CN104312140B - 一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料及用途 - Google Patents
一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料，它由包括如下步骤的方法制备：a、将阴离子水性聚氨酯乳液与小肠粘膜下层混匀，真空冻干成型；其中，小肠粘膜下层的用量是聚氨酯乳液的0.01～0.03倍(w/w)，所述聚氨酯乳液的平均粒径为15.18nm～42.86nm，固含量为3％～21％；b、交联，真空冻干，即得。本发明PU/SIS复合材料，同时具有聚氨酯和SIS的优良性能，既具有良好的回弹性能、力学性能，又具有生物活性、生物相容性，可诱导和促进组织结构的再生和修复，克服了现有软组织缺损修复材料只具有单一方面的性能以及应用受到限制等缺陷，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料及其用途。
背景技术
理想的软组织修复材料应该具有下述性质：(1)生物相容性，例如细胞相容性、组织相容性等；(2)优良的力学性能，例如拉伸强度、回弹性等。此外，软组织修复材料还需要适宜的三维多孔结构，从而有利于细胞的长入和分化、组织再生以及营养物质的传送。
目前，软组织修复材料主要有两大类：(1)合成高分子材料，例如聚氨酯等，具有优良的物理机械性能，但是不具备生物活性，不能促进组织再生；(2)天然的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，例如胶原、明胶、小肠粘膜下层(small intestinalsubmucosa，SIS)等，主要由胶原蛋白、纤维蛋白、弹性蛋白、生长因子、氨基葡聚糖或信号分子等多种成分组成，具有优良的生物相容性，易降解，降解产物无毒副作用、炎性反应低，可诱导和促进组织结构的再生和修复，但是存在回弹性差、易塌陷的问题。
因此，亟需发明一种新的材料，能够同时具有优良的物理机械性能和生物活性，从而克服现有软组织缺损修复材料只具有单一方面的性能以及应用受到限制等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种聚氨酯/小肠粘膜下层(PU/SIS)复合材料，同时具有聚氨酯和SIS的优良性能，既具有良好的回弹性能、力学性能，又具有生物活性、生物相容性，可诱导和促进组织结构的再生和修复，克服了现有软组织缺损修复材料只具有单一方面的性能以及应用受到限制等缺陷。
本发明是通过下述技术方案实现的：
一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料，它由包括如下步骤的方法制备：
a、将阴离子水性聚氨酯乳液与小肠粘膜下层混匀，真空冻干成型；
其中，小肠粘膜下层的用量是聚氨酯乳液的0.01～0.03倍(w/w)，所述聚氨酯乳液的平均粒径为15.18nm～42.86nm，固含量为3％～21％；
b、交联，真空冻干，即得。
阴离子型水性聚氨酯乳液是指分子主链或侧链上含有阴离子型亲水性基团的水性聚氨酯乳液。
所述的复合材料，步骤a中，所述聚氨酯乳液由如下方法制备得到：
(1)预聚：取异氰酸酯与羟基供体，预聚，二者的摩尔比为(1.45～1.85)：0.5；优选地，异氰酸酯与羟基供体的摩尔比为1.45：0.5；
所述异氰酸酯为异佛尔酮二异氰酸酯、L-赖氨酸二异氰酸酯、二苯基甲烷二异氰酸酯中的任意一种或多种；优选地，所述异氰酸酯为异佛尔酮二异氰酸酯；
所述羟基供体为聚乙二醇、聚四氢呋喃、丙二醇、1,4-丁二醇中的任意一种或多种；优选地，所述羟基供体为聚四氢呋喃；
(2)扩链：加入扩链剂，扩链，其中，扩链剂与步骤(1)中羟基供体的摩尔比为(3～7)：3；
所述扩链剂为2,2-二羟甲基丁酸、2,2-二羟甲基丙酸、N-甲基二乙醇胺、二乙醇胺中的任意一种或多种；优选地，所述扩链剂为2,2-二羟甲基丁酸或2,2-二羟甲基丙酸；
(3)中和乳化：加入中和剂，搅匀，然后将反应体系滴加到20％(v/v)的丙酮水溶液中，高速搅拌1～2h；其中，中和剂与步骤(2)中扩链剂的摩尔比为1.5:1；高速搅拌的转速为1200～1400rpm；
所述中和剂为三乙胺或氢氧化钠；
