KR101102308B1 - 세포외기질 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 복합 필름 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상세하게는 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 복합 필름 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 활용도가 높은 인체 지방 조직을 생체적합성 고분자와 간단하고 효과적인 방법으로 결합하여 필름 형태로 제조할 수 있어 의료, 세포배양 및 미용 소재로서의 이용 가능성을 높일 수 있다.

Description

세포외기질 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 복합 필름 및 그 제조방법 {Bilayer film consisting of ECM and biocompatible polymer and method for manufacturing}

본 발명은 세포외기질 성분과 고분자를 포함하는 복합 필름 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 의료, 세포배양 및 미용 복합 필름 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

생체적합성 고분자 재료는 질병의 진단, 치료, 및 예방의 수단으로 널리 임상에 적용되고 있으며 특히 손상되었거나 기능을 상실한 인체조직 및 기관을 대체하여 사용되는 인공장기 및 인공조직의 기본 재료이다. 인공장기에는 인공심장, 신장, 심폐기, 혈관 등이 있으며, 인공조직은 인공관절, 인공뼈, 인공피부, 인공힘줄 등이 있고 치료용 제품에는 치과용 재료, 봉합사, 고분자약제 등을 예로 들 수 있다. 이외에도 수많은 분야에서 고분자 생체재료가 이용되고 있으며 현재까지 해결하지 못하거나 효율적으로 해결치 못하고 있는 분야에 더욱 발전된 재료가 끝없이 요구되고 있다.

고분자 재료뿐만 아니라 모든 의료용 재료는 생체적합성을 반드시 필요로 하며, 이러한 생체적합성은 두 가지 면에서 의미를 구분할 수 있다. 넓은 의미의 생체적합성은 목적하는 기능과 생체에 대한 안전성을 겸비한 것을 말하며, 좁은 의미의 생체적합성은 생체에 대한 생물학적 안전성, 즉 독성이 없으며 멸균 가능한 것을 의미한다. 따라서 생체적합성 고분자라 함은 생체에서 목적하는 기능을 발휘하며, 재료자체의 독성이 없고 멸균 가능한 고분자라고 할 수 있다.

한편 본 발명에서 이용하고자 하는 지방 조직은 미세한 콜라겐 섬유로 이루어져 있는데, 이를 기계적 또는 화학적으로 처리하면 잘게 잘라지면서 섬유구조는 유지한 채 섬유조각들의 부유 상태가 된다. 이를 필름 형태로 개발할 수 있으면 의료용, 미용, 세포배양용 등 여러 분야에 매우 유용한 소재가 될 수 있다.

특히 인체유래 지방 조직은 자가조직을 이용할 경우, 면역반응 없이 줄기세포를 이식할 수 있는 등 유용성이 매우 높다. 그런데 지금까지 건조된 지방조직 기술에 의해서는 혈관봉합 후 보강을 위해 싸주거나 부피를 차지하지 않고 얇은 필름 상태로서 특정 면을 덮는 소재로서의 활용은 불가능하였다. 이는 인체조직만으로 된 필름은 뻣뻣한 헝겊과 같이 세밀한 굴곡이 어렵고 얇은 상태로는 장력을 버티지 못해 찢어지는 등 주로 물리적 강도가 약하다는 문제점에 기인한 것이다. 또한 구조상 표면 굴곡이 많아 밀접한 부착이 어려운 점이 있어 사용에 제한이 있으며, 세포를 부착하여 사용할 경우에도 목적에 따라 서로 다른 특성의 세포를 배양 부착하여 이동할 때 인체 조직에서 잘 자라지 않는 신경세포, 근육세포는 활용이 어려워 이에 적절한 소재를 혼합해야 할 필요성이 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 인체로부터 지방 조직을 추출한 세포외기질(ECM) 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 의료용 또는 세포배양용 복합 필름을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 복합 필름의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여, 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 필름을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 세포외기질(ECM)층은 생체적합성 고분자층에 적층되어 있는 것이 바람직하며, 상기 세포외기질(ECM) 성분은 콜라겐 섬유 조직이 유지되어 있는 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명이 다른 일실시예에 의하면, 상기 생체적합성 고분자는 폴리 글리콜산, 폴리 락트산, 폴리 락틱-코-글리콜산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 복합 필름은 두께가 0.01 nm 내지 1mm인 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 복합 필름은 의료용, 세포배양용 또는 미용 복합 필름일 수 있으며, 예를 들어, 줄기세포 이식혈관 봉합 필름이나, 창상 드레싱용 필름 또는 세포배양용 지지체로 사용될 수 있다.

