CN111282021A - 半月板复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种半月板复合支架及其制备方法，方法包括：依次层叠多个复合层以形成半月板复合支架的预成型体，其中，各复合层包含多个相互间隔排列的支架纤维和位于相邻支架纤维之间且呈凝胶状态的水凝胶浆料，支架纤维包含可降解高分子材料，水凝胶浆料包含水凝胶和血小板衍生生长因子PDGF，相邻两个复合层的支架纤维之间呈预设角度；使预成型体中的水凝胶浆料交联固化，得到半月板复合支架。本发明提供的半月板复合支架具有较好的半月板损伤再生修复效果。

Description

半月板复合支架及其制备方法
技术领域
本发明属于半月板损伤修复材料技术领域，具体涉及一种半月板复合支架及其制备方法。
背景技术
在临床工作中发现，半月板损伤是最常见的关节内损伤之一。半月板损伤后会导致相邻的关节软骨损伤，诱发骨关节炎，影响患者生活质量。然而，半月板因其缺乏血管、神经以及高度致密的组织类型而难以实现自身修复，且周围组织内的干细胞也难以向半月板损伤区域迁移。目前临床上常采用半月板修整和部分切除等手术来治疗半月板损伤。虽然部分半月板切除后可保留一定的半月板功能，但仍无法避免远期的关节软骨损伤，最终仍会导致骨关节炎。
发明内容
因此，本发明提供一种具有较好的半月板损伤修复效果的半月板复合支架及其制备方法。
第一方面，本发明提供一种半月板复合支架的制备方法，其包括：
依次层叠多个复合层以形成半月板复合支架的预成型体，其中，各复合层包含多个相互间隔排列的支架纤维以及位于相邻支架纤维之间且呈凝胶状态的水凝胶浆料，支架纤维包含可降解高分子材料，水凝胶浆料包含基质材料和血小板衍生生长因子(Plateletderived growth factor，PDGF)，相邻两个复合层的支架纤维之间呈预设角度；
使预成型体中的水凝胶浆料交联固化，得到半月板复合支架。
在本发明第一方面的实施例中，基质材料包括脱细胞半月板细胞外基质(decellularized meniscal extracellular matrix，dMECM)、脱细胞软骨细胞外基质、糖胺多糖、I型胶原、II型胶原、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸和甲基丙烯酸酯化明胶(Methacrylated Gelatin，GelMA)中的一种或多种；和/或，PDGF包括PDGF-BB。
在本发明第一方面的实施例中，dMECM的制备方法可包括：
对半月板碎块进行无菌处理；
对无菌的半月板碎块进行湿法粉碎，获得浆料；
采用差速离心法对浆料进行脱细胞处理，获得dMECM。
在本发明第一方面的实施例中，可降解高分子材料包括聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-聚己内酯共聚物(PCLA)、聚氨基酸(PAA)及聚乙醇酸(PGA)中的一种或多种。
在本发明第一方面的实施例中，水凝胶浆料在溶液状态时可包含5μg/mL～20μg/mL的PDGF。
在本发明第一方面的实施例中，水凝胶浆料在溶液状态时可包含1％～1.5％重量/体积的脱细胞半月板细胞外基质、9％～12％重量/体积的甲基丙烯酸酯化明胶和0.15％～0.25％重量/体积的光引发剂。
在本发明第一方面的实施例中，半月板复合支架可采用三维生物打印技术制备，包括：
设置打印平台的温度为18℃～20℃；
将可降解高分子材料加入与第一喷头相连的第一料筒中打印支架纤维，将水凝胶浆料加入与第二喷头相连的第二料筒中打印凝胶状态的水凝胶浆料，以制备依次层叠的多个复合层，得到预成型体，其中，第一料筒的温度为80℃～85℃，第二料筒的温度为20℃～24℃并在打印最后一个所述复合层时转变为25℃～26℃；
采用蓝光照射预成型体30s～60s，使预成型体中的水凝胶浆料交联固化，得到半月板复合支架。
在本发明第一方面的实施例中，第一喷头的内径为350μm～450μm，第一喷头的打印速度为3mm/s～5mm/s；复合层中相邻两个支架纤维的中心线间距为1.2mm～1.5mm；第二喷头的内径为450μm～550μm，第二喷头的打印速度为3mm/s～5mm/s。
第二方面，本发明提供一种半月板复合支架，其包括：
支架框体，包括在自身高度方向依次层叠设置的多个支架层，每个支架层包括间隔设置的多个支架纤维，且相邻两个支架层的支架纤维之间呈预设角度，支架纤维包含可降解高分子材料；
固化的水凝胶材料，复合于支架框体的孔隙中，固化的水凝胶材料内分布有血小板衍生生长因子PDGF，且固化的水凝胶材料呈多孔结构。
在本发明第二方面的实施例中，其特征在于，支架框体中，第N个支架层的支架纤维与第N+1个支架层中的支架纤维之间的角度为45°～90°，第N个支架层的支架纤维与第N+2个支架层中的支架纤维之间平行且错位设置，N为大于等于1的整数。
相对于现有技术，本发明至少具有以下有益效果：
