KR20190093188A - 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태의 제조 방법 - Google Patents

분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태의 제조 방법 Download PDF

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KR20190093188A
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아나톨리 페트로비치 수슬로프
블라디미르 게오르기예비치 네스테렌코
세르게이 블라디미로비치 네스테렌코
니나 블라디미로브나 칼미코바
일리야 알렉산드로비치 데미야넨코
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Abstract

본 발명은 제약학 및 의학 분야, 특히, 크기가 제어된 구조적 구성요소들을 가진 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태를 제조하는 방법, 사전 수화를 필요로 하지 않는 현탁 형태, 및 조직의 회복적 재생의 자극을 위한, 상기 방법에 의해 제조된 제품에 관한 것이다.

Description

분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태의 제조 방법
본 발명은 제약학 및 의학 분야, 특히, 크기가 제어된 구조적 구성요소들을 가진 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태를 제조하는 방법, 사전 수화를 필요로 하지 않는 현탁 형태, 및 조직의 회복적 재생의 자극을 위한, 상기 방법에 의해 제조된 제품에 관한 것이다.
현재 탈 세포화한(무세포성) 세포외 기질을 기반으로 한 의학 제품이 성형 및 재건 수술에서 광범위하게 사용된다. 게다가, 재생 의학 분야에서의 그것들의 적용은 계속해서 증가하고 있다. 이런 유형의 생체재흡수성 물질에서의 과학적이고 실제적인 관심은, 주로 보존된 3차원 미세구조, 공간적 위상 및 조직에 존재하는 세포외 기질의 화학적 조성에 의해 제공되는 그것의 회복 특성으로 인한 것이다. 많은 연구들이 상이한 공급원으로부터 다양한 방법에 의해 생성된 탈 세포화한 세포외 기질이 주화성, 세포 이동 및 분화, 뿐만 아니라 자가 조직의 리모델링을 촉진하는 능력을 증명한다(Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011, v. 32, No. 12, pp. 3233-3243).
시판중인 탈 세포화한 세포외 기질-기반 제품의 대부분은 중공 기관의 벽의 결손의 회복(Burger G.W., Halm J.A., Wijsmuller A.R., ten Raa S., Jeekel J. Evaluation of new prosthetic meshes for ventral hernia repair. Surgical endoscopy. 2006, v. 20, No. 8, pp.1320-1325), 치과학에서 뼈 조직의 재생(Bunyaratavej P., Wang H.L. Collagen membranes: a review. Journal of periodontology. 2001, v. 72, No. 2, pp. 215-229), 인대와 힘줄의 복원, 및, 보다 적게는, 다양한 병인학의 상처난 피부 결손의 치료(Cornwell K.G., Landsman A., James K.S. Extracellular matrix biomaterials for soft tissue repair. Clinics in podiatric medicine and surgery. 2009, v. 26, No. 4, pp. 507-523)에 사용할 목적의 동결건조된 플레이트 또는 막에 의해 대표된다. 그러나, 일부 병리학의 수술적 치료에서는, 주로 비뇨기과학 및 이비인후과학 분야에서, 뿐만 아니라 미용술의 윤곽형성 과정에서, 조직의 소실된 기계적 기능의 대체 및 자가 조직의 형성을 초래하는 회복 과정의 활성화를 허용하는 생체분해성 물질의 주입 가능한 형태를 사용하는 것이 필요하다. 또한, 경미한 삼출이 있는 만성 상처의 치료에서, 상처 결손을 쉽게 채우고 다량의 수분을 함유한 상처 드레싱을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 특징들을 정제된 세포외 기질의 생물학적 특성들과 조합시키는 의료 장치의 개발의 문제는, 대체로 액상에 현탁되어 있는, 기질의 분쇄된 입자를 사용함으로써 해결될 수 있다. 그러므로, US 6,933,326 B1 및 EP 1087756 A1은 동종 이계의 또는 이종 개체의 공급원으로부터 유래된 동결건조된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 제조 방법을 기술하며, 여기서 기질은 사용 전에 사전-재수화되어야 한다. 이 특허의 방법을 기반으로, LifeCell Corporation(USA)은 주사기에 충전된, 피부의 동결건조된 분쇄된 동종 이계의 세포외 기질인 의료 장치 Cymetra®을 생산한다. 공개된 데이터에 따르면, Cymetra®은 기관식도 천자술(Seshamani M., Ruiz C., Kasper Schwartz S., Mirza N. Cymetra injections to treat leakage around a tracheoesophageal puncture. Journal of oto-rhino-laryngology and its related specialities. 2006, v. 68, No. 3, pp. 146-148), 일측 성대 마비 환자에서 후두성형술(Milstein C.F., Akst L.M., Hicks M.D., Abelson T.I., Strome M. Long-term effects of micronized Alloderm injection for unilateral vocal fold paralysis. Laryngoscope. 2005, v. 115, No. 9, pp. 1691-1696), 및 입술 확대술(Sclafani A.P., Romo T., Jacono A.A. Rejuvenation of the aging lip with an injectable acellular dermal graft (Cymetra). Archives of fascial plastic surgery. 2002, v. 4, No. 4, pp. 252-257)에 치료 효과를 나타낸다. 이에 더불어, 공개된 데이터에 따르면, 주입 전에 직접 액상과 혼합된 돼지 방광의 분쇄된 정제된 세포외 기질은 요실금의 치료(Wood J.D., Simmons-Byrd A., Spievack A.R., Badylak S.F. Use of a particulate extracellular matrix bioscaffold for treatment of acquired urinary incontinence in dogs. Journal of the American veterinary medical association. 2005, v. 226, No. 7, pp. 1095-1097) 및 개에서 고대퇴 관절(coxofemoral joint)의 골관절염의 치료(Rose W., Wood J.D., Simmons-Byrd A., Spievack A.R. Effect of a xenogeneic urinary bladder injectable bioscaffold on lameness in dogs with osteoarthritis of the coxofemoral joint(hip): a randomized, double blinded controlled trial. International journal of applied research in veterinary medicine. 2009, v. 7, No. 1, pp. 13-22)에 성공적으로 적용되었다.
