차 분획된 골 조직을 70% 알코올에 재침적하여 3시간동안 초음파 처리하여 2차 분획하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 S40단계에서는 상기 S40단계에서는 100% 에틸에테르에 S30 단계의 골 조직분말을 침적하여 2시간 동안 초음파 처리하여 1차 분획한 후, 1차 분획된 골 조직분말을 70% 알코올에 재침적하여 3시간동안 초음파 처리하여 2차 분획하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 S50단계에서는 강알칼리 용액과 강산 용액에 침적한 후, 100℃~150℃에서 1시간~2시간 및 1bar~2bar 조건에서 고압증기 세척을 진행하는 것을 특징으로 한다.

삭제

또한, 상기 S70단계에서는 상기 S70단계에서는 탈 이온수 100 중량부 기준 10~30 중량부의 S60의 골 조직 분말을 상기 탈 이온수에 투입하여 2시간 동안 초음파가 제공되는 조건에서 세척한 후, 30℃~60℃에서 건조하고, 건조된 골 조직 분말을 0.1mm~4.0mm로 분리하는 것을 특징으로 한다.

삭제

이상의 구성에 따르면, 소나 돼지 등의 동물 뼈를 활용함에도 천연 하이드록시 아파타이트 성분만을 순수한 상태로 수득 가능함에 따라, 치주골 결손 및 골 결손으로 인해 골 재생 시술이 어려운 환자의 골재생술(GBR)시 골 결손부에 채워 자가골 대체용으로 사용되는 이종골 이식재를 제조할 수 있다.

아울러, 본 발명에서는 지방질, 단백질 및 바이러스 등 종래에는 완전한 제거가 어려워 골 이식재에 잔존하였던 문제점을 해소함으로써 염증성 반응이 없고 바이러스와 같은 감염성 위해인자로부터 안전한 골 이식재의 제공이 가능하다.

또한, 상기 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재는 인체의 해면골과 유사한 다공성 구조 및 형태학적, 화학적으로 유사하며 상호 연결된 다공구조와 천연구조로 구성되어진 재료로서 치주골 결손부위에 이식하여 면역 부작용이 발생하지 않고, 골 결손부 공동에 채워 새로운 골조직이 생길 공간을 확보하며 이식 후 신생골의 형성과 성장을 촉진할 수 있다는 유효한 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시 예에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재의 제조 방법 흐름도.
도 2는 본 발명의 실시 예에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재의 주사 전자 현미경 사진.
도 3은 본 발명의 실시 예에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재의 결정상을 나타내는 XRD 사진.
도 4는 본 발명의 실시 예에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재의 결정화도 시험 성적서를 나타내는 사진.
도 5는 본 발명의 실시 예에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재와 대조군의 이식시험 결과를 나타내는 탈회 표본 사진.
도 6은 본 발명의 실시 예에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재와 대조군의 이식시험 결과를 나타내는 비탈 표본 사진.

이하, 도면 1을 참조하여 본 발명의 제조방법을 상세히 설명한다.

1. 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조

S10: 전처리 단계

전처리 단계(S10)에서는 동물 뼈로부터 골 조직을 분리하여 세척하는 과정을 진행한다. 본 발명에서 이종골 이식재 제조에 활용하는 소 또는 돼지 뼈는 생후 3~45개월 이하의 소, 돼지를 대상으로 하며, 대퇴골 근위부(proximal Femur), 원위 골단부(distal proximal), 근위 골단부(tibial proximal), 장골(iliac), 골반(pelvic)으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 부위로부터 절단기를 이용하여 3cm*3cm*3cm크기로 블럭형 골 조직을 분리하였으며, 상기 골 조직에는 해면골(spongy bone)이 풍부하기 때문에 충분한 양의 골 이식재를 수득할 수 있다는 장점이 있다.

상기 블럭형 골 조직이 준비되면 본 발명에서는 2차례의 세척 과정을 진행한다. 우선, 1~2bar 조건에서 100℃~150℃에서 30분~2시간동안 고압증기 세척을 진행하여 블럭형 골 조직에 잔류하고 있는 소 또는 돼지의 혈액성분, 위해요인 등을 제거한다.

