CN109803691A

CN109803691A - 生物打印的半月板植入物及其使用方法

Info

Publication number: CN109803691A
Application number: CN201780050150.5A
Authority: CN
Inventors: S.瓦兹沃思; S.拜尔; T.穆罕默德; K.瓦卢斯
Original assignee: Aspect Biosystems Ltd
Current assignee: Aspect Biosystems Ltd
Priority date: 2016-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2019-05-24
Also published as: EP3471789A1; EP3471789A4; IL263620A; AU2017285788A1; JP2024096121A; CA3027595A1; JP2022068221A; JP2019520822A; JP7507184B2; KR20190028433A; SG11201811226PA; US20190314552A1; US20240173459A1; US11744919B2; WO2017214736A1

Abstract

本文提供半月板植入物组合物以及其制备和使用的方法。本发明的半月板植入物可用于修复和/或替换哺乳动物受试者中受损或患病的半月板组织。

Description

生物打印的半月板植入物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年6月16日提交的美国临时专利申请序列号62/351,222的提交日期的优先权益，所述申请的公开内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明提供合成组织结构及其制造和使用方法，所述合成组织结构包括人造半月板植入物，所述植入物包括精确图案化的层，其包含从生物打印机分配的可变合成组织纤维结构。

背景技术

半月板是膝关节最常受损的区域之一，在美国具有每100,000人受伤66例的平均损伤发生率。完全或部分移除半月板缓解急性疼痛，但是在没有适当替换物的情况下，半月板移除可导致膝关节软骨损伤，从而导致骨关节炎(OA)。半月板通常表现出较差的愈合潜力，并且目前可用的半月板替换物选项均不满足这种独特组织的必要承重和生物力学要求，同时还成功地植入到周围组织中以提供半月板损伤的长期解决方案。

组织工程领域长期以来一直试图使用无数材料和方法来制造能够模拟和/或替换活体器官和组织的可行的合成结构。历史上，将细胞和其他生物材料接种到赋予所需结构的预先形成的三维支架中，其中所述支架优选地是可生物降解的或可去除的。参见例如美国专利号6,773,713。然而，尽管有数十年的发展，但这种方法在有效细胞接种和生长方面仍然存在重大挑战，并且所述技术不适用于涉及不同细胞类型的更复杂空间排列的更复杂的生理结构。

最近，3D打印(一种增材制造(AM)形式)已被应用于直接从数字文件创建三维对象，其中所述对象逐层构建以实现所需的三维结构。使3D打印技术适合于产生细胞构建体和组织的最初努力(称为3D生物打印)也集中于支架材料的初始打印，而与细胞材料的直接接种或随后打印无关，这与上述惯例一致。参见，例如美国专利号6,139,574；7,051,654；8,691,274；9,005,972和9,301,925。然而，遗憾的是，通常用于形成现有技术支架的聚合物虽然通常被认为是生物相容的，但在生理学上是不相容的。因此，使用这种方法牺牲了细胞活力，而有利于所需支架的机械稳定性。

特别是在半月板植入物领域中，例如，Bakarich等人描述一种系统，其中将藻酸盐/丙烯酰胺凝胶前体溶液和基于环氧基的UV可固化粘合剂的组合加以组合以形成可打印的基质材料。ACS Appl.Mater.Interfaces 6:15998-16006(2014)。可打印的基质材料用于3D生物打印过程中以单独沉积2D的基质材料层，之后将UV光在所述层上通过一至五分钟以使其固化，然后在顶部沉积另一层。然而，由于丙烯酰胺凝胶和基于环氧基的UV可固化基质组分的非生理性质，在生物打印过程中活细胞不能维持在这种基质材料中，并且所得的支架仍然不利于细胞生长、分化和连通。

还描述可替代的3D生物打印技术，所述技术强调相反的情况，其中牺牲机械结构和打印保真度以有利于细胞活力。这些生物打印系统通过在生物相容性基质内沉积细胞材料来产生合成组织，然后在沉积后交联或以其他方式固化以产生固体或半固体组织结构。参见，例如，美国专利号9,227,339；9,149,952；8,931,880和9,315,043；美国专利公布号2012/0089238；2013/0345794；2013/0164339和2014/0287960。然而，对于所有这些系统，沉积和交联步骤之间的时间延迟总是导致对打印结构的几何形状以及结构的细胞和基质组成缺乏控制。此外，在任何情况下，随后的交联或固化事件通常仍会损害细胞活力。