本发明以可降解高分子材料支架纤维模拟完整半月板纤维的空间排列，构建支架框体，使半月板复合支架具有较好的力学性能。在支架框体的大孔结构中复合固化的水凝胶材料，能提高半月板复合支架的生物相容性，同时为细胞提供良好的微环境。将PDGF负载于水凝胶材料中，能保护PDGF的生物活性，同时实现PDGF的有序缓释，从而能持续有效地发挥PDGF募集细胞、促细胞增殖和促细胞外基质产生的生理作用。因此，采用本发明的半月板复合支架能获得较好的半月板损伤再生修复效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例的半月板复合支架的三维打印模型效果图。
图2为本发明一个实施例的半月板复合支架中支架框体的示意图，其中，A为截面图，B为俯视图。
图3为半月板支架的大体观示意图，其中，A为PCL半月板支架，B为未负载PDGF的半月板复合支架，c为本发明实施例的半月板复合支架。
图4为本发明一个实施例的半月板复合支架的SEM切面观察图，其中，A是纵切面观，B是横切面观。
图5为半月板支架的细胞迁移实验结果图像，其中，A为阴性对照组，B为PCL半月板支架组，C为未负载PDGF的半月板复合支架组，D为本发明实施例的半月板复合支架组。
图6为半月板支架的细胞迁移实验结果统计图，其中，A为阴性对照组，B为PCL半月板支架组，C为未负载PDGF的半月板复合支架组，D为本发明实施例的半月板复合支架组。
图7为半月板支架的CCK-8实验结果统计图，其中，A为阴性对照组，B为PCL半月板支架组，C为未负载PDGF的半月板复合支架组，D为本发明实施例的半月板复合支架组。
图8为半月板支架的死活染色实验结果图像，其中，A为PCL半月板支架组，B为未负载PDGF的半月板复合支架组，C为本发明实施例的半月板复合支架组。
图9为半月板支架和滑膜干细胞体外共培养后的SEM图像，其中，A为PCL半月板支架组，B为未负载PDGF的半月板复合支架组，C为本发明实施例的半月板复合支架组。
图10为半月板支架的压缩模量统计图，其中，A为PCL半月板支架组，B为半月板复合支架组。
图11为半月板支架的拉伸模量统计图，其中，A为PCL半月板支架组，B为半月板复合支架组。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本申请，并非为了限定本申请。
为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“以上”、“以下”为包含本数，“多种(个)”的含义是两种(个)以上。
本申请的上述发明内容并不意欲描述本申请中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。
本发明第一方面的实施例提供一种半月板复合支架的制备方法，该方法包括：
S100，制备依次层叠的多个复合层，得到半月板复合支架的预成型体，其中，复合层包含多个相互间隔排列的支架纤维和位于相邻支架纤维之间且呈凝胶状态的水凝胶浆料，支架纤维包含可降解高分子材料，水凝胶浆料包含基质材料和血小板衍生生长因子PDGF，相邻两个复合层的支架纤维之间呈预设角度；
S200，使预成型体中的水凝胶浆料交联固化，得到半月板复合支架。
本发明以可降解高分子材料支架纤维模拟正常半月板胶原纤维的空间排列，构建支架框体，使半月板复合支架具有较好的力学性能。更优选地，半月板复合支架采用具有该空间结构的支架框体，能使新生半月板仿生正常半月板的胶原纤维走行和排列。
在支架框体的大孔结构中复合固化的水凝胶材料，能提高半月板复合支架的生物相容性，同时为细胞提供良好的微环境，有利于细胞的迁移、粘附和生长。
由于自体细胞来源的有限性和迁移的困难性，半月板复合支架对特定细胞的有效募集是半月板损伤修复过程中面临的主要问题。因此，在三维支架中构建并实现募集特定细胞的信号体系则显得尤为关键。本发明通过将PDGF负载于支架中，使得半月板复合支架对周围组织的软骨细胞和间充质干细胞均有强烈的趋化作用。PDGF还能结合并激活PDGF受体，从而产生促细胞增殖和促细胞外基质产生的生理作用。并且，本发明使PDGF负载于基质材料中，还很好地解决了PDGF因在体内环境中受到多种酶的作用而很容易失活并快速降解的问题。通过使PDGF分布于基质材料中，能保护PDGF的生物活性，同时实现PDGF的有序缓释，从而能持续有效地发挥PDGF募集细胞、促细胞增殖和促细胞外基质产生的生理作用。
因此，将该组织工程半月板复合支架植入半月板缺损处，能在提供有效力学支撑的情况下，使凝胶材料在体内的降解过程得到减缓，尤其是使PDGF在长时间尺度上维持有效作用浓度，由此实现有效地原位招募周围组织内的细胞，尤其是干细胞，并促进细胞增殖和细胞外基质产生，从而形成新生半月板组织来替换复合支架，达到优良的原位诱导半月板组织再生的效果。
在一些实施例中，可降解高分子材料包括化学合成的聚合物。采用化学合成的聚合物制备的支架框体，其降解速率适当且力学强度较好，能使半月板复合支架具有较好的力学性能，且易于加工。作为具体的示例，化学合成的聚合物可包括聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-聚己内酯共聚物(PCLA)、聚氨基酸(PAA)及聚乙醇酸(PGA)中的一种或多种。