치료 방법에서의 적용을 유의하게 제한하는, 분쇄된 탈 세포화한 기질의 사용에 대한 상기 기술된 접근법의 중요한 결점은 물질을 수화하고, 이어서 비경구 또는 외부 투여에 대한 그것의 현탁 형태의 제조의 어려움이다. 이런 어려움은 주로 물질의 입자들의 응집 및 그것들의 고르지 않은 습윤에 의해 유발되며, 그것은 입자들이 균일하게 현탁되는 것을 방해한다.
공개된 데이터로부터 세포가 성장하고 있는 기질의 구조적 요소들의 크기의 감소가 세포의 생존력의 증가, 뿐만 아니라 세포의 이동 및 분화의 가속화를 촉진하는 것으로 알려져 있다(Stevens M.M., George J.H. Exploring and engineering the cell surface interface. Science. 2005. v.310, No. 5751, pp. 1135-1138). 이런 현상은 표면적의 증가 및, 그 결과로서, 이용 가능한 막수용체-결합 부위의 수의 증가와 관련이 있다. 동시에, 액체에서 분쇄된 탈 세포화한 기질의 간단한 현탁은 기질의 입자 크기가 달라지는 것을 제외하고, 고체 분산상의 구성요소들의 차원적 특성들을 변화시키는 것을 허용하지 않는다. 이것은, 차례로, 회복 특성이 제어된 주사 가능한 생체재흡수성 물질을 얻는 것을 매우 어렵게 만든다.
그러므로, 크기가 제어된 구조적 구성요소들을 가진 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질(ground decellularized extracellular matrix)의 현탁 형태를 제조하는 방법에 대한 필요성이 남아 있고, 여기서 현탁 형태는 사전 수화를 필요로 하지 않으며, 절개 없이 원하는 영역으로 주입될 수 있고, 다양한 조직의 열린 상처를 용이하게 충전할 수 있다.
문제점은 크기가 제어된 구조적 구성요소를 가지는 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태를 제조하는 방법의 개발에 의해 해결되며, 현탁 형태는 사전 수화를 필요로 하지 않고, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
정제된 섬유질 세포외 기질의 시트를 분리하는 단계;
정제된 세포외 기질의 입자들로부터 미세 분말을 제조하기 위하여 시트를 분쇄하는 단계,
이어서 필요한 크기를 가진 입자들의 분획을 얻기 위하여 분말을 분획화하는 단계;
액체 매질에서 입자들을 교반시키는 사이클을 분산시키는 사이클과 교대함으로써 정제된 세포외 기질의 선택된 미립자 분획을 액체 매질에 현탁하는 단계로, 콜라겐의 변성을 일으키지 않는 온도에서 시간 경과에 따라 상기 교반 공정이 우세한 단계; 및
그 결과로 얻어지는 입자들의 현탁액을 탈기하는 단계.
현탁 형태의 세포외 기질의 구조적 구성요소들의 크기는 완전히 온전한 번들로부터 더 작은 번들까지 달라질 수 있는 콜라겐 섬유 번들과 섬유의 해섬도(defibration degree)에 의해 측정되고, 제안된 방법에 따라서, 교반 및 분산 과정의 기간을 다르게 함으로써, 뿐만 아니라 사용된 정제된 기질의 유형에 따라, 교대 사이클의 수에 의해 제어될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 세포외 기질은 동종 이계의 또는 이종 개체의 결합 조직으로부터 유래된다.
본 발명의 특정 구체예에서, 담금 장치 또는 순환 장치는 균질화기-분산기로서 사용된다.