고압증기 세척이 완료된 블럭형 골 조직은 탈 이온수를 활용하여 2차 세척을 진행한다. 이때 탈 이온수는 1차 내지 3차 모두 적용 가능하며 상기 탈 이온수 100 중량부 기준 10~30 중량부의 블럭형 골 조직을 투입 후, 1시간~3시간 초음파 처리 하여 세척한다. 본 실시 예에서는 보다 정제된 탈 이온수인 3차 탈 이온수 20ml에 4g의 블럭형 골 조직을 투입하여 초음파 제공 조건에서 2시간 세척 처리를 하였으며 이를 통해 고압증기 세척이 완료된 블럭형 골 조직 외부에 부유하는 이물질의 제거가 가능하다.

S20 : 1차 유기질 제거 단계

S20에서는 상기 S10의 골 조직을 초음파가 제공되는 조건에서 종류가 상이한 유기용매에 순차적으로 투입하여 1차적으로 유기질을 제거한다. 이때 본 발명의 유기질은 통상의 탄소 혼합물 외 단백질, 지방질 등의 유기 물질을 모두 포함한다.

또, 본 발명에서는 종래와 같이 1종의 유기용매에 골 조직을 단순 침적시키는 것이 아니라, 순도 또는 종류가 상이한 유기용매를 순차적으로 적용하고, 초음파를 제공함으로써 다양한 종류의 유기질이 보다 효과적으로 분해 및 제거된다.

이에, 상기 S10에 의해 2차례 세척된 블럭형 골 조직에 유기용매로서 에틸에테르, 아세톤, 헵탄, 메탄올, 알코올 등을 사용하고, 100% 에틸에테르 용매에 S10 단계의 골 조직을 침적하여 4시간동안 초음파 처리하여 유기질을 1차 분획한 후, 상기 1차 분획된 블럭형 골 조직을 70% 알코올을 사용하여 3시간동안 초음파 처리하여 2차 분획함으로써 1차적인 유기질 제거를 달성한다.

이때 본 발명자는 다수의 실험을 통해 에틸에테르와 알코올을 순차적으로 적용하였을 때 유기질의 분리가 용이함을 인지하고, 특히 100%의 에틸에테르로 1차 분획, 70%의 알코올로 2차 분획하였을 때 가장 정제된 블럭형 골 조직을 획득할 수 있다는 결과를 도출하여 본 발명에 적용하게 되었다.

S30 : 건조 및 분쇄

S30에서는 S20의 골 조직을 건조 및 분쇄한다.

상기 S20의 블럭형 골 조직을 건조 방법으로는 후드, 공기 중에서 가능하나 바람직하게는 후드 내에서 바람을 이용하여 건조하는 것이 블럭형 골 조직의 청결 유지에 유효하다.

건조된 블럭형 골 조직은 분말로 분쇄하여 골 조직 분말을 제조하고, 분쇄방법으로는 어트리션밀, 볼밀, 로타리밀 등을 사용 할 수 있으며, 뼈 블록을 쉽게 분쇄할 수 있는 분쇄기라면 이에 한정하지 않고 원하는 분쇄기를 적용 가능하다.

S40 : 2차 유기질 제거 단계

S40에서는 상기 S30의 골 조직 분말을 초음파가 제공되는 조건에서 종류가 상이한 유기용매에 순차적으로 투입하고, 탈 이온수 세척하는데, 이때 시간을 제외한 처리 조건은 S20에서 진행된 것과 동일하다.

또, S20에서는 블록형 골 조직이었으나, S40에서는 표면적이 넓어진 골 조직 분말을 재차 유기용매 처리함으로써 블록형 골 조직의 내부 깊숙이 존재하여 미처 제거되지 못한 유기질이 S40 단계에서 제거 가능하므로, 본 발명에서는 골 조직의 내측, 외측면 모두에 대해 완전한 유기질의 제거가 가능한 것이다.

이에, 100% 에틸에테르 용액 20ml에 S30의 골 조직 분말 4g을 침적시킨 후, 초음파를 활용하여 2시간 처리하여 1차 분획한다. 그리고 70% 알코올에서 초음파로 3시간 처리하여 2차 분획한다.

이때, 상기 블록형 골 조직과는 상이한 처리 시간이 S40에서 적용된 것은, 처리 대상이 블록형 골 조직에서 골 조직 분말로 형태가 상이해짐에 따라 에틸에테르 및 알코올 용매의 침투성 또한 달라진 것을 고려한 것이다.