(4)纯化：旋蒸除去丙酮和过量中和剂，去离子水透析除去杂质，即得。
所述的复合材料，步骤(1)中，异氰酸酯与羟基供体的摩尔比为1.45：0.5。
步骤(1)中，预聚的温度为70℃～80℃；预聚的时间为1～5h；预聚采用的催化剂为辛酸亚锡、三乙醇胺或二月桂酸二丁基锡；
步骤(2)中，扩链的温度为50℃～55℃；扩链的时间为1～5h；
步骤(3)中，高速搅拌的转速为1300rpm；高速搅拌的时间为2h；
步骤(4)中，旋蒸的温度为55℃；
优选地，
步骤(1)中，预聚的温度为74℃，预聚的时间为2h 50min；
步骤(2)中，扩链的温度为54℃，扩链的时间为3h。
所述的复合材料，步骤a中，小肠粘膜下层的用量是聚氨酯乳液的0.03倍(w/w)。
所述的复合材料，步骤a中，所述小肠粘膜下层按照下述方法制备得到：
(i)取猪小肠，水洗，剖开，剪成段；
(ii)刮除小肠的肌层和浆膜层；
(iii)水洗滤干后，将其浸入三氯甲烷与甲醇的混合溶液中，浸泡时间为4小时，所述混合溶液中三氯甲烷与甲醇的体积比为1：1；
(iv)水洗后，放入胰蛋白酶溶液中，4℃处理过夜；
(v)水洗后，用SDS处理至少4 h；
(vi)清洗后，冻干；
(vii)粉碎，加入含有3％醋酸、0.1％胃蛋白酶的PBS溶液中，调pH至中性后，冻干，再粉碎，即得。
所述的复合材料，步骤a和b中，真空冻干的温度为-40～-80℃。
所述的复合材料，步骤b中，交联时间为12～48h。
所述的复合材料，步骤b中，所述交联的方法是：将步骤a制得的材料浸泡于交联剂溶液中；
其中，交联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、京尼平或戊二醛；优选地，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或京尼平。
所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐时，交联剂溶液的浓度为1％～5％，优选为2.5％；pH值为3～9，优选为5.5～7.4；
或者，所述交联剂为京尼平时，交联剂溶液的浓度为0.1％～2％，优选为2％；pH值为3～9，优选为7.4。
本发明的另一目的在于提供上述所述复合材料在软组织缺损修复材料中的应用。
本发明PU/SIS复合材料，具有下述有益效果：
(1)本发明PU/SIS复合材料具有优良的力学性能，其拉伸强度和断裂伸长率均较高，可以满足软组织缺损修复材料对力学性能的要求；
(2)本发明PU/SIS复合材料的回弹性好，力学性能更加均一可控，克服了现有技术中小肠粘膜下层应用于软组织修复材料存在的回弹性差、易塌陷等缺陷；
(3)本发明PU/SIS复合材料为三维多孔结构，孔径均匀，且孔洞间相互贯通，孔径大小在30-150μm之间，平均孔径为62.44±23.74μm，适合细胞的粘附爬行，有利于诱导细胞和毛细血管的长入，促进细胞的增殖；
(4)本发明PU/SIS复合材料的组织相容性好，免疫原性低。
综上，本发明PU/SIS复合材料，同时具有聚氨酯和小肠粘膜下层的优良性能，既具有良好的回弹性能、力学性能，又具有生物活性、生物相容性，可诱导和促进组织结构的再生和修复，克服了现有软组织缺损修复材料只具有单一方面的性能以及应用受到限制等缺陷；同时，本发明复合材料，为三维多孔结构，孔径均匀，且孔洞间相互贯通，生物相容性好，免疫原性低，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1实施例1与4聚氨酯乳液平均粒径及Zeta电位的检测结果。
图2实施例1～4中SIS水溶液平均粒径及Zeta电位的检测结果。
图3实施例2与3聚氨酯乳液平均粒径及Zeta电位的检测结果。
图4聚氨酯乳液的红外光谱图：
A：实施例1与4聚氨酯乳液的红外测试结果；B：实施例2与3聚氨酯乳液的红外测试结果。
图5试验例1对比试验的结果附图。
图6实施例1～4中PU/SIS复合材料的拉伸强度和断裂伸长率的测试结果
A：拉伸强度；B：应力应变曲线。
图7 PU/SIS复合材料的压缩强度、压缩模量以及压缩循环曲线的测试结果
A：PU与PU/SIS弹性体生物材料的压缩强度；B：PU与PU/SIS弹性体生物材料的弹性模量；C：PU的压缩循环曲线(n＝1)；D：PU/SIS弹性体生物材料的压缩循环曲线(n＝1)；E：PU的压缩循环曲线(n＝3)；F：PU/SIS弹性体生物材料的压缩循环曲线(n＝3)。