본 발명의 다른 특정 구체예에서, 교반 및 분산이 일어나는 액체 매질은 성장 인자, 형태형성 단백질, 호르몬, 자연 치료 다당류, 및 치료 물질 및 약물, 예컨대 항생물질, 지혈제, 진통제 및 국소 마취제를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 추가로 포함할 수 있는 등장성 또는 고장성 용액이다.
본 발명의 하나의 보다 특정한 구체예에서, 모든 단계는 결과적으로 얻어지는 현탁액의 멸균성을 제공하기 위하여 무균 상태 하에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예는 추가로 최종 포장에서 결과적으로 얻어지는 현탁액의 방사선 멸균화 단계를 포함하며, 그것은 결과로 얻어지는 현탁액의 멸균성을 제공한다.
본 발명의 하나의 보다 특정한 구체예에서, 미세 분말을 제조하기 위해 시트를 분쇄하는 단계는 상온에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 분쇄 전에, 탈 세포화한 세포외 기질은 추가로 가교결합제로 처리된다.
발명의 다른 목적은 특히 피부 상처를 치유하기 위하여 회복적 조직 재생을 자극하기 위하여 의도된 상기 언급된 방법에 의해 제조된 제품이다.
도 1은 60초(좌측) 및 10분(우측) 동안 단일 분산에 의해 얻어진 소 피부의 수화된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁액을 포함한 주사기의 외관을 도시한다.
도 2는 60초(A) 및 10분(B) 동안 단일 분산에 의해 얻어진 소 피부의 수화된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁액의 현미경으로 본 구조를 도시한다. 광 현미경. 차등 간섭 대비.
도 3은 60초 및 10분 동안 단일 분산에 의해 얻어진 소 피부의 수화된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁액으로, 및 10% 글루코오스 용액(대조군)으로 주입된 조직의 조직학적 구획의 부위들을 도시한다. 구획들은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된다. 대표적인 현미경 사진이 도시된다.
도 4는 60초 및 10분 동안 단일 분산에 의해 얻어진 소 피부의 수화된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁액을 포함하는 드레싱 하에서, 및 현탁액이 없는 고정 붕대(대조군) 하에서 상처가 치유된 동물의 상처 표면의 상대 면적을 도시한다. 별표로 표시된 값은 대조군 그룹의 값과 통계적으로 유의하게(p <0.05) 상이하다.
도 5는 60초 및 10분 동안 단일 분산에 의해 얻어진 소 피부의 수화된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁액을 포함하는 드레싱 하에서, 및 현탁액이 없는 고정 붕대(대조군) 하에서 상처가 치유된 동물의 상처 표면의 대표적인 현미경사진을 도시한다.
도 6은 60초 및 10분 동안 단일 분산에 의해 얻어진 소 피부의 수화된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁액을 포함하는 드레싱 하에서, 및 현탁액이 없는 고정 붕대(대조군) 하에서 상처가 치유된 동물에서 상처의 중심 영역으로부터의 조직학적 구획에서의 육아 조직(granulation tissue)의 면적을 도시한다. 별표로 표시된 값은 대조군 그룹의 값과 통계적으로 유의하게(p <0.05) 상이하다.
의료 적용을 위한 현탁액 투여 형태는 대부분 섬유질 단백질(콜라겐 및 엘라스틴)로 구성된 탈 세포화한 세포외 기질로부터 제조된다. 기질은 특허된 방법(예를 들어, RU 2353397 또는 US 5336616 A에 따름), 및 과학 문헌에 개시된 방법 또는 방법들의 조합(Badylak S.F., Taylor D., Uygun K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual review of biomedical engineering. 2011, v. 15, No. 13, pp.27-53) 둘 다에 의해 제조될 수 있다. 알칼리성 용액으로의 처리를 기반으로 한 정제 방법들이 바람직하다. 이에 더불어, 사용된 정제 방법이 결과적으로 얻어진 물질에서 50 ng/mg 건조 중량 미만의 잔여량의 DNA를 제공할 때 바람직하다. 정제된 세포외 기질의 공급원은 동종 이계의 또는 이종 개체의 결합 조직이어야 한다. 망상 진피의 세포외 기질이 현탁 형태를 제조하는 데 가장 적합하다. 그러나, 심낭, 복막, 큰 혈관 벽, 장 및 기타 기관의 결합 조직으로부터 유래된 기질 역시 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 탈 세포화한 기질은 생체분해에 대한 내성을 증가시키기 위하여 가교결합제(예를 들어, 가용성 카르보다이이미드 또는 글루타르알데하이드)로 사전 처리될 수 있다.
결과적으로 얻어진 탈 세포화한 세포외 기질은 시트들로 나누어진다. 시트의 폭은 그것들의 분쇄기 안으로의 후속되는 도입의 편리성에 따라 선택된다. 그런 다음 시트들은 물질의 기계적 저항성을 감소시키고 분쇄 중에 그것의 국소성 변형을 방지하기 위하여 공기 중에서 또는 동결건조 과정에 의해 건조된다.