优选地，可降解高分子材料包括PCL。基于PCL的支架具有优良的力学性能、可降解性和良好的生物相容性。发明人发现，采用PCL支架框体的半月板复合支架在提供的有效力学支撑情况下，凝胶材料在体内的降解过程将进一步减缓，可实现PDGF在更大的时间尺度上的作用浓度维持，同时其降解的速率与组织再生的进程相协调，便于迁移来的细胞进一步的形成新生组织替换支架。半月板组织的再生修复将得到进一步改善。
进一步地，PCL的数均分子量为1×104～1×105，更优选为3×104～6×104，尤其优选为4.5×104～5×104。
在一些实施例中，基质材料可包括脱细胞细胞外基质(dECM)、糖胺多糖、I型胶原、II型胶原、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸和甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)中的一种或多种。基质材料具有生物相容性好、无细胞毒性和可降解性等特点，将其复合在支架上能提高支架的生物相容性。尤其是，基质材料有利于PDGF的负载，保护其生物活性的同时，改善PDGF的控缓释放性能，并且能为细胞提供迁移、粘附和生长的良好微环境。
优选地，基质材料包括dECM。天然的dECM既消除了原组织的免疫原性，又保留了大部分天然成分。dECM内含有的多种天然成分能提高半月板复合支架仿生正常的半月板成分的效果，尤其是为细胞提供优良的微环境。dECM优选包括脱细胞半月板细胞外基质(dMECM)和脱细胞软骨细胞外基质中的一种或多种，更优选包括dMECM。
优选地，基质材料包括dMECM和GelMA。本发明人从满足半月板组织修复的复杂需求出发，通过将dMECM和GelMA相结合来作为PDGF的载体，能更好地保护其生物活性并实现有序缓释，同时为细胞提供优良的微环境，从而进一步改善细胞的迁移、粘附和生长性能，使得半月板复合支架对半月板缺损的再生修复效果得到提高。
进一步地，GelMA的甲基丙烯酸酯化程度(MA化程度)可以为15％～90％，优选为50％～70％，如52％、55％、58％、60％、62％、65％或68％。GelMA的MA化程度在适当范围内，不仅能使水凝胶浆料具有良好的交联成形性能，而且使半月板复合支架的力学性能显著，还使半月板复合支架表现出优异的生物相容性能。
在一些优选的实施例中，水凝胶浆料在溶液状态时包含0.5％～2％重量/体积的dMECM和8％～15％重量/体积的GelMA。更优选地，水凝胶浆料在溶液状态时包含1％～1.5％重量/体积的dMECM和9％～12％重量/体积的GelMA。水凝胶浆料的固含量在适当范围内，不仅能仿生正常半月板中的天然成分，而且能使固化的水凝胶材料形成适宜的微孔结构，从而从成分和微结构上为细胞的粘附、增殖和迁移提供优良的微环境。
水凝胶浆料具有温敏性，例如，其在20℃～25℃呈类凝胶状态，23℃为凝胶点，25℃以上呈现溶液状态。因此，在一些实施例中，“水凝胶浆料在溶液状态时”指的是在25℃以上(如25℃～35℃)的水凝胶溶液。
在一些实施例中，PDGF可包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD中的一种或几种，优选包括PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB中的一种或几种，更优选包括PDGF-BB。
在一些实施例中，水凝胶浆料在溶液状态时的PDGF浓度可以为5μg/mL～20μg/mL，进一步地为8μg/mL～15μg/mL，更进一步地为10μg/mL～12μg/mL。这样能使半月板复合支架中负载较多的PDGF，由此能实现对内源性干细胞的有效招募和迅速增殖，大幅度提高半月板的再生修复效果。
在一些实施例中，水凝胶浆料中还含有光引发剂。光引发剂能促进水凝胶浆料的交联反应，提高交联效率。光引发剂优选包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基磷酸锂盐(LAP)。
优选地，水凝胶浆料在溶液状态时包含0.15％～0.25％重量/体积的光引发剂。光引发剂的含量能使固化后的水凝胶材料获得适当的交联密度，从而能进一步减缓其在体内的降解过程，实现在更大的时间尺度上维持PDGF的作用浓度。
在一些优选的实施例中，水凝胶浆料在溶液状态时包含1％～1.5％重量/体积的dMECM、9％～12％重量/体积的GelMA和0.15％～0.25％重量/体积的光引发剂。其中光引发剂优选LAP。
水凝胶浆料可以采用本领域已知的方法制备获得。水凝胶浆料的示例性制备方法包括：
S10，将dMECM分散于去离子水中，配制成3％～5％重量/体积的dMECM混悬液。
S20，将GelMA溶于去离子水中，配制成15％～20％重量/体积的GelMA溶液。优选地，为了保证GelMA溶液无菌，可对其进行灭菌处理。作为示例，对GelMA溶液进行巴氏灭菌，和/或，使用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器对GelMA溶液进行过滤灭菌。