또한 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM)층이 생체적합성 고분자층에 적층되어 있는 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법에 있어서, 상기 지질이 제거된 지방 조직 분말과 생체적합성 고분자를 수용액 중에서 혼합하여 현탁액을 형성하는 단계; 및 상기 현탁액을 건조시켜 필름을 형성하는 단계;를 포함하는 복합 필름의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 필름 형성 단계는 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 성분과 생체적합성 고분자간의 비중 차이에 의한 자연적인 라미네이션 과정을 통해 형성된다.

또한 본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 지방 조직은 인체로부터 추출된 지방조직일 수 있는데, 예를 들어, 비만환자로부터 추출되어 폐기된 지방조직 또는 사체에서 추출된 지방조직일 수 있다.

본 발명이 다른 일실시예에 의하면, 상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말을 제조하는 방법은

a) 지방 조직을 분쇄한 다음 지질을 탈리시키는 단계;

b) 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 분리하는 단계;

c) 상기 지질이 탈리된 지방조직을 멸균한 후 탈세포화시키는 단계;

d) 상기 탈세포화된 지방 조직을 단백질 분해 효소 및 산 용액으로 처리하여 ECM 성분을 균질하게 자르는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 상기 지방 조직을 분쇄하는 단계는 물리적, 화학적, 효소적 방법 중 어느 한 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말을 제조하는 과정은 증류수 중에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 증류수는 히알루로니다아제를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명이 다른 일실시예에 의하면, 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 분리하는 단계는 여과 또는 원심분리의 의해 수행되는 것이 바람직하며, 상기 멸균 단계는 방사선 또는 EO 가스를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 특별한 노력 없이 혼합액을 수분 정도 안정시키기만 해도 비중에 의해 층간이 구분되므로 공정을 단축할 수 있으며, 이에 따라 인체 조직의 변성을 최대한 방지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명은 인체조직을 생체적합성 고분자의 섬유 부재로 활용한 시도로서 필름의 물리적 강도를 크게 증가시킬 수 있다.

또한 이러한 지방조직 가공물은 수용액에 고르게 부유시킬 수 있어서 용액상태에서의 조합을 가능하게 하며, 이에 따라 두께가 얇아야 하는 필름형태 생체소재의 강도를 증가시켜 활용도를 높이게 된다. 예를 들면, 혈관봉합에 이용할 경우 봉합부를 튼튼하게 감싸주면서도(wrapping), 줄기세포를 부착, 배양하기 쉬우며 천연 콜라젠 이식물을 창상부에 제공할 수 있는 해주는 효과가 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 잘게 분쇄한 지방조직으로 형성한 필름형태의 소재와 생체 적합성 고분자 재료를 혼합함으로써 서로 다른 특성을 갖게 되는 복합 소재 필름에 관한 것이다.

지방조직은 미세한 콜라겐 섬유로 이루어져 있고 이를 기계적 또는 화학적으로 처리하면 잘게 잘라지면서 섬유구조는 유지한 채 섬유조각들의 부유 상태가 된다. 이를 평판에 건조하면 필름처럼 막을 형성하는데 이에 용액 상태의 고분자를 혼합하면서 다른 층을 구성하게 되면 장력 및 탄성이 증가하는 FRP(fiber reinforced plastic)가 된다. 즉 인체조직의 콜라겐 섬유가 파이버(fiber) 역할을 하고 고분자는 이들의 결합을 견고히 하며 서로 유착시키기 되어 특성이 다른 혼합소재가 된다. 이때 혼합 방법에 따라 이면 필름 또는 혼재된 필름을 만들 수 있다.

본 발명에 따른 복합 필름은 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 성분과 생체적합성 고분자를 포함하는 것이 특징이며, 이때 상기 세포외기질(ECM)층은 생체적합성 고분자층에 적층되어 있는 것이 바람직하고, 상기 세포외기질(ECM) 성분은 콜라겐 섬유 조직이 유지되어 있는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 일구현예에 의하면, 생체적합성 고분자는 폴리 글리콜산, 폴리 락트산, 폴리 락틱-코-글리콜산으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

또한 본 발명의 다른 일구현예에 의하면, 상기 복합 필름은 두께가 0.01 nm 내지 1mm인 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 다른 일구현예에 의하면, 상기 복합 필름은 의료용, 세포배양용 또는 미용 복합 필름일 수 있으며, 예를 들어, 줄기세포 이식혈관 봉합 필름이나, 창상 드레싱용 필름 또는 세포배양용 지지체로 사용될 수 있다.

한편 본 발명에 따른 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM)층이 생체적합성 고분자층에 적층되어 있는 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법은, 상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말과 생체적합성 고분자를 수용액 중에서 혼합하여 현탁액을 형성하는 단계; 및 상기 현탁액을 건조시켜 필름을 형성하는 단계;를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명의 필름 형성 단계는 상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말과 생체적합성 고분자간의 비중 차이에 의한 자연적인 라미네이션 과정을 통해 형성된다.