아울러, 본 발명에서는 유기 용매에 녹아든 지방질 외에 분쇄된 해면골 분말 표면에 여전히 잔류한 지방질이나 기타 부유물의 제거 및 바이러스의 불활성화를 위해 1차 내지 3차 탈 이온수 20ml 당 4g의 골 조직 분말을 첨가하여 초음파가 제공되는 조건에서 2시간 동안 세척하는 과정을 더 진행한다.

S50: 면역원 및 바이러스 제거 단계

S40의 골 조직 분말을 강알칼리 및 강산 용액에 침적하여 면역원 및 바이러스를 제거한다. 이때 활용되는 강알칼리 용액은 수산화나트륨, 수산화칼슘 또는 탄산나트륨 등이 해당되고 0.1M~1.0M로 적용되어 바람직하게는 1.0M 수산화 나트륨(NaOH) 수용액을 희석하여 사용한다. 또한, 강산 용액은 염산, 아세트산, 황산 등이 포함되며 0.5N~1.0N로 적용되어 바람직하게는 0.5N 염산(HCL)수용액을 희석하여 사용한다.

이때 상기 강알칼리 용액이 0.1M~1.0M, 강산 용액이 0.5N~1.0N의 농도 범위를 벗어날 경우, 골 조직 분말의 제품 품질 안정화를 저하시킴에 따라 체내 이식 후 신생 골 조직의 성장 및 생체 적합성의 저하 등의 문제를 야기시킬 수 있으므로, 본 발명자의 다대한 실험을 통해 최적화된 상기 강알칼리 및 강산 용액의 농도 범위를 반드시 이행하여 골 조직 분말로부터 면역원 및 바이러스를 제거해야 한다.

상기 농도 범위에 적합하게 적용된 강알칼리 및 강산 용액은 골 조직 분말에 함유된 광우병을 유발하는 변성 프라이온 단백질을 비롯한 해당 동물로부터 유래될 수 있는 질환의 원인 물질을 멸균하는 역할을 하여, 인체에 상기 골 조직 분말이 이식되더라도 향상된 안정성을 보일 수 있다.

강알칼리 및 강산 용액으로부터 침적이 완료된 골 조직 분말은 100℃~150℃에서 1시간~2시간, 1bar~2bar 조건에서 고압증기 세척을 진행하여 상기 골 조직 분말에 포함된 매우 미세한 강알칼리 및 강산 용액까지 제거한다.

S60 : 3차 유기질 제거 단계

S60은 S50의 골 조직 분말에 고온 처리하여 3차적으로 유기질을 제거한다.

이때 분당 1~5℃ 승온한 100℃~700℃의 고온에서 40시간 이상 고온 처리하게 되며, 바람직하게는 분당 승온 2℃로 하여 620℃에서 40시간 이상 고온 처리를 진행한다.

이때 상기 온도가 100℃ 미만이거나 고온 처리 시간이 40 시간 미만으로 이루어질 경우, 골 조직 분말에 잔여하는 유기질을 최종적으로 제거할 수 없어 잔류하는 문제점이 발생한다.

S60 단계의 골 조직 분말은 현재 단계까지 미세하게 내,외측으로 존재할 수도 있는 유기질을 비롯한 바이러스, 위해 세포 등의 완전한 제거가 이루어져 결과적으로 순수한 형태의 천연 하이드록시 아파타이트로 구성된다.

S70 : 후처리 단계

상기 S60의 골 조직 분말은 탈이온수 100 중량부 기준 20 중량부 첨가하여 2시간동안 초음파가 제공되는 조건에서 세척한 후, 30℃~60℃에서 건조하여, 멸균건조된 골 조직 분말을 0.1mm~4.0mm로 분리함으로써 본 발명에서 요구하는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재를 획득 할 수 있다.

또 상기 골 이식재를 방사선으로 완전 멸균하여 체내 임플란트 시 질환 또는 면역거부반응이 없이, 인체에 대한 안정성을 확보하는 골 이식재를 제공할 수 있다.

2. 실험

(1) 주사 전자 현미경(SEM)분석

도 2는 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말의 다공성 확인을 위해 주사전자현미경(SEM)으로 X 100의 측정배율로 각기 다른 각도에서 관찰한 사진이다.