作为这个问题的一个实例，Markstedt等人描述一种系统，其中水凝胶诸如胶原、透明质酸、壳聚糖和藻酸盐与非生理增强纤维材料(诸如纳米原纤化纤维素)组合使用，作为用于3D生物打印的生物墨水。BioMacromolecules 16:1489-96(2015)。将这种生物墨水沉积为2D材料层，将其浸没在二价阳离子浴(CaCl₂)中以交联十分钟并使第一层固化，然后在顶部沉积另一层。尽管活细胞成功地并入到其生物墨水中，但细胞活力分析表明细胞活力由于交联过程而显著降低，从嵌入前的～95.3％降低至嵌入和交联后的～69.9％。此外，与非打印对照的比较显示，细胞活力的降低可能是由于生物墨水本身的制备和混合，而不是实际的3D打印过程。

因此，现有的3D生物打印技术和材料一方面不能令人满意地解决结构完整性与打印保真度之间的技术冲突，另一方面不能解决生理相容性与细胞活力之间的技术冲突。本发明解决这些和其他未满足的需求。本文列出的所有现有技术参考文献都通过引用整体并入。

发明内容

本发明成功地解决3D生物打印领域中结构完整性与细胞活力之间的先前相互矛盾的目标，从而提供以固化形式沉积的合成组织结构，其具有改善的细胞生长和/或存活特征和生理功能，并且不需要交联或其他随后的固化步骤。本发明的各方面包括合成组织结构，其包括由生物打印机沉积的一个或多个层，其中每个层包含一种或多种合成组织纤维，所述合成组织纤维包含固化的生物相容性基质，所述基质任选地包含细胞并且任选地包含一种或多种活性剂，其中基质材料、细胞类型、细胞密度和/或活性剂的量中的至少一个在层内在至少一个方向上变化。优选地，所述层中的至少一个包含从生物打印机分配的具有可变组成的单个连续合成组织纤维。

在具体的实施方案中，提供半月板植入物，其包含从生物打印机分配的一种或多种合成组织纤维的层，作为固化的生物相容性基质，所述基质任选地包含细胞并且任选地包含一种或多种活性剂，其中基质材料、细胞类型、细胞密度和/或活性剂的量中的至少一个在层内在至少一个方向上变化。优选地，所述层中的至少一个包含从生物打印机分配的具有可变组成的连续合成组织纤维。更优选地，所述层中的每个包含具有可变组成的连续合成组织纤维。更优选地，半月板植入物包括增强的周边区域和/或至少一个锚定区域，如本文所述。

一方面，本发明提供一种合成组织结构，其包括由生物打印机沉积的多个层，每个层包含一种或多种合成组织纤维，所述合成组织纤维包含固化的生物相容性基质，所述基质任选地包含细胞并且任选地包含一种或多种活性剂，其中所述层中的至少一个包含在至少一个方向上类型和/或量变化的基质材料。在一些实施方案中，每个层包含在至少一个方向上类型和/或量变化的基质材料。

另一方面，本发明提供一种合成组织结构，其包括多个层，每个层包含在固化的生物相容性基质内的从生物打印机分配的包含多种哺乳动物细胞的合成组织纤维，其中所述层中的至少一个包含在至少一个方向上变化的细胞类型和/或细胞密度。在一些实施方案中，每个层包含在至少一个方向上变化的细胞类型和/或细胞密度。

另一方面，本发明提供一种合成组织结构，其包括由生物打印机沉积的多个层，每个层包含一种或多种合成组织纤维，所述合成组织纤维包含任选地包含细胞的固化生物相容性基质，其中所述层中的至少一个包含在至少一个方向上类型和/或数量变化的活性剂。在一些实施方案中，每个层包含在至少一个方向上类型和/或量变化的活性剂。

在一些实施方案中，将一种或多种合成组织纤维以所需图案或构型分配以形成第一层，并且然后将一个或多个附加层分配在顶部上，其具有相同或不同的图案或构型。在某些实施方案中，堆叠多个层以形成可用作人造半月板植入物的三维结构。优选地，所述层中的至少一个包含从生物打印机分配的具有可变组成的单个连续合成组织纤维。更优选地，所述层中的每个包含具有可变组成的单个连续合成组织纤维。