S30，将dMECM混悬液与GelMA溶液混合，加入LAP溶液，得到dMECM/GelMA水凝胶混合液。
S40，将dMECM/GelMA水凝胶混合液与PDGF按比例混合，得到水凝胶浆料。步骤S40进行混合的温度优选为20℃～26℃。这样有利于保护PDGF的生物活性。
基质材料可按照本领域已知的方法制备得到或商购获得。在一些优选的实施例中，dMECM可由如下的制备方法制得：
S1，对半月板碎块进行无菌处理。
S2，对无菌的半月板碎块进行湿法粉碎，获得悬浮浆料；
S3，采用差速离心法对悬浮浆料进行脱细胞处理，获得dMECM。
采用湿法粉碎结合差速离心法制备dMECM，能有效地去除半月板组织中的细胞，同时能较大限度地保留天然的细胞外基质成分。
在步骤S1，半月板组织可来源于人体或其它动物，如猪、兔、羊、牛等。可将新鲜的半月板剪去多余的滑膜组织，并将其剪成体积大致为或小于1mm×1mm×1mm的薄片，获得半月板碎块。
在步骤S1，可将半月板碎块装入无菌容器内，采用医用过氧化氢溶液(又称双氧水)进行漂洗2～3次，每次5min～8min；然后采用无菌的磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBuffered Saline，PBS)对半月板碎块进行漂洗2～3次，每次5min～8min。在本文中，术语“无菌”指的是达到医学上的无菌要求。
在步骤S2，湿法粉碎是以蒸馏水为介质，机械粉碎组织碎块。其中蒸馏水优选三蒸水。
湿法粉碎可采用本领域已知的方法和装置进行。例如匀浆机。可将无菌的半月板碎块加入蒸馏水中，用匀浆机破碎成悬浮浆料。悬浮浆料的浓度可以为1％～3％重量/体积，如1％重量/体积。
在步骤S3，差速离心是对悬浮浆料中的颗粒进行多级离心分离处理，且后一级离心分离处理的离心速度和时间均大于前一级离心分离处理的离心速度和时间。通过差速离心处理，能有效地去除半月板中的细胞及其它免疫原性物质，同时较大限度地保留天然的外基质成分。
在一些优选的实施例中，步骤S3可包括：
S31，将悬浮浆料在0℃～4℃下以1200rpm～1500rpm离心3min～5min，获得第一上清液。
S32，将第一上清液在0℃～4℃下以1800rpm～2000rpm离心10min～15min，获得第二上清液。
S33，将第二上清液在0℃～4℃下以5000rpm～6000rpm离心15min～20min，获得第三上清液。
S34，将第三上清液在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm离心25min～30min，获得沉淀。
S35，使用PBS在0℃～4℃下以9000rpm～10000rpm对沉淀离心处理3～4次，每次离心处理的时间为25min～30min。
rpm即r/min(转/分)。
步骤S3可在低温高速离心机中进行，例如德国Thermo公司RC-6+型低温高速离心机。
可以理解的是，其它dECM也可以参照dMECM的制备方法制得。
在一些实施例中，半月板复合支架可采用三维生物打印技术制备。在这些实施例中，在步骤S100，采用三维生物打印技术制备半月板复合支架的预成型体。其中包括：
S110，设置打印平台的温度为18℃～20℃。
S120，将可降解高分子材料加入与第一喷头相连的第一料筒中并熔融，将水凝胶浆料加入与第二喷头相连的第二料筒中并使其保持在凝胶状态，利用第一喷头打印多个相互间隔排列的支架纤维，同时第二喷头将水凝胶浆料打印于相邻支架纤维之间，得到复合层；以此制备依次层叠的多个复合层，且使相邻两个复合层的支架纤维之间呈预设角度，得到预成型体。
在一些实施例中，在步骤S120，可以设置相邻两个复合层的支架纤维之间的角度为45°～90°。这样能使支架获得较高的综合力学性能，其中具有较好的压缩模量，可以在半月板组织再生过程中提供可靠的力学支撑。
在一些优选的实施例中，在预成型体中，第N个复合层的支架纤维与第N+1个复合层中的支架纤维之间的角度为45°～90°，且第N个复合层的支架纤维与第N+2个复合层中的支架纤维之间平行且错位设置，N为大于等于1的整数。这样能使支架获得更好的综合力学性能，其不仅具有较好的压缩模量，而且具有较好的拉伸模量，由此可以在半月板组织再生过程中提供稳定可靠的力学支撑，同时更好地适应膝盖弯曲时带来的作用力。
在一些实施例中，在步骤S120，第一料筒的温度优选为80℃～85℃。其中，可以在较高的T温度下对可降解高分子材料预热足够时间，使其完全熔融，然后将温度转变为80℃～85℃。T可以为95℃～105℃，如100℃。预热时间例如是5min～10min。
优选地，第二料筒的温度为20℃～24℃并在打印最后一个复合层时转变为25℃～26℃。由此，半月板复合支架内部的孔隙结构能形成较为粗糙的表面，有利于细胞的粘附和迁移，而支架的外壁面相对光滑，能避免支架植入体内后对例如关节软骨等周围组织造成磨擦损伤或其它损害。
在一些实施例中，在步骤S120，优选地，第一喷头的内径为350μm～450μm。第一喷头打印的支架纤维具有适当的直径，能使支架获得良好的力学性能。