图8 PU/SIS复合材料的扫描电镜检测结果：
A：×100；B:×500；C:平均孔径分布图。
图9 HUVECs在PU/SIS复合材料、PU材料及对照组的生长增殖情况：
A：材料对HUVECs细胞吸光值的影响；B:材料对HUVECs细胞存活率的影响。
图10 HUVECs种植于PU及PU/SIS复合材料上活死细胞染色；
A：PU材料培养第3天(×200)，B:PU材料培养第5天(×200)，C:PU材料培养第8天(×200)D：PU/SIS复合材料培养第3天(×200)，E:PU/SIS复合材料培养第5天(×200)，F:PU/SIS复合材料培养第8天(×200)。
图11 SD大鼠背部皮下植入PU及PU/SIS复合材料HE染色结果：
A～C为PU材料在第2，4，8周时炎性细胞情况(×200)；D～F为PU/SIS复合材料在第2，4，8周时炎性细胞情况(×200)。
图12 SD大鼠背部皮下植入PU及PU/SIS复合材料Masson染色结果：
A-C为PU材料在第2，4，8周的纤维囊厚度情况(×200)；D-F为PU/SIS复合材料在第2，4，8周时纤维囊厚度情况(×200)。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
缩略词：
IPDI:异佛尔酮二异氰酸酯，PTMG1000：聚四氢呋喃1000，DMBA:2,2-二羟甲基丁酸，DMPA:2,2-二羟甲基丙酸，TEA:三乙胺，SIS：小肠粘膜下层，PU：聚氨酯，EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，HUVECs：人脐静脉内皮细胞。
1.聚氨酯乳液固含量的测定
固含量是乳液或涂料在规定条件下烘干后剩余部分占总量的百分数。参照GB1725-79，取干燥的表面皿称质量，并用减重法称取1.5～2.0g的水性聚氨酯乳液平铺于表面皿中，放入40℃烘箱中干燥24h，取出、冷却至室温后称量。用分析天平精确称量前洗净干燥的称量瓶称重A g,样品重量B g,烘干后称重(包含了样品和称量瓶)C g，计算(C-A)/B*100％得出固含量。
2.粒径表征与Zeta电位表征
2.1平均粒径检测方法
采用粒径测试仪对液体样品的平均粒径大小及分布进行测试。取适量制备的水性聚氨酯乳液或1％的SIS水溶液，用移液枪取1ml样品转移至样品池中。将装有液体样品的样品池放入仪器光路中，在室温下进行平均粒径测试。
2.2 Zeta电位检测方法：
采用Zeta电位分析仪对液体样品的Zeta电位进行测试。取适量制备的水性聚氨酯乳液或浓度为1％的SIS水溶液，用移液枪取1ml左右样品转移至样品池中。将装有液体样品的样品池放入仪器光路中，在室温下进行Zeta电位测试。
3傅里叶红外光谱表征
采用傅里叶红外光谱仪对制得的聚氨酯乳液冷冻干燥后进行傅里叶红外光谱分析。扫描范围400cm-1-4500cm-1，测试方法：ATR模式。
实施例1本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
1)预聚：将摩尔比为1.45:0.5的异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)和聚四氢呋喃1000(PTMG 1000)，其中异佛尔酮二异氰酸酯为0.1mol，加入三颈瓶中，加入0.2ml辛酸亚锡催化剂，在74℃下预预聚2h50min；
2)扩链：将PTMG 1000/DMBA摩尔比为5:5的2,2-二羟甲基丁酸(DMBA)在54℃下反应3h。反应过程中观察体系粘度，必要时可加入适量丙酮调节反应体系的粘度，目测反应体系在搅拌过程中不在搅拌杆上聚集的粘度均可，使反应维持在平稳状态下进行；
3)中和乳化：室温下，将TEA/DMBA摩尔比为1.5:1的三乙胺加入到体系中，搅拌20min后滴加到250ml丙酮水溶液(丙酮：去离子水＝1：4)中，在转速为1300rpm的条件下高速搅拌2h；
4)纯化：55℃温度下旋蒸，除去乳液中的丙酮和三乙胺，去离子水透析三天除去杂质。
对聚氨酯乳液分别进行平均粒径检测和Zeta电位检测以及傅里叶红外光谱分析，结果分别如图1(A)、(B)以及图4(A)所示。