건조가 완료된 후, 결과적으로 얻어진 물질은, 바람직하게는 상온에서(+15 내지 +25℃의 범위에서) 분쇄된다. 분쇄는 낮거나 중간의 경도(예를 들어, PULVERISETTE 15 (FRITSCH, Germany))의 건조된 섬유질 물질의 분쇄를 위해 제분기를 사용함으로써 수행된다. 가변성 구멍 크기를 가진 스크린 삽입부가 장치 설계에 제공되는 것이 바람직하다. 이 삽입부는 결과적으로 얻어진 기질 입자들의 크기 분포를, 구멍 직경을 다르게 함으로써 변화시키는 것을 가능하게 만든다. 분쇄 후에, 기질은 5 내지 4000 μm의 입자 크기를 가지는 미세 분말이다.
현탁액의 고체 분산상을 구성하는 입자들의 크기는 주로 그것의 유동학적 및 생물학적 특성을 결정한다. 원칙으로서, 미용 과정에 사용된 작은 직경의 바늘(30G, 27G)을 통한 피내 주사의 경우, 5 내지 400 μm의 크기를 가지는 입자들을 포함한 현탁액을 사용하는 것이 방편이다. 그러나, 수술에 사용된 큰 직경의 바늘을 통한 현탁액의 주사의 경우, 400 내지 800 μm의 직경을 가지는 입자들의 분획을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 계속해서, 주사를 필요로 하지 않는 외부 적용의 경우, 700 내지 1000 μm의 직경을 가지는 입자들의 현탁액이 가장 적합하다. 이에 더불어, 더 큰 입자를 포함한 현탁액은 더 긴 생체분해 시간을 갖는 경향이 있다. 이것과 관련하여, 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태의 후속 제조를 위해, 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질은 필요한 크기의 입자를 얻기 위해 분획화된다. 이러한 목적을 위해, 마이크로스크리닝이, 건조 체질에 사용된, 필요한 크기의 구멍을 가진 직조된 또는 마이크로 정밀 체 세트가 포함된 진동체 쉐이커(예를 들어, ANALYSETTE 3 PRO (FRITSCH, Germany))에서 수행된다. 청정 제조에 사용된 체는 ISO-3310-1에 따라 만들어질 것이다. 마이크로스크리닝에서, 체질 과정은 0.2 내지 2.5 mm의 범위의 진동 진폭에서 수행되는 것이 바람직하다. 이것은 먼지 털기 중에 장치의 벽에 가라앉음으로써 유발된 물질의 소실을 감소시킨다. 또한 장치의 설계 및 소프트웨어에 의해 제공된다면, 특정 크기의 입자들을 분리하는 특수 방식을 적용하는 것도 가능하다.
분쇄 및 분획화로부터 생성된 세포외 기질은 현탁액의 추가 제조에 사용된다. 이러한 목적을 위해, 입자들의 선택된 분획은 균질화기-분산기에서 현탁액의 액상과 혼합된 후, 분산된다. 액상은 바람직하게는 등장성(예를 들어, 0.9% 염화 나트륨 용액 또는 5% 글루코오스 용액) 또는 고장성(예를 들어 10% 글루코오스 용액) 용액이다. 현탁 형태의 치료 특성을 개선하기 위하여, 액체 분산 매질의 조성물에는 다양한 추가 구성요소들, 예컨대 성장 인자, 형태형성 단백질, 호르몬, 치료 물질 및 약물, 특히 항생물질, 지혈제, 진통제, 및 국소 마취제, 뿐만 아니라 자연 치료 다당류(예를 들어, 히알루론산), 및 그러한 구성요소들의 조합이 보충될 수 있다.
균질화기-분산기는 담금 장치(예를 들어, ULTRA-TURRAX (IKA, Germany)) 또는 순환 장치(예를 들어, 매직 LAB (IKA, Germany))일 수 있다. 담금 분산기를 사용할 때, 구성요소들의 교반 및 분산은 실험실 용기, 예를 들어 유리 비커에서, 및 순환 분산기를 사용할 때 장치의 저장소에서 수행된다. 두 경우에 모두, 현탁액의 제조 과정 전체에서, 분산 모듈의 부품들에 대한 물질의 마찰로 인한 가열에 의해 증가하는 현탁액 온도를 제어하는 것이 필요하다. 사용된 탈 세포화한 세포외 기질의 주요 단백질의 비가역적인 변성 온도 이상으로 현탁액의 온도가 초과하는 것을 피하는 것이 바람직하다. 순환 분산기에는 추가적인 항온 제어된 모듈, 냉각 및 가열 모듈 두 가지가 모두 장착될 수 있다. 이 모듈들은 장치의 상이한 부품에서 조합되어 최적의 온도 모드를 생성할 수 있다. 예를 들어, 4℃로 냉각시키는 모듈이 국지 가열을 최소화하기 위하여 분산 모듈 상에 설치될 수 있고, 27℃로 가열시키는 모듈이 시스템의 작동 점도 매개변수들 내에서 혼합물의 유동학적 매개변수들을 유지하기 위해 저장소 자켓 상에 설치될 수 있다.