또한 본 발명의 다른 일구현예에 의하면, 상기 지방 조직은 인체로부터 추출된 지방조직일 수 있는데, 예를 들어, 비만환자로부터 추출되어 폐기된 지방조직 또는 사체에서 추출된 지방조직일 수 있다.

본 발명의 일구현예에 의하면, 상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말의 제조 방법은 지방 조직을 분쇄한 다음 지질을 탈리시키는 단계; 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 분리하는 단계; 상기 지질이 탈리된 지방조직을 멸균한 후 탈세포화시키는 단계; 상기 탈세포화된 지방 조직을 단백질 분해 효소 및 산 용액으로 처리하여 ECM 성분을 균질하게 자르는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일구현예에 의하면, 상기 지방 조직을 분쇄하는 단계는 물리적, 화학적, 효소적 방법 중 어느 한 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말을 제조하는 과정은 증류수 중에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 증류수는 히알루로니다아제를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

또한 본 발명이 다른 일구현예에 의하면, 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 분리하는 단계는 여과 또는 원심분리의 의해 수행되는 것이 바람직하며, 상기 멸균 단계는 방사선 또는 EO 가스를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 지질이 제거된 지방 조직의 제조

실시예 1-1

Liposuction 등의 성형외과적 수술 방법에 의해 추출된 인체 지방조직을 agitation, rotation과 같은 물리적 방법에 의해 분쇄처리하여 지질을 탈리시켰다. 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 필터를 이용하여 필터링하거나, 3500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 70% 에탄올로 세척한 다음, 증류수로 세척하였다. 상기 지질이 제거된 지방조직은 37℃ 교반 배양기에서 효소 및 화학적 성분을 처리하여 조직 내부의 세포 구성 성분을 제거하는 탈세포화(decellularization)를 수행하고, 효소 및 화학적 성분을 완전히 제거하기 위해 증류수로 수 차례 세척하여 준비하였다.

실시예 1-2

Liposuction 등의 성형외과적 수술 방법에 의해 추출된 인체 지방조직을 증류수를 넣고 가압 노즐 분사하여 지질을 탈리시켰다. 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 필터를 이용하여 필터링하거나, 3500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 70% 에탄올로 세척한 다음, 증류수로 세척하였다. 상기 지질이 제거된 지방조직은 37℃ 교반 배양기에서 효소 및 화학적 성분을 처리하여 조직 내부의 세포 구성 성분을 제거하는 탈세포화를 수행하고, 효소 및 화학적 성분을 완전히 제거하기 위해 증류수로 수 차례 세척하여 준비하였다.

실시예 1-3

Liposuction 등의 성형외과적 수술 방법에 의해 추출된 인체 지방조직을 분쇄한 다음, 증류수와 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 1:1:0.1의 비율로 넣고 60~80℃, 110W에서 10분 동안 10~15회 초음파로 처리(sonication)하여 지질을 탈리시켰다. 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 필터를 이용하여 필터링하거나, 3500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 70% 에탄올로 세척한 다음, 증류수 로 세척하였다. 상기 지질이 제거된 지방조직은 37℃ 교반 배양기에서 효소 및 화학적 성분을 처리하여 조직 내부의 세포 구성 성분을 제거하는 탈세포화를 수행하고, 효소 및 화학적 성분을 완전히 제거하기 위해 증류수로 수 차례 세척하여 준비하였다.

실시예 1-3

실시예에서 제시한 방법을 통해 얻은 세포외기질(ECM) 성분은 미세 분말을 포함한 여러 가지 모양으로 제조될 수 있으며, 이를 이중구조 (bilayer) 형태를 갖는 필름 또는 세포 배양용 지지체로 사용할 수 있다.

실시예 2: 지질이 제거된 분말의 지질 염색

실시예 1-1에서 제조한 세포외기질(ECM) 성분을 Oil red O로 염색하였고, 대조군으로는 상기의 방법으로 분말화 하기 전의 지방 조직을 사용하였다. 그 결과, 대조군에는 지질이 존재하나, 상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 세포외기질 (ECM) 성분에는 지질이 존재하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 지방조직으로부터 지질이 제거된 세포외기질(ECM) 성분을 인체 부피 대체용 지지체로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있다.

도 1에는 지질이 제거된 세포외기질(ECM)의 조직염색 사진이 나타나있다. 구체적으로 지질을 포함한 지방조직과 (A) Oil-Red O 를 통한 염색 사진 (C), 지질을 제거한 후, 세포외기질 (ECM)을 추출하여 건조시킨 필름과 (B), Oil-Red O 염색 사진(D)이 나타나있다.