由图1可知，聚氨酯乳液的平均粒径为42.86nm，Zeta电位为-40.4mV。
由图4A可知，3329cm-1处为氨基甲酸酯结构中N-H的伸缩振动吸收峰；2750-3000cm-1处为-CH2和-CH3的伸缩振动峰；1712cm-1附近处的吸收峰为氨酯基中的C＝O的伸缩振动峰；1112cm-1附近处为C-O-C的伸缩振动峰，2240-2270cm-1区域内异氰酸根基团特征吸收峰基本消失，说明聚氨酯体系中的异氰酸根已经完全参与了反应，这些特征峰的出现或消失表明实验成功合成了聚氨酯。
制备得到的聚氨酯乳液的固含量一般较高，可以用蒸馏水稀释成所需要的浓度。
2、SIS粉末的制备
本发明中，SIS粉末采用现有技术的常规方法制备得到，例如采用下述方法制备SIS粉末：
1)取新鲜猪小肠，用水冲去内容物，盐揉搓后用水反复冲洗3次。用手术刀剖开小肠，并剪成10～20cm长的肠段；
2)用压舌板刮除小肠的肌层和浆膜层，4℃下保存于生理盐水中；
3)去离子水漂洗干净并滤干后将其浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中(三氯甲烷：甲醇＝1：1)4小时，平均2 h换一次液，0.5 h搅拌一次；
4)去离子水反复清洗后放入浓度为0.25％的胰蛋白酶液里，4℃处理过夜；
5)用去离子水漂洗10次后用0.5％的SDS处理至少4 h；
6)清洗后置于–70℃下冻干24 h。
7)将低温粉碎的SIS加入含有3％醋酸,0.1％胃蛋白酶的PBS溶液中，搅拌48 h，调PH至中性后，冻干，再粉碎，即得到小肠粘膜下层粉末。铝塑袋热封；环氧乙烷消毒。
对SIS分别进行平均粒径检测和Zeta电位检测，结果分别如图2(A)、(B)所示。
由图2可知，SIS水溶液的平均粒径为815.6nm，Zeta电位为-15.2mv。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为21％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：将所述溶胶倒入24孔板中，-40℃预冻后真空冻干成型。
3)交联：将所得材料浸泡于两倍材料体积的pH为7.4的2.5％(w/v)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液中，室温下交联36h后用饱和食盐水洗三次，除去残留的EDC。再用大量去离子水洗涤材料，冻干，环氧乙烷灭菌，即可。
实施例2本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
1)预聚：将摩尔比为1.45:0.5的异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)和聚四氢呋喃1000(PTMG 1000)，其中异佛尔酮二异氰酸酯为0.1mol，加入三颈瓶中，加入0.2ml辛酸亚锡催化剂，在74℃下预聚2h50min；
2)扩链：将PTMG 1000/DMBA摩尔比为5:5的2,2-二羟甲基丙酸(DMPA)在54℃下反应3h。反应过程中观察体系粘度，必要时可加入适量丙酮调节反应体系的粘度，目测反应体系在搅拌过程中不在搅拌杆上聚集的粘度均可，使反应维持在平稳状态下进行；
3)中和乳化：室温下，将TEA/DMPA摩尔比为1.5:1的三乙胺加入到体系中，搅拌20min后滴加到250ml丙酮水溶液(丙酮：去离子水＝1：4)中，在转速为1300rpm的条件下高速搅拌2h；
4)纯化：55℃温度下旋蒸，除去乳液中的丙酮和三乙胺，去离子水透析三天除去杂质。
对聚氨酯乳液分别进行平均粒径检测和Zeta电位检测以及傅里叶红外光谱分析，结果分别如图3(A)、(B)以及图4(B)所示。
由图3可知，聚氨酯乳液的平均粒径为15.18nm，Zeta电位为-34.5mV。
由图4B可知，3334cm-1处为氨基甲酸酯结构中N-H的伸缩振动吸收峰；2750-3000cm-1处为-CH2和-CH3的伸缩振动峰；1698cm-1附近处的吸收峰为氨酯基中的C＝O的伸缩振动峰；1103cm-1附近处为C-O-C的伸缩振动峰，2240-2270cm-1区域内异氰酸根基团特征吸收峰基本消失，说明聚氨酯体系中的异氰酸根已经完全参与了反应，这些特征峰的出现或消失表明实验成功合成了聚氨酯。