도 2를 살펴보면, 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말에는 수많은 다공이 형성되어 있어, 이는 체내 이식 후 세포 및 혈관이 용이하게 침투하여 서식할 수 있는 환경을 제공 가능하며, 골 이식 시술과정에서 혈액 및 식염수에 신속하게 수화되므로 천연 하이드록시 아파타이트 분말의 외부 이탈을 방지하여 정확한 위치로의 침투가 가능하도록 하는 것이다.

(2) 중금속 함량

본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말 성분을 분석하기 위해, ICP( Horiba사)를 이용하여 ICP 분석을 Uitima로 시행하였다. 이 때 AS, Cd, Hg, Pb을 분석하였으며 시험분석 방법으로는 ASTM F1581을 참조하였다. 골 이식재로 적용가능한 수치는 AS 3ppm, Cd 5ppm, Hg 5ppm, Pb 30ppm 이하 여야 하며, 본 발명에서는 4가지 성분 모두 검출되지 않았다.

구 분	AS	Cd	Hg	Pb
중금속(ppm)	ND	ND	ND	ND

(3) XRD를 이용한 결정상

본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말의 결정상 성분을 분석하기 위해 구리 Kα X-선(X-ray radiation)을 이용하는 X-선 회절계(D/MAX-2500, RIKAGU, JAPAN)로 조성을 측정하였으며, 시험분석 방법으로는 ISO 13779-3을 참조하였다.

상기 도 3에 도시된 바와 같이 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말의 결정상은 인체 골 내의 하이드록시 아파타이트 성분과 동일한 X선 회절분석기에 의한 결과 값을 가진다.

(4) Ca/P Ratio

본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말을 XRD를 이용한 결정상과 동일한 시험분석 방법으로 진행되며, 이때 시료를 보다 미세한 상태로서 40μm로 제조하여 시험에 적용하도록 한다. 그리고 X선 회절분석기를 사용하여 시료를 측정한 후, JADE프로그램을 사용하여 β-삼인산칼슘(JCPDS 09-0169), α-삼인산칼슘(JCPDS 9-348), 인회석(JCPDS 72-1243), 사인산칼슘(JCPDS 70-1379), 산화칼슘(JCPDS 82-1690)의 결정상을 확인한다.

분석된 상분율을 이용하여 Ca/p 비율을 계산하여 기록한 후, 3개의 샘플(샘플1, 샘플2, 샘플3)로 측정한 결과, 1.667의 동일한 Ca/p ration 평균 값을 나타내었다. 이는 실제 인체의 골을 구성하는 하이드록시 아파타이트 Ca/p ratio의 1.67값과 동일한 수치로서 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말은 생체 내에서 인체 골과 매우 유사하거나 동일할 것으로 기대되며, 생체 적합성을 가질 것으로 판단된다.

샘플	Ca/p ratio 평균
1	1.667
2	1.667
3	1.667

(5) 결정화도

본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말을 분석하기 위해 상기 Ca/P Ratio 실험과 동일한 방식으로 시료 제조 및 시험 방법을 진행한다. 이때 표준샘플 Hydroxy apatite (CAS 12167-74-7, SIGMA)를 사용하고, X선 회절분석기를 사용하여 시료와 표준샘플을 측정한 후, 표준샘플과 시료의 intensity를 이용하여 결정화도 백분율(%)로 계산하여 기록한다. 상기 시료는 3개의 샘플(샘플1, 샘플2, 샘플3)로 측정하여 표 3에 결과를 나타내었다.

샘플	결정화도(%)	평균(%)
샘플1	99.79	99.73
샘플2	99.83
샘플3	99.59

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말 시료 3개의 결정화도(%) 평균은 99.73%이며, 해당 결정화도 실험은 경북대학교 생체재료연구소 시험평가센터의 ISO 13779-3에 근거하여 이루어진 시험 성적서를 도 4와 같이 보유하고 있으며 인체 골의 천연 하이드록시 아파타이트의 기준치 95% 이상으로 나타나 체내 이식 후 타 골 조직과의 결정이 용이 할 것으로 기대된다.