한편 본 발명에 따르면 필름 제조과정 중 용액 또는 부유(suspension) 상태의 직접 혼합과 동시 건조 과정을 거쳐 제조 시간을 줄이고 소재간의 결합도를 높여 인체유래 세포외기질 성분과 플라스틱 계열 고분자의 합성으로 특성이 다른 면을 갖는 복합필름을 구성할 수 있으며, 구체적인 방법은 하기 실시예에 기재되어 있다.

실시예 3: 본 발명에 따른 복합 필름의 제조

10% (w/v) 농도의 poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 고분자 20ml를 유리 몰드에 넣고, 그 위에 상기 실시예에서 제조된 인체유래 세포외기질(ECM) 20ml을 천천히 첨가한다. 10 분간 기다리면 각 두 개의 층으로 분리되는데(도 3), 그 상태로 자연건조 과정을 거쳐 서로 다른 물질이 적층된 복합 필름이 형성되었다(도 2 및 도 4). 도 2 및 도 3에서 (a)는 지방에서 추출한 세포외기질층 (ECM)이고, (b)는 생체적합성 고분자인 PLGA층이다. 한편 본 실시예에서 형성된 복합 필름의 미세 구조는 도 5의 SEM 사진을 통해서도 확인할 수 있다 (A) 인체유래 세포외기질층 (ECM), (B) PLGA 층.

도 1은 지질이 제거된 세포외기질 (ECM)의 조직염색 사진이다. 구체적으로 지질을 포함한 지방조직과 (A) Oil-Red O 를 통한 염색 사진 (C), 지질을 제거한 후, 세포외기질(ECM)을 추출하여 건조시킨 필름과 (B), Oil-Red O 염색 사진(D)이 나타나있다.

도 2은 본 발명에 따른 복합 필름의 구성도이다.

도 3는 본 발명에 따른 복합 필름의 제작 과정을 보여주는 사진이다.

도 4은 본 발명에 따른 복합 필름의 실제 사진이다.

도 5는 본 발명에 따른 복합 필름의 SEM 사진이다

Claims (17)

1. 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리락틱-코-글리콜산 중에서 선택된 생체적합성 고분자층 위에 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM)층이 라미네이트된 이중층 복합 필름.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,

   상기 세포외기질(ECM) 성분은 콜라겐 섬유 조직이 유지되어 있는 것을 특징으로 하는 복합 필름.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 복합 필름은 두께가 0.01 nm 내지 1mm인 것을 특징으로 하는 복합 필름.
6. 제1항에 있어서, 상기 복합 필름은 의료용, 세포배양용 또는 미용 복합 필름 인 것을 특징으로 하는 복합필름.
7. 제6항에 있어서, 줄기세포 이식혈관 봉합 또는 창상 드레싱용 필름인 것을 특징으로 하는 복합 필름.
8. 제6항에 있어서, 세포배양용 지지체로 사용되는 것을 특징으로 하는 복합 필름.
9. 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM)층이 생체적합성 고분자층에 적층되어 있는 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법에 있어서,

   상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말과 생체적합성 고분자를 수용액 중에서 혼합하여 현탁액을 형성하는 단계; 및

   상기 현탁액을 건조시켜 필름을 형성하는 단계;를 포함하며,

   상기 필름 형성 단계는 지방조직으로부터 추출된 세포외기질(ECM)과 생체적합성 고분자간의 비중 차이에 의한 자연적인 라미네이션 과정을 통해 형성되는 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법.
10. 삭제
11. 제9항에 있어서,

    상기 지방 조직은 인체로부터 얻은 지방조직인 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법.
12. 제9항에 있어서,

    상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말은

    a) 지방 조직을 분쇄한 다음 지질을 탈리시키는 단계;

    b) 상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 분리하는 단계;

    c) 상기 지질이 탈리된 지방조직을 멸균한 후 탈세포화 시키는 단계;

    d) 상기 탈세포화된 지방 조직을 단백질 분해 효소 및 산 용액으로 처리하여 ECM 성분을 균질하게 자르는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법.
13. 제12항에 있어서,

    상기 지방 조직을 분쇄하는 단계는 물리적, 화학적, 효소적 방법 중 어느 한 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법.
14. 제12항에 있어서,

    상기 상기 지질이 제거된 지방 조직으로부터 추출한 세포외기질(ECM) 분말을 제조하는 과정은 증류수 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 의료 및 세포배양용 복합 필름의 제조 방법.
15. 제14항에 있어서,

    상기 증류수는 히알루로니다아제를 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 필름의 제조 방법.
16. 제12항에 있어서,

    상기 탈리된 지질과 지질이 탈리되지 않은 지방조직을 분리하는 단계는 여과 또는 원심분리의 의해 수행되는 것을 복합 필름의 제조 방법.
17. 제12항에 있어서, 상기 멸균 단계는 방사선 또는 EO 가스를 이용하여 수행되는 것을 복합 필름의 제조 방법.

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