制备得到的聚氨酯乳液的固含量一般较高，可以用蒸馏水稀释成所需要的浓度。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为21％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：将所述溶胶倒入24孔板中，-40℃预冻后真空冻干成型。
3)交联：将所得材料浸泡于两倍材料体积的pH为7.4的2％(w/v)京尼平中，室温下交联36h后用饱和食盐水洗三次，再用大量去离子水洗涤材料，冻干，环氧乙烷灭菌，即可。
实施例3本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
与实施例2相同。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为21％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：将所述溶胶倒入24孔板中，-40℃预冻后真空冻干成型。
3)交联：将所得材料浸泡于两倍材料体积的pH为5.5的2.5％(w/v)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中，室温下交联36h后用饱和食盐水洗三次，除去残留的EDC。再用大量去离子水洗涤材料，冻干，环氧乙烷灭菌，即可。
实施例4本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
与实施例1相同。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为21％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：将所述溶胶倒入24孔板中，-40℃预冻后真空冻干成型。
3)交联：将所得材料浸泡于两倍材料体积的pH为5.5的2.5％(w/v)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)中，室温下交联36h后用饱和食盐水洗三次，除去残留的EDC。再用大量去离子水洗涤材料，冻干，环氧乙烷灭菌，即可。
实施例5本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
试验条件与实施例1相同。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为3％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：与实施例1相同。
3)交联：与实施例1相同。
实施例6本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
PTMG 1000/DMBA的摩尔比为3:7，其他条件与实施例1相同。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为3％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：与实施例1相同。
3)交联：与实施例1相同。
实施例7本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
IPDI与PTMG 1000的摩尔比为1.85:0.5，其他条件与实施例1相同。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为3％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：与实施例1相同。
3)交联：与实施例1相同。
实施例8本发明PU/SIS复合材料的制备
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
试验条件与实施例1相同。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合材料制备与成型
1)配制：将0.1g SIS粉末加入到10g固含量为5％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，得到聚氨酯/SIS溶胶。