현탁액 제조의 제 1 단계에서, 액상의 부피의 일부분이 용기 또는 저장소 안으로 도입된다. 그런 후, 교반 모듈이 그곳에, 예를 들어 앵커형 혼합기에 배치된다. 그런 다음, 필요한 양의 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질이 점차적으로 수동으로 도입된다. 그런 후 액상의 나머지 계산된 부피가 도입되고, 혼합기가 작동된다. 바람직한 회전 속도는 20 내지 45 rpm이다. 순환 장치는 또한 그 위에 설치된, 고체 분산상의 자동화된 점진적 도입을 위한 특수 모듈을 포함할 수 있다. 만약 혼합기의 동력이 현탁액을 고르게 혼합하기에 충분하지 못하다면, 현탁액은 막대기 또는 또 다른 실험실 도구를 사용하여 손으로 추가로 혼합될 수 있다. 혼합이 완료된 후에, 분산 모듈이 용기 또는 저장소에 담궈져서, 회전자와 고정자 사이에 최대 갭이 미리 설정된다. 0.6 내지 2 mm의 범위의 갭이 가장 바람직하다. 토크 값은 사전에 설정되어야 하고(예를 들어, 3000 내지 6000 rpm), 그런 후에 분산 모듈이 작동된다.
현탁 형태의 제조 중에, 교반 사이클이 분산 사이클과 교대되어야 하며, 이때 교반 과정이 시간 내에서는 유의하게 우세하다. 교반 과정은 분쇄된 기질의 필수적인 수화를 보장해주는 제 1 분산 과정보다 앞서야 한다. 교반 및 분산 사이클의 기간을 다르게 함으로써, 분쇄된 정제된 섬유질 세포외 기질에서 콜라겐 섬유 번들의 해섬도를 제어하는 것이 가능하다. 이것은 상이한 유동학적 및 생물학적 특성을 가진 현탁액을 제공한다. 그러므로, 더 큰 해섬도를 가진 현탁액은 더 작은 직경의 바늘을 통해 통과할 수 있을 것이고, 또한 더 높은 생체분해 속도를 가질 것이다. 콜라겐 섬유의 온전한 번들의 단편들에 의해 형성된 입자들로 구성된 현탁액은 교반 사이클의 기간이 10분 내지 4시간이고 분산 사이클의 기간이 30초 내지 10분일 때 얻어진다. 더 작은 차수의 콜라겐 섬유의 번들이 우세한 구성요소인 현탁 형태의 제조의 경우, 분산 사이클의 기간은 1 내지 60분인 한편, 교반 사이클의 시간은 동일하게 유지된다. 분산 사이클의 기간은 고체 분산상의 중량 분획에 따라 선택된다: 탈 세포화한 기질의 더 큰 농도를 가진 현탁액의 제조는, 원칙적으로, 더 긴 분산 사이클을 필요로 한다. 교반-분산 사이클의 수는 작업에 사용된 정제된 기질의 유형에 따라 실험적으로 조정되어야 한다. "어려운" 정제에 의해 제조된(예를 들어, 알칼리 용액 사용) 기질의 경우, 하나의 교반-분산 사이클이면 보통 충분하다. 동시에, "가벼운" 정제에 의해 제조된(예를 들어, 계면활성제로의 처리에 의해) 샘플의 경우, 더 많은 수의 반복된 사이클이 필요하다.
패킹 전에, 결과적으로 얻어진 현탁액은 교반시에 진공 탈기 시스템을 사용함으로써(예를 들어, 공정 플랜트 Magic Plant (IKA, Germany)에서 표준으로서 포함된 진공 펌프를 사용하여) 탈기된다. 만약 현탁액이 담금 균질화기-분산기를 사용함으로써 제조되었다면, 탈기기의 저장소 안으로 전달되어야 한다. 만약 현탁액이 순환 균질화기-분산기를 사용함으로써 제조되었다면, 탈기기의 저장소 안으로 전달될 수 있거나 또는 보통 장치의 추가 구성요소로서 제조사에 의해 제공된 특수한 탈기 모듈이 사용될 수 있다.
탈기 후에, 현탁액은 최종 포장(예를 들어, 주사기 또는 튜브)에, 수동으로 또는 산업용 패킹 유닛을 사용함으로써 패킹된다.