优选地，复合层中相邻两个支架纤维的中心线间距为1.2mm～1.5mm。这样能使支架框体具有较高的力学性能的同时，还较好地仿生正常半月板中胶原纤维的排列度和孔结构，让细胞更易于迁移，并在迁移过程中完成增殖和分化，实现更好的再生修复效果。
优选地，第二喷头的内径为450μm～550μm。
在一些实施例中，在步骤S120，优选地，复合层的层高为150μm～250μm。
在一些实施例中，在步骤S120，优选地，第一喷头的打印速度为3mm/s～5mm/s。优选地，第二喷头的打印速度为3mm/s～5mm/s。
在一些实施例中，在步骤S110之前，还可包括步骤S130：构建半月板复合支架的三维数据模型。根据三维数据模型进行后续的打印操作。
作为示例，在步骤S130，可以经体外组织学、生物力学等方面综合分析半月板不同层次参数，根据半月板结构及力学特性设定支架层-层之间排列度及孔径大小，经计算机辅助设计构建半月板三维数据模型。然后，基于CAD设计的形状，经Magics设计支架内部结构，利用三维-Bioplotter软件制备仿生半月板微结构的组织工程半月板复合支架的三维数据模型。
在步骤S200，采用蓝光照射预成型体30s～60s，使预成型体中的水凝胶浆料交联固化，得到半月板复合支架。
在一些实施例中，在步骤S200，可采用波长为400nm～450nm的蓝光进行照射交联，优选波长为405nm～410nm的蓝光。照射的距离可以为0.5cm～2cm，优选1cm～1.5cm。
在一些实施例中，还可以在打印完首个复合层后，对其进行预交联1s～5s，如2s～3s，之后进行后续的打印。待打印完成后，对预成型体进行照射交联。
制备得到半月板复合支架后，可以将其放入0.9％重量/体积的NaCl水溶液(即生理盐水)中，在4℃下进行浸泡储存。
本发明实施方式还提供一种组织工程半月板复合支架，其包括支架框体和复合于支架框体的固化的水凝胶材料。
支架框体包括在自身高度方向依次层叠设置的多个支架层，每个支架层包括间隔设置的多个支架纤维，且相邻两个支架层的支架纤维之间呈预设角度，支架纤维包含可降解高分子材料。
固化的水凝胶材料复合于支架框体的孔隙中，固化的水凝胶材料内分布有血小板衍生生长因子PDGF，且固化的水凝胶材料呈多孔结构。
本发明的半月板复合支架中，支架框体采用可降解高分子材料，并且模拟了正常半月板胶原纤维的空间排列，使得半月板复合支架具有较好的力学性能。更优选地，半月板复合支架采用具有该空间结构的支架框体，能使新生半月板仿生正常半月板的胶原纤维走行和排列。在支架框体的大孔结构中复合固化的水凝胶材料，能提高半月板复合支架的生物相容性，同时为细胞提供良好的微环境，有利于细胞的迁移、粘附和生长。
本发明通过将PDGF负载于支架中，使得半月板复合支架对周围组织的软骨细胞和间充质干细胞均有强烈的趋化作用。PDGF还能结合并激活PDGF受体，从而产生促细胞增殖和促细胞外基质产生的生理作用。并且，本发明通过使PDGF分布于固化的水凝胶材料中，能保护PDGF的生物活性，同时实现PDGF的有序缓释，从而能持续有效地发挥PDGF募集细胞、促细胞增殖和促细胞外基质产生的生理作用。
因此，将半月板复合支架植入半月板缺损处，能在提供有效力学支撑的情况下，使凝胶材料在体内的降解过程得到减缓，尤其是使PDGF在长时间尺度上维持有效作用浓度，由此实现有效地原位招募周围组织内的细胞，尤其是干细胞，并促进细胞增殖和细胞外基质产生，从而形成新生半月板组织来替换复合支架，达到优良的原位诱导半月板组织再生的效果。
在一些实施例中，相邻两个支架层的支架纤维之间的角度为45°～90°。
在一些优选的实施例中，在支架框体中，第N个支架层的支架纤维与第N+1个支架层中的支架纤维之间的角度为45°～90°，且第N个支架层的支架纤维与第N+2个支架层中的支架纤维之间平行且错位设置，N为大于等于1的整数。作为具体的示例，支架框体包括交错层叠的多个第一支架层和第二支架层，第一支架层中的支架纤维与第二支架层中的支架纤维之间相交，夹角为45°～90°；位于第二支架层两侧的第一支架层的支架纤维之间平行且错位设置，位于第一支架层两侧的第二支架层的支架纤维之间平行且错位设置。例如图2所示。
本发明提供的组织工程半月板复合支架可采用前文所述的任意一种制备方法制备得到。因此，半月板复合支架也具有相应的有益效果。
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
以下实施例中采用的：
PCL：数均分子量45000，SIGMA公司提供，货号：704105-100G。
PBS：中国Solarbio公司提供，pH＝7.4(25℃)。
PDGF-BB：Novoprotein公司提供。
GelMA干粉：上普(北京)生物科技有限公司提供，货号SP-BI-G01-2。
2.5％重量/体积的LAP溶液：上普(北京)生物科技有限公司提供，货号SP-BI-C02-1。
DMEM/F12培养液：美国Corning公司提供。
生物打印机：上普博源(北京)生物科技有限公司的SUNP BIOMAKER。