2)成型：与实施例1相同。
3)交联：与实施例1相同。
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
试验例1对比试验
1、制备阴离子水性聚氨酯乳液
PTMG 1000/DMBA的摩尔比为7:3，其他条件与实施例1相同。
2、SIS粉末的制备
与实施例1相同。
3、PU/SIS复合
将0.3g SIS粉末加入到10g固含量为3％的聚氨酯乳液中，室温下搅拌3h，聚氨酯/SIS发生了团聚，形成了絮凝状沉淀，如图5所示。
由此可见，在PTMG 1000/DMBA的摩尔比在本发明范围以外时，无法制备得到本发明复合材料。
试验例2本发明复合材料的力学性能测试
取相同大小的实施例1～4制备的复合材料及未交联的PU/SIS复合材料(其他条件与实施例2相同，只是不进行交联)进行拉伸强度和断裂伸长率测试，结果如图6(A)、(B)和表1所示：。
表1拉伸强度和断裂伸长率的测试
| 组别 | 拉伸强度(kPa) | 断裂伸长率(％) |
| PUb/SIS未交联 | 50 | 19.97 |
| 实施例1(PUa1/SIS) | 1080 | 142.7 |
| 实施例2(PUb1/SIS) | 250 | 19.46 |
| 实施例3(PUb2/SIS) | 450 | 432.1 |
| 实施例4(PUa2/SIS) | 940 | 76.59 |
注：SIS交联或SIS凝胶所得的材料力学强度太差，超出了仪器的检测范围。
由图6和表1中可以看出，实施例1～4的PU/SIS复合材料的拉伸强度和断裂伸长率均高于未交联组；其中，实施例1的PU/SIS复合材料的拉伸强度最高，是PU/SIS未交联的20倍，断裂伸长率为142.7％。
试验结果说明，本发明PU/SIS复合材料具有优良的力学性能，其拉伸强度和断裂伸长率均较高，可以满足软组织缺损修复材料对力学性能的要求；同时还说明交联是制备得到本发明复合材料的必要步骤。
试验例3本发明PU/SIS复合材料的试验研究
对实施例1制备的PU/SIS复合材料，分别进行下述试验：
对照组PU材料是由实施例1制备的阴离子聚氨酯乳液经冷冻干燥后，再用EDC交联而成。
1.回弹性测试
取相同大小的实施例1制备的PU/SIS复合材料及PU材料进行压缩强度、压缩模量以及压缩循环曲线的测试。圆柱体试样(12*12mm，n＝3)压缩性能试验在万NSTRON 5567材料试验机上进行，压缩测试速度为3mm/min，试样应变量为试样总高度的50％，循环次数为3次，记录样品的最大应力。样品数为3个，取其平均值，结果如图7(A)-(F)所示。
由图7可以得出：
(1)由图7(A)、(B)可知，PU/SIS复合材料的压缩强度和弹性模量与PU组相近，其中，PU/SIS复合材料的力学指标的标准差更小，说明SIS的加入使得材料的力学性能更加均一可控；
(2)由图7(C)、(D)可知，PU组与PU/SIS复合材料第二次和第三次回弹曲线与第一次均比较靠拢，说明试样经3次压缩后材料结构没有发生明显变化，PU/SIS复合材料与PU组均具有很好的回弹性；
(3)由图7(E)、(F)可知，PU/SIS复合材料的组内重复性较好，说明材料的力学的可重复性好。
试验结果说明，本发明PU/SIS复合材料的回弹性好，力学性能更加均一可控。
2.扫描电镜检测结构
通过扫描电镜观察实施例1制备的PU/SIS复合材料的微结构，结果如图8所示。
由图8可知，本发明PU/SIS复合材料为三维多孔结构，孔径均匀，且孔洞间相互贯通。PU/SIS的孔径大小在30-150μm之间，平均孔径为62.44±23.74μm，该孔径分布适合细胞的粘附爬行，有利于诱导细胞和毛细血管的长入，促进细胞的增殖。
3.细胞相容性研究
单纯SIS制备的多孔片状海绵易溶解于水和培养基中，失去多孔海绵形态，故无法作为对照组。
a、弹性体生物材料对HUVECs生长增殖的影响