(6) HA 상분율

본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말 성분 분석을 위해 구리 Kα X-선(X-ray radiation)을 이용하는 X-선 회절계(D/MAX-2500, RIKAGU, JAPAN )로 시료의 상 조성을 측정하였고, 시험방법으로는 ISO 13779 -3에 의거하였다. 이때 상기 시료는 40μm 상태로 만든다. X선 회절분석기를 사용하여 시료를 측정한 후, JADE프로그램을 사용하여 β-삼인산칼슘(JCPDS 09-0169), α-삼인산칼슘(JCPDS 9-348), 인회석(JCPDS 72-1243), 사인산칼슘(JCPDS 70-1379), 산화칼슘(JCPDS 82-1690)의 결정상을 확인하며, 상기 시료를 3개의 샘플로 나누어 측정한 결과를 표 4에 나타내었다.

샘플	HA 상분율(%) 평균
1	100
2	100
3	100

상기 표 4와 같이 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말의 HA 상분율은 모두 100%의 평균값을 나타냄에 따라 인체 골을 구성하는 하이드록시 아파타이트 성분과 동일함을 확인하였다.

(7) 아미노산 함량 분석

본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말의 단백질 함량을 분석하기 위해, 아미노산 분석기(L-8900, HITACHI, JAPAN)를 사용하여 상기 분말을 구성하는 아미노산에 대해 분석하였다.

분석항목	함량(nmol)
Asp.	0.021
Thr.	0.007
Ser.	0.059
Glu.	0.089
Gly.	0.184
Ala.	-
Cys.	0.030
Val.	0.029
Met.	-
Ile.	-
Leu.	-
Tyr.	-
Phe.	-
Lys.	0.043
His.	-
Arg.	-
Pro.	-

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 분말의 아미노산 전체 함량은 1.0nmol 이하로 검출됨에 따라, 본 발명의 제조 방법에 의해 소 또는 돼지 뼈에 함유되어 있던 단백질이 완전히 제거될 수 있음을 확인하게 된 것이다.

(8) 이식 시험

이식시험은 ISO 10993-6, 의료기기 생물학적 안전에 관한 공통기준규격을 참고하였다. 체중 3kg이상의 Rabbit(NewZealand, White)를 진통, 진정 효과와 근육이완 효과를 위하여 럼푼을 주사한 후, 거담제로 황산아트로핀을 주사하였다. 5분 후 졸레틸 혼합약을 주사하여 전신마취를 유지하며 전처치가 끝난 후, 수술부위인 좌우측 경골부 내측 부위를 제모한 후 수술대로 옮겼다. 수술부위에 리도카인을 무릎관절의 경골 골간단에 주사하여 국소마취와 함께 지혈작용이 나타나게 하였다.

피부를 포비돈 요오드 액으로 깨끗하게 닦은 후 경골 골간단의 전내측 쪽에 절개를 행한 뒤 피부, 근육, 근막, 및 골막을 거상하여 이식될 골을 노출 시킨다. 토끼의 좌우측 경골에 에틸렌옥사이드 가스로 멸균 후 천연 하이드록시 아파타이트 분말을 담은 폴리에틸렌 튜브를 각각 3개씩 식립. 이때 모든 수술과정은 충분한 생리식염수 주수 하에서 순차적인 크기의 드릴을 저속으로 사용하면서 드릴링한 후 식립 하였다.

골막과 피부를 흡수성 봉합사와 블랙 실크로 봉합한 후 상처보호와 감염방지를 위해 압박 드레싱을 행하고 항생제 1cc를 근육주사 하였다. 수술 후 감염방지를 위해 3일간 항생제를 동일한 방법으로 주사 하고, 12주의 치유기간을 거친 뒤 토끼를 희생 하였다. 절취된 검체는 10% 중성 포르말린용액으로 3일 정도 고정 시킨 후 Villanueva용액으로 4일간 염색을 진행 하였다. 50%,70%,80%, 95%, 100% 알코올로 탈수를 시킨 후 Propylene oxide로 치환하였다. Epon resin에 포매하여 60 incubator에서 2일간 중합시켜 레진블럭을 만들어 경조직 절편기로 절단하고 연마기를 이용하여 40전후 두께로 연마하여 광학현미경용 시편으로 제작하였다. 제작된 시편을 광학현미경으로 관찰하여 평가 기준표에 준하여 평가 및 조직학적 소견 촬영을 진행 하였고, 그 결과를 도 4에 도시하였다.