实施例1
1)dMECM制备：将新鲜的猪半月板剪去多余的滑膜组织，并将其剪成体积大致为1mm×1mm×1mm的碎块。将半月板碎块装入无菌的容器中，使用医用双氧水(3％)漂洗3次，每次5min；再使用PBS漂洗3次，每次5min。将无菌的半月板碎块加入三蒸水中，用匀浆机破碎成悬浮浆料。悬浮浆料的浓度为1％重量/体积。在RC-6+型低温高速离心机中，在4℃下以1500rpm对悬浮浆料离心5min，分离大颗粒的悬浮微粒；之后取上清液在4℃下以2000rpm离心15min，再次取上清液在4℃下以6000rpm离心20min，最后取上清液在4℃下以10000rpm离心30min，收集沉淀。然后将沉淀与无菌PBS混匀，继续在4℃下以10000rpm离心30min，重复3次。得到dMECM。将所得dMECM与去离子水混合，制成浓度为3％重量/体积的混悬液。
2)GelMA溶液制备：将GelMA溶于去离子水中，配制成20％重量/体积的GelMA溶液。对GelMA溶液进行巴氏灭菌，并使用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤器对GelMA溶液进行过滤灭菌。
3)水凝胶浆料制备：取0.5mL的GelMA溶液、0.5mL的dMECM混悬液和0.1mL的LAP溶液混匀，得到水凝胶混合液；取0.5mL的水凝胶混合液添加50μL的PDGF-BB溶液混匀，混合温度为20℃～26℃，得到水凝胶浆料。水凝胶浆料在溶液状态时(25℃以上)包含1.5％重量/体积的dMECM、10％重量/体积的GelMA、0.25％重量/体积的光引发剂LAP、以及10μg/mL的PDGF-BB。
4)半月板复合支架制备
(41)构建三维数据模型：使用CAD设计半月板复合支架的形状，经Magics设计支架内部结构，利用三维-Bioplotter软件制备组织工程仿生的半月板复合支架的三维数据模型。
(42)对三维数据模型进行处理，建立打印程序。按照图1及图2设定打印模式为十字错层交叉网格型(图1中浅色为支架纤维，深色为打印的水凝胶浆料)，打印层高为200±50μm，每层中相邻两个支架纤维的中心线间距为1.5mm，相邻两层的支架纤维之间垂直。
(43)打印半月板复合支架：将PCL加入与第一喷头相连的第一料筒中，在100℃预热5min使其完全熔融，之后设置第一料筒内的温度为85℃，进行打印支架纤维。将水凝胶浆料加入与第二喷头相连的第二料筒中，第二料筒内的温度设置为T2以其保持在凝胶状态。其中打印首层和中间层时T2为20℃，并在打印最后一层时转变为26℃。第二喷头将水凝胶浆料打印于相邻两支架纤维之间。打印首层后，采用波长405nm的蓝光照射，进行预交联2s，之后进行后续的打印，得到预成型体。采用波长405nm的蓝光照射预成型体30s，使水凝胶浆料交联，得到规格为24mm×24mm×2.0mm的半月板复合支架。
其中，打印平台的温度设置为20℃。第一喷头采用内径为400μm的高精密点胶喷头(不锈钢喷嘴)，打印速度为5mm/s。第二喷头采用内径为500μm的点胶喷头，打印速度为5mm/s，水凝胶浆料打印后溶胀至800μm～900μm。
将半月板复合支架放入0.9％重量/体积的NaCl水溶液中，在4℃下进行浸泡储存。进行后续测试将支架取出冻干，并进行钴60灭菌。
对比例1
与实施例1不同的是，打印单纯的PCL半月板支架，未复合水凝胶浆料且未负载PDGF-BB。
对比例2
与实施例1不同的是，水凝胶浆料中未添加PDGF-BB，即打印未负载PDGF-BB的半月板复合支架。
测试部分
1)组织工程半月板复合支架形态观察
支架的大体观如图3所示，其中A示出对比例1的PCL半月板支架呈白色的十字错层交叉网格结构；B为对比例2的未负载PDGF-BB的半月板复合支架，C为实施例1的半月板复合支架，B和C均可见水凝胶材料均匀填充于PCL支架框体网格结构之中。
微观形貌观察采用Hitachi S-4800型扫描电子显微镜进行。取支架分别进行纵切和横切置于硅片之上，真空下表面喷金，通过扫描电镜观察微观形貌，结果如图4所示。其中，A为半月板复合支架的纵切面观，可见PCL支架纤维直径规则，间隙均匀、连通性好。B为半月板复合支架的横切面观，可见水凝胶材料均匀填充于PCL支架纤维之间，且表面粗糙多孔。
2)组织工程半月板复合支架的Transwell迁移实验
在24孔板中插入Transwell小室(美国corning公司，孔径8μm)，将支架加入下室中，吸取DMEM/F12(50:50)低糖培养基(美国Corning公司)加入载有支架的孔内，放入37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育2h。之后于上室中加入20000个家兔滑膜间充质干细胞，继续放入到37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育24h。孵育完成后用棉签擦除仍存在于上室中未迁移进下室的细胞，PBS洗涤后用4％多聚甲醛固定迁移至下室的细胞，固定30min后用0.1％结晶紫进行细胞染色。