调整人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞浓度为2×104/ml，接种于96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液。24h后，吸弃培养基，每孔加200μl PU或PU/SIS复合材料的浸提液，空白对照组为含10％血清的培养基，阳性对照组为含0.64％苯酚的完全培养基，隔天换液。第1天，第3天，第5天取5孔加入浓度为10％的CCK8溶液110ul，37℃孵育2小时后，终止培养，450nm波长测每孔吸光度，计算5孔均值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴，绘制生长曲线，如图9所示。
由图9可知，PU/SIS复合材料及PU材料的细胞存活率均高于75％，且PU/SIS弹性体生物材料促进HUVECs的生长增殖能力与空白对照组相当。
b、PU/SIS复合材料的细胞相容性研究
调整人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞浓度为5×105/ml，种植于24孔板中，每孔加细胞悬液10μl，7h后加400μl的完全培养基，隔天换液。于培养后第3天，第5天，第8天进行活死细胞染色，有活力的HUVECs和死亡的HUVECs分别被钙黄绿素(AM)和碘化吡啶(PI)着色，材料被Hoechest着色，结果如图10所示，绿色荧光为有活力的细胞，红色荧光为死亡的细胞，蓝色荧光为材料。
由图10可以看出，在PU/SIS复合材料上生长的HUVECs几乎全部为有活力的细胞，且观察到三个时间点细胞的增殖情况与CCK8结果一致；而在对照组PU材料上生长的HUVECs死细胞相对较多，细胞增殖速度较慢。
上述结果说明，本发明PU/SIS复合材料对细胞，尤其是HUVECs生长增殖无影响，复合材料的细胞相容性好。
4.组织相容性研究
单纯SIS制备的多孔片状海绵易溶解于水和培养基中，在应用于软组织缺损修复材料时容易失去多孔海绵形态，也无法作为本发明的对照组。
分别取1cm×0.2cm×0.2cm大小PU/SIS复合材料，PU材料植入雄性SD大鼠(250-270g)背部皮下，植入后于2，4，8周分别取材(n＝3)进行组织学观察，结果如图11和图12所示。
由图11可知，PU/SIS复合材料在第2，4，8周炎性反应较轻，材料周边微血管分布丰富(图11(D)～(F))；而PU材料炎性反应较严重(图11(A)～(C))，微血管分布少。
由图12可知，PU/SIS复合材料的纤维囊较薄，且不随着时间增加而变厚(图12(D)～(F))，显示出较好的组织相容性；而PU材料纤维囊较厚(图12(A)～(C))。
试验结果说明，本发明PU/SIS复合材料的组织相容性好，免疫原性低。
综上所述，本发明PU/SIS复合材料，同时具有聚氨酯和SIS的优良性能，既具有良好的回弹性能、力学性能，又具有生物活性、生物相容性，可诱导和促进组织结构的再生和修复，克服了现有软组织缺损修复材料只具有单一方面的性能以及应用受到限制等缺陷；同时，本发明复合材料，为三维多孔结构，孔径均匀，且孔洞间相互贯通，生物相容性好，免疫原性低，具有良好的应用前景。
Claims (19)
1.一种聚氨酯/小肠粘膜下层复合材料，其特征在于：它是由下述步骤的方法制备而成：
a、将阴离子水性聚氨酯乳液与小肠粘膜下层混匀，真空冻干成型；
其中，小肠粘膜下层的用量是聚氨酯乳液的0.01～0.03倍(w/w)，所述聚氨酯乳液的平均粒径为15.18nm～42.86nm，固含量为3％～21％；
b、交联，真空冻干，即得。
2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤a中，所述聚氨酯乳液由如下方法制备得到：
(1)预聚：取异氰酸酯与羟基供体，预聚，二者的摩尔比为(1.45～1.85)：0.5；
所述异氰酸酯为异佛尔酮二异氰酸酯、L-赖氨酸二异氰酸酯、二苯基甲烷二异氰酸酯中的任意一种或多种；所述羟基供体为聚乙二醇、聚四氢呋喃、丙二醇、1,4-丁二醇中的任意一种或多种；
(2)扩链：加入扩链剂，扩链，其中，扩链剂与步骤(1)中羟基供体的摩尔比为(3～7)：3；
所述扩链剂为2,2-二羟甲基丁酸、2,2-二羟甲基丙酸、N-甲基二乙醇胺、二乙醇胺中的任意一种或多种；
(3)中和乳化：加入中和剂，搅匀，然后将反应体系滴加到20％(v/v)的丙酮水溶液中，高速搅拌1～2h；其中，中和剂与步骤(2)中扩链剂的摩尔比为1.5:1；高速搅拌的转速为1200～1400rpm；
所述中和剂为三乙胺或氢氧化钠；
(4)纯化：旋蒸除去丙酮和过量中和剂，去离子水透析除去杂质，即得。