얻어진 생성물의 멸균성을 확보하기 위하여, 제조 과정은 바람직하게는 무균 상태 하에서, GOST R 52249 및 GOST R ISO 13408에 따라 수행된다. 이에 더불어, 만약 방사선에 대한 노출 하에서 생성물 구성요소들의 분해가 치료 특성에 유의한 영향을 미치지 않는다면, 현탁액은 방사선을 사용함으로써 최종 포장에서 멸균될 수 있다.
적용 분야
본 발명에서 기술된 방법에 의해 제조된, 수화된 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태는 다음의 분야에서 사용될 수 있다:
(1) 급성 및 만성 피부 상처의 치료, 및 위축성 흉터 및 주름의 교정을 위한 피부과학 및 미용술;
(2) 요실금 및 방광요관 역류의 치료를 위한 비뇨기과학;
(3) 성대의 성형 수술을 위한 이비인후과학;
(4) 다양한 조직의 결손의 기계적 대체를 위한 재건 수술.
본 발명에 따라 제조된 현탁 형태는 또한 조직 공학에서 세포 이식에 대한 지혈제 및 기질로서 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 방법에 따라 제조된 기질 현탁액은 두 가지, 주사에 의해 또는 표면 적용에 의해, 또는 이 방법들의 조합에 의해 원하는 영역에 투여될 수 있다. 이것들은 또한 고정 붕대 또는 다른 의료 제품에도 적용될 수 있다.
실시예
400 내지 700 cm2의 면적의 소 피부의 탈 세포화한 세포외 기질의 시트들을 RU 2353397에 기술된 정제 방법에 의해 얻었다. 물질의 잔여 DNA 함량은 6.5 ng/mg 건조 중량이었고, 그것은 문헌에 따르면, 세포 구성요소들이 효과적으로 제거된 것을 나타낸다(Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011, v. 32, No. 12, pp. 3233-3243). 이들 층을 절단하고 잔여 수분 함량이 30%가 될 때까지 공기 중에서 건조시켰다. 그런 다음, 그것들을 500 μm의 구멍 크기를 가진 체 삽입부가 설치되어 있는 PULVERISETTE 15 컷팅 밀(FRITSCH, Germany)로 분쇄하였다. 그 결과로 얻어진, 정제된 기질의 미세 분말을 100, 250, 400, 500, 또는 1000 마이크론의 구멍 크기를 가진, 건조 체질을 위한 마이크로 정밀 체 세트를 포함한 진동 체 쉐이커, ANALYSETTE 3 PRO(FRITSCH, Germany)에서 마이크로스크리닝을 수행하였다. 분획화될 때, 진동 진폭은 체질 과정 중에 0.2 mm 내지 2.5 mm의 범위에서 변화하였다. 현탁액의 추가의 제조를 위해, 200 내지 300 μm의 입자 크기를 가지는 분말 분획을 선택하였다. 수화된 분쇄된 기질의 현탁 형태를 매직 LAB 순환 균질화기-분산기(IKA, Germany)를 사용함으로써 제조하였다. 10% 글루코오스 용액인 액체 분산 매질을 200 ml의 양으로 장치의 저장소에 부었다. 그런 다음 앵커형 혼합기를 20 rpm의 사전설정 회전 속도로 작동시켰다. 그런 후, 분쇄된 기질의 70 g 및 글루코오스 용액 800 ml을 저장소에 첨가하고, 그 결과 얻어진 현탁액을 40분 동안 교반하였다. 이 시간이 끝났을 때, 교반을 중단하고, 4℃로 냉각하는 분산 모듈의 스위치를 켰고, 이때 회전자와 고정자 사이의 사전설정 갭은 1 mm이다. 온전한 콜라겐 섬유 번들의 입자들을 함유하는 형태를 15분 동안 교반한 후, 3000 rpm에서 60초 동안 분산시킴으로써 제조하였다. 차례로, 10 내지 20 μm의 직경을 가진 콜라겐 섬유 번들로 구성된 형태를, 분산 과정의 시간을 제외하고 유사한 방식으로 동일한 크기의 기질 입자들의 또 다른 배치를 처리함으로써 제조하였다. 이 경우, 현탁액을 10분 동안 분산시켰다. 물질이 장치의 저장소에 존재할 때까지, 현탁액의 온도를 빌트인 온도계를 사용하여 모니터링하였다. 샘플의 온도는 20 내지 40℃의 범위였다.
그런 다음, 현탁액을 공정 플랜트 Magic Plant(IKA, Germany)에서 표준으로서 포함된 진공 펌프를 사용하여 분산기 챔버에서 탈기시켰다. 그런 후에, 현탁 형태를 무균 상태 하에서 1.5 ml의 부피를 가진 Luer 락 폴리프로필렌 주사기에 수동으로 패킹하였다. 주사기를 스토퍼 "콤비-스토퍼"(B. Braun, Germany)로 닫고 멸균을 위해 롤(steriCLIN, Germany)에 패킹하였다. 그런 다음 현탁 형태를 11 kGy의 용량으로 방사선 멸균하였다.