细胞迁移实验结果如图5所示，统计结果见图6，其中A为阴性对照组：DMEM/F12(50:50)低糖培养基；B为对比例1的PCL半月板支架组；C为对比例2的未负载PDGF-BB的半月板复合支架组；D为实施例1的半月板复合支架组。细胞迁移实验的统计结果是以每个孔的6个视野(放大倍数：200倍)中的细胞平均数计。
结果显示，单纯的PCL半月板支架的促细胞迁移性能较阴性组没有统计学差异，表明PCL具有良好的生物相容性，不会影响细胞的迁移行为。PCL复合GelMA/dMECM水凝胶的半月板复合支架能明显地促进滑膜间充质干细胞的迁移。而负载了PDGF-BB之后的半月板复合支架促滑膜间充质干细胞的迁移数更显著地高于阴性组。这表明本发明的半月板复合支架具有显著的促细胞迁移运动能力，能更有效地募集周围组织的细胞。
3)组织工程半月板复合支架的细胞毒性及增殖性能检测
将支架置于无菌的DMEM/F12(50:50)低糖培养基中，于37℃、5％CO2细胞培养箱内放置24h后吸取浸提液。将家兔滑膜间充质干细胞按2000个/孔加入96孔板中进行培养，细胞粘附2h后弃去原培养基，加入支架浸提液，在培养了1、4或7天后，弃去原培养基并用PBS溶液清洗一遍，每孔加入110μL含10μL的CCK-8溶液(日本Dojindo公司，规格500T)的DMEM/F12培养基，于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育2h。孵化完成后在450nm波长处检测吸光值。每个时间点进行五个平行孔实验。
结果如图7所示，图中A为阴性对照组：DMEM/F12(50:50)低糖培养基；B为对比例1的PCL半月板支架组；C为对比例2的未负载PDGF-BB的半月板复合支架组；D为实施例1的半月板复合支架组。结果显示，兔滑膜间充质干细胞在B、C、D组中的增殖性能同对照组A没有统计学差异，未见明显的细胞毒性。且经由本发明实施例的半月板复合支架浸提液培养的细胞有更好的增殖性能，细胞活力明显增强。说明本发明的半月板复合支架具有显著的促细胞生长作用。
4)组织工程半月板复合支架的细胞活性检测
将支架与兔滑膜间充质干细胞共培养，细胞负载于支架之上于体外培养4天后，用活-死细胞染色试剂盒(美国Invitrogen公司，货号L34969，规格80assays)进行死活染色；再取5μL钙黄绿素-AM及20μL乙锭二聚体-1加入10mL无菌PBS溶液中，室温(25℃)下浸置细胞-支架复合物于溶液中30min，继续用无菌PBS轻柔清洗3次后，吸净PBS溶液；激光共聚焦显微镜(德国Leica公司的TCS SP8型)下拍照观察。
结果如图8所示，图中A为对比例1的PCL半月板支架组；B为对比例2的未负载PDGF-BB的半月板复合支架组；C为实施例1的半月板复合支架组。结果显示，三组支架上的细胞活力均较好，染色成红色的死细胞较少，细胞大多密集生长在接种细胞的支架表面。相对于单纯的PCL半月板支架，PCL复合GelMA/dMECM水凝胶的仿生半月板复合支架组(B和C)细胞数量更多。而本发明实施例的半月板复合支架组的细胞生长最为密集，表明本发明实施例的半月板复合支架组的细胞进一步增多，且细胞外基质的分泌量也更多，细胞的附着性更好。因此，本发明实施例的半月板复合支架具有较高的促细胞增殖和促细胞外基质产生的作用，更加有利于细胞的粘附和生长，从而能显著提高半月板的再生修复效果。
5)组织工程半月板复合支架的细胞粘附和生长检测
将支架与兔滑膜间充质干细胞共培养，细胞负载于支架之上于体外培养4天后，经2.5％戊二醛溶液固定4h以上，PBS浸洗20min两次，1％四氧化锇酸后固定2h，继续PBS浸洗2次，梯度乙醇脱水(50％、75％、90％、100％)2次，每个浓度梯度脱水30min，醋酸异戊酯置换乙醇40min，六甲基二硅胺烷原液(HMDS)替代临界点干燥，真空条件下表面喷金的预处理后，在扫描电镜(Hitachi S-4800型)下观察细胞粘附和生长情况，以评估其生物相容性。
结果如图9所示，图中A为对比例1的PCL半月板支架组；B为对比例2的未负载PDGF-BB的半月板复合支架组；C为实施例1的半月板复合支架组。兔滑膜间充质干细胞在半月板支架上的粘附和生长状态良好，而PCL复合GelMA/MECM水凝胶的半月板复合支架(B和C)的细胞形态多变且产生大量细胞外基质，说明细胞存活率高且增殖性能更为明显，且本发明实施例的半月板复合支架的细胞数量和细胞外基质产生量更多。说明本发明的支架具有良好的细胞相容性，且具有优良的促细胞粘附和生长性能。
6)组织工程半月板复合支架的力学性能检测
力学性能主要测试支架的压缩性能和拉伸性能。由于负载生长因子对支架的力学性能没有明显的影响，因此可以用未负载PDGF-BB的半月板复合支架说明本发明实施例的半月板复合支架的力学性能。测试方法包括：
压缩模量测试(深圳三思CMT5304-30kN)：切取长和宽约为5mm，高2mm的样本，用游标卡尺测试得到样品准确尺寸；将样品水平放置在试验机台上，装配好压头，在与压缩实验机相配套的电脑中输入正确参数，并将力与位移调零，然后开始实验：室温(25℃)下，以4.5mm/min的压缩速率对其进行压缩，形变量为10％。