在一些实施方案中，合成组织结构包含多个单独的层，其范围是约1至约250，诸如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200、205、210、215、220、225、230、235、240或约245个单独的层。可并入任何合适数量的单个层以生成具有所需尺寸的组织结构。

在一些实施方案中，组织一个或多个单独的纤维和/或层以在组织结构内产生一个或多个区带，其中每个区带具有一种或多种所需的特性(例如，一种或多种机械和/或生物学特性)。如本文所用，术语“区域”是指在x-y平面中限定的组织结构的一部分(例如，单个层的区域或部分，其中组织结构的每个层限定x-y平面)，而术语“区带”是指在z方向上限定的组织结构的一部分，并且包括来自单独的x-y平面或层的至少两个邻接区域(例如，包括多个单独“微层”的“宏层”)。

根据本发明的实施方案的区带可具有任何所需的三维几何形状，并且可占据合成组织结构的任何所需部分。例如，在一些实施方案中，区带可跨越合成组织结构的整个长度、宽度或高度。在一些实施方案中，区带仅跨越合成组织结构的长度、宽度或高度的一部分。在一些实施方案中，合成组织结构包括沿合成组织结构的长度、宽度、高度或它们的组合组织的多个不同区带。在一个优选的实施方案中，合成组织结构包括沿合成组织结构的高度组织的三个不同区带，使得从底部到顶部的合成组织结构的路径将穿过所有三个区带。

在一些实施方案中，区带可包括多个层，其范围是约2至约250，诸如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、200、205、210、215、220、225、230、235、240或约245个单独的层。在一些实施方案中，区带内的各个层以赋予区带一种或多种机械和/或生物学特性的方式组织。例如，在一些实施方案中，区带内的各个层包含一种或多种增强材料，其赋予区带增加的机械强度。在一些实施方案中，区带内的各个层包含一种或多种材料，其赋予区带所希望的细胞生长特性。在一些实施方案中，区带内的各个层或穿过区带的纤维结构的多个单独隔室可以赋予区带所希望的性质的方式交替。例如，在一些实施方案中，区带内的各个层或区域交替，使得奇数层含有赋予区带所希望的机械特性的一种或多种增强材料，并且偶数层含有赋予区带所希望的生物学特性的一种或多种材料(例如，有助于细胞迁移、生长、活力等的较软材料)。在一些实施方案中，区带包含多个邻接的单个层(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9或约10个或更多个邻接层)，其包含赋予区带增加的机械强度的一种或多种增强材料，所述邻接层与另外多个邻接的单个层(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9或约10个或更多个邻接层)交替，所述另外多个邻接的单个层包含赋予区带所希望的生物学特性的一种或多种材料(例如，有助于细胞迁移、生长、活力等的较软材料)。

一个方面，人造半月板植入物包括至少一个基底区带、至少一个内部区带和至少一个表面区带，其中所述区带中的至少一个包括包含一种或多种合成组织纤维的层，所述合成组织纤维包含固化的生物相容性基质，其中基质材料的类型和/或量在层的中心与层的周边之间变化。在一些实施方案中，在层的周边处或附近的一种或多种基质材料包括增强的基质材料。

本发明的各方面还包括具有一个或多个锚定区域的人造半月板植入物。如本文所用，术语“锚定区域”是指包含一种或多种增强基质材料的区域。根据本发明的实施方案的人造半月板植入物可包括任何合适数量的锚定区域，诸如1至12个，诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个锚定区域。在一些实施方案中，人造半月板植入物不包括锚定区域。

另一方面，提供人造半月板植入物，其包括至少一个基底区带、至少一个内部区带和至少一个表面区带，其中至少一个区带包括层，所述层包含在固化的生物相容性基质内的从生物打印机分配的包含多种哺乳动物细胞的至少一种合成组织纤维，其中至少一个层包含在至少一个方向上变化的细胞密度。在一些实施方案中，所述层中的每个包含在至少一个方向上变化的细胞密度。在一些实施方案中，细胞密度的范围是0至约100x 10⁶个细胞/mL。

另一方面，根据本发明的实施方案的人造半月板植入物包括至少一个基底区带、至少一个内部区带和至少一个表面区带，其中所述区带之一中的至少一个层包含一种或多种合成组织纤维，其包含固化的生物相容性基质和至少一种活性剂，其中所述至少一种活性剂的类型和/或量在所述层的中心与所述层的周边之间变化。