얻어진 생성물은 도 1에서 도시된 것과 같이, 플러그가 달린 주사기에 패킹한 불투명한 점성의 백색 현탁액이었다. 60초 동안 분산에 의해 얻어진 현탁액은 식별이 가능한 개별적인 입자들을 포함한 한편, 10분 동안 분산된 현탁액은 균질하였다.
얻어진 샘플의 구조를, 광현미경으로 그것들의 형태를 연구함으로써 분석하였다. 광현미경 조사를 위해, 현탁액의 제제를 슬라이드와 커버 슬립 사이에 50 μl의 샘플을 놓음으로써 준비하였다. 얻어진 제제를 차등 간섭 대비(DIC) 방법에 의해 Nikon Plan Fluor 10X/0.3 렌즈(Nikon, Japan)를 사용하는 NikonNi-U 현미경(Nikon, Japan)으로 분석하였다.
광현미경 조사는 얻어진 샘플이 액체 분산 매질과 그 안에 담궈진 분쇄된 정제된 섬유질 기질의 단편들로 구성된 것을 나타냈다(도 2 참조). 60초 동안 분산된 현탁액의 샘플에서, 이 단편들은 크기가 200 내지 300 μm인 개별 입자들에 의해 대표되고, 콜라겐 섬유로 빽빽하게 쌓인 번들로 구성되었다. 동시에, 10분 동안 분산된 현탁액의 샘플의 고체 분산상은 바람직하게는 10 내지 20 μm의 직경을 가진 콜라겐 섬유 번들의 뒤엉킨 망(network)이었다.
얻어진 의료 장치의 생물학적 영향을, 피하 이식 및 전체 두께 피부 상처의 치유 각각의 모델에 대해 마우스에서 그것들의 생체분해 및 회복 특성을 연구함으로써 평가하였다. 생체분해 과정을 분석하기 위하여, 마우스들을 24G 바늘을 통해 견갑부에 250 μl의 현탁액을 피하로 주사하였다. 대조군 그룹의 마우스들에게는 동일한 부피의, 의료 장치의 액상인 10% 글루코오스 용액을 주었다. 주사 후 제 1 일 및 제 5일에, 마우스를 안락사시키고 샘플 주사 영역으로부터 피부 덮개를 절제하고, 조직학적 조사를 위해 국소 림프절을 또한 절제하였다. 주사 구역에서의 임플란트의 존재, 뿐만 아니라 병리적 변화를, 주사 지점을 둘러싼 조직에서 및 국소 림프절에서 정성적으로 평가하였다.
회복 특성을 연구하기 위하여, 0.7 cm 직경의 전체 두께 피부 상처를 졸레틸(Virbac, France, 40 mg/kg 체중)로의 마취 하에 마우스의 견갑부에서 수술로 만들었다. 상처를 낸 직후에, 테스트 그룹의 동물들의 상처를 적절한 현탁액으로 완전하게 채우고 고정 붕대 "하이드로필름"(Paul Hartmann, Germany)으로 덮었다. 차례로, 대조군 동물들의 상처를 직접 고정 붕대로 덮었다. 조작 직후 및 또한 안락사 전에, 후속되는 포토플라니메트릭(photoplanimetric) 분석을 위해 상처의 디지털 현미경사진을 촬영하였다. 동물을 안락사시키고, 조직을 치유 제 7일에 수집하였다. 얻어진 조직에 조직학적 조사를 수행하였다. 조직학적 구획을 상처 표면의 상피화 정도 및 육아 조직의 면적에 대해 형태계량적으로 평가하였다.
피하 이식의 모델에서 연구 결과는 현탁액의 생체분해 속도에서 유의한 차이를 나타냈다. 그러므로, 60초 동안 분산에 의해 얻어진 샘플을 두 가지 연구 시점에서 모든 동물에서 주사 구역에서 검출하였다. 동시에, 10-분 분산으로부터 유발된 현탁액의 단편들은 투여 후 제 1일에서 동물의 50%에서만 발견되었다. 제 5일에 이 샘플들은 완전히 재흡수되었다(표 1 및 도 3 참조).