조직학적 소견 촬영을 관찰해보면, 탈회 표본 촬영에 있어, 도 4(a)는 매식 12주에서 시험군(본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재)으로서, 절개된 경골 형상에 따라 본 발명의 골 이식재가 결합되어 신생 골 조직이 축적되는 경향을 보이며, 이는 시간이 경과할수록 경골과 신생 골 조직 간의 미세 공간 없이 밀접한 결합을 이루어 바람직한 골 이식이 이루어 질 것으로 판단됨과 아울러, 특이한 염증 소견이 발견되지 않은바, 매우 안정적인 골 이식재를 적용하였음을 알 수 있다. 그러나, 도 4(b)의 대조군(N사, OCS-B)의 경우, 절개된 경골 형상 주위로 직경이 큰 다공이 형성되어 골 이식이 완전히 완료된 이후에도 환자의 골 상태는 매우 불안전 할 것으로 판단된다.

한편, 비탈 표본 촬영에 있어, 도 5(a)는 매식 12주에서 시험군(본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재)으로서, 골 조직들의 크기가 작으면서도 상호간의 형상에 맞추어 밀접하게 결합되고 있음을 확인할 수 있으나, 도5(b)의 대조군은 골 조직의 크기가 매우 큼에 따라 상호 간의 결합 시 직경이 큰 다공이 형성되고 있음을 확인할 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재는 본래 인체 골 조직과 신생 골 조직과의 결속력을 높일 수 있을 뿐더러 인체에 무해한 안정성을 확보할 수 있다.

Claims

동물 뼈로부터 블럭형 골 조직을 분리하여 세척하는 전처리 단계(S10);
에틸에테르, 아세톤, 헵탄, 메탄올, 알코올 중 2개 이상을 선택하고, 상기 선택된 유기용매 내에 각각 초음파를 제공하면서 상기 S10의 블럭형 골 조직을 순차적으로 투입하는 1차 유기질 제거 단계(S20);
상기 S20의 블럭형 골 조직을 건조 및 분쇄하는 단계(S30);
에틸에테르, 아세톤, 헵탄, 메탄올, 알코올 중 2개 이상을 선택하고, 상기 선택된 유기용매 내에 각각 초음파를 제공하면서 상기 S30의 골 조직 분말을 순차적으로 투입하고, 탈 이온수 세척하는 2차 유기질 제거 단계(S40);
상기 S40의 골 조직 분말을 0.1M~1.0M 강알칼리 용액에 침적한 후 0.5N~1N 강산 용액에 침적하여 면역원 및 바이러스를 제거하고 세척하는 단계(S50);
상기 S50의 골 조직 분말을 분당 1~5℃ 승온한 100℃~700℃의 고온에서 40시간 이상 고온 처리하는 3차 유기질 제거 단계(S60);
상기 S60의 골 조직 분말을 분리하여 멸균하는 후처리 단계(S70);를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 S10 단계는 블럭형 골 조직을 1~2bar 조건에서 100℃~150℃에서 30분~2시간동안 고압증기 세척을 진행하고, 이어서 1~3시간 동안 초음파가 제공되는 조건에서 탈 이온수 100 중량부 기준 10~30 중량부의 블록형 골 조직을 상기 탈 이온수에 투입하여 세척하는 것을 특징으로 하는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 S20단계에서는 100% 에틸에테르에 S10 단계의 블럭형 골 조직을 침적하여 4시간 동안 초음파 처리하여 1차 분획한 후, 1차 분획된 골 조직을 70% 알코올에 재침적하여 3시간동안 초음파 처리하여 2차 분획하는 것을 특징으로 하는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 S40단계에서는 100% 에틸에테르에 S30 단계의 골 조직분말을 침적하여 2시간 동안 초음파 처리하여 1차 분획한 후, 1차 분획된 골 조직분말을 70% 알코올에 재침적하여 3시간동안 초음파 처리하여 2차 분획하는 것을 특징으로 하는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 S50단계에서는 강알칼리 용액과 강산 용액에 침적한 후, 100℃~150℃에서 1시간~2시간 및 1bar~2bar 조건에서 고압증기 세척을 진행하는 것을 특징으로 하는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 S70단계에서는 탈 이온수 100 중량부 기준 10~30 중량부의 S60의 골 조직 분말을 상기 탈 이온수에 투입하여 2시간 동안 초음파가 제공되는 조건에서 세척한 후, 30℃~60℃에서 건조하고, 건조된 골 조직 분말을 0.1mm~4.0mm로 분리하는 것을 특징으로 하는 천연 하이드록시 아파타이트 골 이식재 제조 방법.
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