在一些实施方案中，所述层的周边上的生物相容性基质可包含至少一种活性可溶性试剂，其随时间从基质释放，以促进宿主血管细胞向内生长和软骨细胞向内生长。此类生物活性剂包括但不限于：血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、骨形态发生因子、肝细胞分散因子、尿激酶型纤溶酶原激活剂、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生的生长因子(PDGF)或它们的任何组合。

在一些实施方案中，所述层的周边上的生物相容性基质可包含至少一种不溶性因子以促进细胞向内生长。此类不溶性因子的非限制性实例包括：透明质酸或硫酸化透明质酸、纤连蛋白、纤维蛋白和胶原I。可将另外的生物活性因子并入到排列在本发明的人造半月板植入物内部的基质中，以促进胶原沉积在所包含的软骨细胞附近。此类另外的生物活性因子的非限制性实例包括：胰岛素、结缔组织衍生的生长因子(CTGF)或它们的组合。

在一些实施方案中，周边的部分或区域将包含至少一种活性剂。在一些实施方案中，层的整个周边包含至少一种活性剂。在一些实施方案中，周边包含多种活性剂。在一些实施方案中，所述层的整个周边包含减少宿主炎症反应的活性剂，例如，通过包含容纳在一种或多种微粒内的一种或多种类固醇化合物，以确保在延长的时间段内持续释放。

在一些实施方案中，人造半月板植入物具有弓形形状，其具有前端、后端、在其之间的在所述前端与所述后端之间限定弯曲路径的中间部分、内侧和外侧。在一些实施方案中，细胞密度以径向方式从内侧向外侧增加。在一些实施方案中，增强基质材料的浓度以径向方式从内侧向外侧增加。在一些实施方案中，活性剂的量以径向方式从内侧向外侧增加。

在一些实施方案中，基底区带包括一个或多个层，其包含随机取向的一种或多种合成组织纤维；内部区带包括一个或多个层，其包含周向取向的一种或多种合成组织纤维和径向取向的一种或多种合成组织纤维；并且表面区带包括一个或多个层，其包含随机取向的一种或多种合成组织纤维。在一些实施方案中，周向取向的一种或多种合成组织纤维具有第一直径，并且径向取向的一种或多种合成组织纤维具有不同的第二直径。在一些实施方案中，周向取向的一种或多种合成组织纤维和径向取向的一种或多种合成组织纤维具有相同的直径。在一些实施方案中，一种或多种合成组织纤维具有范围是约20μm至约500μm的直径。

在一些实施方案中，周向取向的一种或多种合成组织纤维包含第一固化的生物相容性基质，并且径向取向的一种或多种合成组织纤维包含不同的第二固化的生物相容性基质。在一些实施方案中，周向取向的一种或多种合成组织纤维和径向取向的一种或多种合成组织纤维包含相同的固化的生物相容性基质。

在一些实施方案中，内部区带包括包含一种或多种合成组织纤维的层，所述合成组织纤维被配置来促进与一种或多种合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。在一些实施方案中，内部区带包括包含周向取向的一种或多种合成组织纤维的层，所述合成组织纤维被配置来促进与周向取向的一种或多种合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。在一些实施方案中，内部区带包括包含径向取向的一种或多种合成组织纤维的层，所述合成组织纤维被配置来促进与径向取向的一种或多种合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。

固化的生物相容性基质可包含支持活细胞活力的各种各样的天然或合成聚合物中的任一种，包括例如藻酸盐、层粘连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、基于聚(乙烯)乙二醇的凝胶、明胶、壳聚糖、琼脂糖或它们的组合。在优选的实施方案中，固化的生物相容性基质包含藻酸盐或其他合适的生物相容性聚合物，其可在从打印头分配时瞬间固化。在另外优选的实施方案中，固化的生物相容性基质在每种合成组织纤维的整个径向横截面中包含均匀的藻酸盐组合物。