조직학적 조사 데이터에 따른 현탁액의 생체분해의 동역학
현탁액의 제조 방법 조직학적 구획에서 식별 가능한 임플란트 단편을 가진 동물의 수/동물의 총 수(식별 가능한 임플란트를 가진 동물의 비율,%)
분산, 60초 6/6(100%) 6/6(100%)
분산, 10분 3/6(50%) 0/6(0%)
정성적인 형태학 연구는 두 유형의 현탁액의 투여가 둘러싼 결합 조직에서, 실험의 제 5일에 거의 완전하게 사라지는 약하게 드러난 부종의 발생, 뿐만 아니라 주사 구역의 백혈구 침윤을 유발한 것을 보여주었다. 두 날, 제 1일 및 제 5일에 모두, 침윤물의 우세한 세포 형태는 단핵세포/대식세포였다. 백혈구는 이식된 샘플의 물질 안으로 능동적으로 침투한 것으로 나타났고, 그것은 의료 장치의 세포 이동을 위한 효과적인 기질로서의 작용 능력을 나타낸다. 주사 부위에는 기타 유의한 병리적 변화, 특히 괴사, 출혈, 및 섬유증은 없었다. 두 유형의 현탁액으로 주사된 조직에서 염증성 변화의 심각성은 글루코오스 용액의 투여에 의해 유도된 비특이적 조직 반응의 크기를 유의하게 초과하지 않았다(도 3 참조). 샘플의 투여는 또한 국소 림프절에서 임파선염 및 기타 병리적 변화를 유발하지 않았다.
전체 두께 피부 상처의 치유 모델에서 결과적으로 얻어진 현탁액의 회복 특성의 연구는, 상처가 대조군에 비교하여 10분 동안 분산된 현탁액으로 상처가 치료된 동물에서 상처 표면적의 2배 이상 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다(도 4 및 5 참조). 60초 동안 분산된 현탁액을 받은 그룹에서 이 지표의 평균 값은 또한 대조군에서보다 더 낮았지만, 그 영향의 크기는 그렇게 확연하지 못하였다(도 4 참조). 10분 동안 분산된 현탁액 형태의 드레싱 하에 상처의 치유는 상처 결손 구역에서 육아 조직의 양에 있어 유의한, 4배 증가를 초래하였다(도 6 참조). 동시에, 60초 동안 분산된 현탁액의 상처 상에 적용은 이 지표의 값을 평균 2배 미만으로 증가시켰다(도 6 참조). 실험의 결과는 분산 과정의 시간이 얻어진 현탁액의 특성에 영향을 나타낸다는 것을 증명한다. 그러므로, 60초 동안 분산된 현탁액의 구조(도 2 참조)는 10분 동안 분산된 현탁액에 비교하여, 그것의 재흡수에 더 긴 시간을 제공한다. 다른 한편으로, 10분 동안 분산된 현탁액은 회복적 피부 재생 과정을 훨씬 더 효과적으로 촉진한다.

Claims (12)

  1. 크기가 제어된 구조적 구성요소들을 가지는 분쇄된 탈 세포화한 세포외 기질의 현탁 형태의 제조 방법으로서, 상기 현탁 형태는 사전 수화를 필요로 하지 않으며, 방법은:
    정제된 섬유질 세포외 기질의 시트를 분리하는 단계;
    정제된 세포외 기질의 입자들로부터 미세 분말을 제조하기 위하여 층들을 분쇄하는 단계;
    이어서 분말을 분획화하는 단계;
    액체 매질에서 입자들을 교반시키는 사이클을 분산시키는 사이클과 교대함으로써 정제된 세포외 기질의 선택된 미립자 분획을 액체 매질에 현탁하는 단계로서, 콜라겐의 변성을 일으키지 않는 온도에서 시간 경과에 따라 상기 교반 공정이 우세한 단계; 및
    그 결과로 얻어지는 미립자 현탁액을 탈기하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포외 기질은 동종 이계의 또는 이종 개체의 결합 조직으로부터 유래되는 것인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    균질화기-분산기는 담금 장치인 것인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 균질화기-분산기는 순환 장치인 것인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    교반 및 분산이 수행되는 상기 액체 매질은 등장성 또는 고장성 용액인 것인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 액체 매질은 성장 인자, 형태형성 단백질, 호르몬, 치료 물질 및 약물, 예컨대 항생물질, 지혈제, 진통제 및 국소 마취제, 및 자연 치료 다당류를 포함하는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    현탁 형태의 상기 세포외 기질의 구조적 구성요소들의 크기는 완전하게 온전한 번들로부터 더 작은 번들까지 다를 수 있는 콜라겐 섬유 번들과 섬유의 해섬도 분리에 의해 측정되고 상기 교반 및 분산 과정의 기간을 다르게 함으로써, 뿐만 아니라 사용된 정제된 기질의 유형에 따라 반복되는 사이클의 수에 의해 제어되는 것인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    모든 단계는 결과적으로 얻어진 현탁 형태의 멸균성을 제공하기 위하여 무균 상태 하에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    결과적으로 얻어진 현탁 형태의 멸균성을 제공하기 위하여 최종 포장에서 결과적으로 얻어진 현탁액을 방사선 멸균하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    미세 분말을 제조하기 위하여 시트를 분쇄하는 단계는 상온에서 수행되는 것인 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 분쇄 단계 전에, 상기 탈 세포화한 세포외 기질은 추가로 가교결합제로 처리되는 것인 방법.
  12. 조직의 회복적 재생의 자극을 위한, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 제조된 제품.
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