3.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于：步骤(1)中，所述异氰酸酯与羟基供体的摩尔比为1.45：0.5。
4.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于：步骤(1)中，优选地，所述异氰酸酯为异佛尔酮二异氰酸酯。
5.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于：步骤(1)中，所述羟基供体为聚四氢呋喃。
6.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于：步骤(2)中，所述扩链剂为2,2-二羟甲基丁酸或2,2-二羟甲基丙酸。
7.根据权利要求2所述的复合材料，其特征在于：
步骤(1)中，预聚的温度为70℃～80℃；预聚的时间为1～5h；预聚采用的催化剂为辛酸亚锡、三乙醇胺或二月桂酸二丁基锡；
步骤(2)中，扩链的温度为50℃～55℃；扩链的时间为1～5h；
步骤(3)中，高速搅拌的转速为1300rpm；高速搅拌的时间为2h；
步骤(4)中，旋蒸的温度为55℃。
8.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤a中，小肠粘膜下层的用量是聚氨酯乳液的0.03倍(w/w)。
9.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤a中，所述小肠粘膜下层按照下述方法制备得到：
(i)取猪小肠，水洗，剖开，剪成段；
(ii)刮除小肠的肌层和浆膜层；
(iii)水洗滤干后，将其浸入三氯甲烷与甲醇的混合溶液中，浸泡时间为4小时，所述混合溶液中三氯甲烷与甲醇的体积比为1：1；
(iv)水洗后，放入胰蛋白酶溶液中，4℃处理过夜；
(v)水洗后，用SDS处理至少4h；
(vi)清洗后，冻干；
(vii)粉碎，加入含有3％醋酸、0.1％胃蛋白酶的PBS溶液中，调pH至中性后，冻干，再粉碎，即得。
10.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤a和b中，真空冻干的温度为-40～-80℃。
11.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤b中，交联时间为12～48h。
12.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于：步骤b中，所述交联的方法是：将步骤a制得的材料浸泡于交联剂溶液中；
其中，交联剂是1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、京尼平或戊二醛。
13.根据权利要求12所述的复合材料，其特征在于：所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或京尼平。
14.根据权利要求12或者13所述的复合材料，其特征在于：
所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐时，交联剂溶液的浓度为1％～5％；pH值为3～9；
或者，所述交联剂为京尼平时，交联剂溶液的浓度为0.1％～2％；pH值为3～9。
15.根据权利要求14所述的复合材料，其特征在于：所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐时，交联剂溶液的浓度为2.5％。
16.根据权利要求14所述的复合材料，其特征在于：所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐时，交联剂溶液的pH值为5.5～7.4。
17.根据权利要求14所述的复合材料，其特征在于：所述交联剂为京尼平时，交联剂溶液的浓度为2％。
18.根据权利要求14所述的复合材料，其特征在于：所述交联剂为京尼平时，交联剂溶液的pH值为7.4。
19.权利要求1～18任意一项所述复合材料在制备软组织缺损修复材料中的应用。
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