拉伸模量测试(岛津EZ-LX型单柱式电子万能试验机，载荷容量500N)操作：切取长24mm，宽5mm，高2mm的样本，用游标卡尺测量样品得到样品准确宽度(有效尺寸)和厚度；将样品长度方向的两端分别装卡在试验机的上、下夹头中，记录下样品的测试段长度。室温(25℃)下，以12mm/min的拉伸速率对进行拉伸，直到将样品拉断。
以上每个测试均重复三个样品，根据应力应变曲线趾部区域之后的线性部分计算模量。
支架的压缩模量统计图如图10所示，单纯PCL半月板支架组为11.61±0.51MPa，半月板复合支架组为11.17±2.64MPa。支架的拉伸模量统计图如图11所示，单纯PCL半月板支架的拉伸模量为35.98±1.70MPa，半月板复合支架为35.51±7.08MPa。结果表明半月板复合支架具有较好的综合力学性能，且与已经报道的半月板组织的力学特性类似。这说明本发明的半月板复合支架可以为组织再生提供稳定可靠的力学支撑，同时能更好地适应膝盖弯曲时带来的作用力。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种半月板复合支架的制备方法，其特征在于，包括：
依次层叠多个复合层以形成半月板复合支架的预成型体，其中，各所述复合层包含多个相互间隔排列的支架纤维和位于相邻所述支架纤维之间且呈凝胶状态的水凝胶浆料，所述支架纤维包含可降解高分子材料，所述水凝胶浆料包含基质材料和血小板衍生生长因子PDGF，相邻两个所述复合层的所述支架纤维之间呈预设角度；
使所述预成型体中的所述水凝胶浆料交联固化，得到半月板复合支架。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述基质材料包括脱细胞半月板细胞外基质、脱细胞软骨细胞外基质、糖胺多糖、I型胶原、II型胶原、壳聚糖、海藻酸盐、透明质酸和甲基丙烯酸酯化明胶中的一种或多种；和/或，
所述PDGF包括PDGF-BB。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱细胞半月板细胞外基质的制备方法包括：
对半月板碎块进行无菌处理；
对无菌的所述半月板碎块进行湿法粉碎，获得悬浮浆料；
采用差速离心法对所述悬浮浆料进行脱细胞处理，获得所述脱细胞半月板细胞外基质。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可降解高分子材料包括聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚己内酯共聚物、聚氨基酸及聚乙醇酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水凝胶浆料在溶液状态时包含5μg/mL～20μg/mL的PDGF。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述水凝胶浆料在溶液状态时包含1％～1.5％重量/体积的脱细胞半月板细胞外基质、9％～12％重量/体积的甲基丙烯酸酯化明胶和0.15％～0.25％重量/体积的光引发剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述半月板复合支架采用三维生物打印技术制备，包括：
设置打印平台的温度为18℃～20℃；
将可降解高分子材料加入与第一喷头相连的第一料筒中打印所述支架纤维，将水凝胶浆料加入与第二喷头相连的第二料筒中打印所述水凝胶浆料，以制备依次层叠的多个所述复合层，得到所述预成型体，其中，所述第一料筒的温度为80℃～85℃，所述第二料筒的温度为20℃～24℃并在打印最后一个所述复合层时转变为25℃～26℃；
采用蓝光照射所述预成型体30s～60s，使所述预成型体中的所述水凝胶浆料交联固化，得到半月板复合支架。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述第一喷头的内径为350μm～450μm；
所述复合层中相邻两个所述支架纤维的中心线间距为1.2mm～1.5mm；
所述第二喷头的内径为450μm～550μm。
9.一种半月板复合支架，其特征在于，包括：
支架框体，包括在自身高度方向依次层叠设置的多个支架层，每个所述支架层包括间隔设置的多个支架纤维，且相邻两个所述支架层的所述支架纤维之间呈预设角度，所述支架纤维包含可降解高分子材料；
固化的水凝胶材料，复合于所述支架框体的孔隙中，所述固化的水凝胶材料内分布有血小板衍生生长因子PDGF，且所述固化的水凝胶材料呈多孔结构。
10.根据权利要求9所述的半月板复合支架，其特征在于，所述支架框体中，第N个支架层的所述支架纤维与第N+1个支架层中的所述支架纤维之间的角度为45°～90°，第N个支架层的所述支架纤维与第N+2个支架层中的所述支架纤维之间平行且错位设置，N为大于等于1的整数。
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