在特别优选的实施方案中，固化的生物相容性基质在生理学上是相容的，即有助于细胞生长、分化和连通。在一些此类实施方案中，生理学相容的基质包含藻酸盐与以下一种或多种的组合：胶原、纤连蛋白、血小板反应蛋白，糖胺聚糖(GAG)，脱氧核糖核酸(DNA)，粘附糖蛋白、弹性蛋白以及它们的组合。在具体的实施方案中，胶原选自由以下组成的组：胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V、胶原VI或胶原XVIII。在具体的实施方案中，GAG选自由以下组成的组：透明质酸、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、软骨素-4-硫酸盐或硫酸角质素。

如上所述，锚定区域可通过将更高强度的材料并入到植入物的特定区带(即，缝合点)中来生成，例如，更硬的合成材料，包括但不限于聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚氨酯(PU)以及它们的任何组合。在一些实施方案中，锚定区域可含有双网络水凝胶，其通过组合至少两种不同的水凝胶材料而生成，其实例包括但不限于藻酸盐、明胶甲基丙烯酸酐(GelMA)、甲基丙烯酰基聚乙二醇(PEGMA)、结冷胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺或它们的任何组合。另外，高强度纤维可由高浓度的生物聚合物生成，所述生物聚合物包括但不限于胶原、壳聚糖、丝素蛋白或它们的任何组合，并且这些生物聚合物可并入到一个或多个锚定区域中。在一些实施方案中，植入物的锚定区域和/或增强的周边区域包括一层或多层的一种或多种高强度材料，所述高强度材料在z方向上与一层或多层软基质材料交替沉积，所述软基质材料含有例如上述有助于细胞存活和向内生长的一种或多种水凝胶材料。以这种方式，较软的细胞相容的水凝胶材料提供一种或多种所希望的生物学功能，并且较硬的材料提供一种或多种所希望的机械功能，以生成具有适当的机械和生物功能的混合结构。

在一些实施方案中，哺乳动物细胞选自由以下组成的组：成纤维细胞、软骨细胞、纤维软骨细胞、原代人类半月板衍生的软骨细胞、干细胞、骨髓细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、骨髓衍生的间充质干细胞、诱导的多能干细胞、分化的干细胞、组织衍生的细胞、微血管内皮细胞以及它们的组合。在优选的实施方案中，与打印前的细胞存活率相比，合成活组织结构内的细胞存活率的范围是约70％至约100％，诸如约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、约99％、约99.5％或约99.9％。

在一些实施方案中，半月板植入物还包括位于基底区带下方的无细胞鞘。在一些实施方案中，半月板植入物还包括位于表面区带上方的无细胞鞘。在一些实施方案中，半月板植入物包括位于基底区带下方的第一无细胞鞘和位于表面区带周围的第二无细胞鞘。

在一些实施方案中，半月板植入物还包含至少一种活性剂。在一些实施方案中，所述至少一种活性剂选自由以下组成的组：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-12、BMP-13、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2、血小板衍生的生长因子-AA、血小板衍生的生长因子-BB、富血小板血浆、IGF-I、IGF-II、GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、血管内皮细胞衍生的生长因子、多效生长因子、内皮素、烟酰胺、胰高血糖素样肽-I、胰高血糖素样肽-II、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、原弹性蛋白、凝血酶衍生肽、层粘连蛋白、含有细胞结合结构域的生物肽和含有肝素结合结构域的生物肽、治疗剂以及它们的任何组合。

在优选的实施方案中，生物打印机通过单个孔分配包含多种哺乳动物细胞的固化的生物相容性基质。在特别优选的实施方案中，所述单个孔包含在打印头内，诸如WO 2014/197999中描述和要求保护的打印头，其公开内容通过引用整体并入本文。

附图说明

图1是逐层合成组织纤维沉积过程的示意图。

图2是膝关节的示意图，其描绘外侧半月板和内侧半月板。(改编自：The kneemeniscus:structure-function,pathophysiology,curren t repair techniques,andprospects for regeneration.Biomaterials.2011年10月；32(30):7411–7431.doi:10.1016/j.biomaterials.2011.06.037,Eleftherios A.Makris,MD1,Pasha Hadidi,BS1和Kyriacos A.At hanasiou,Ph.D.,P.E.1)。

图3是半月板的示意图，其描绘顶视图和横截面视图两者。描绘外部(红-红)区域、中心(白-红)区域和内部(白-白)区域。(改编自：The knee meniscus:structure-function,pathophysiology,current repair techniques,and prospects forregeneration.Biomaterials.2011年10月；32(30):7411–7431.doi:10.1016/j.biomaterials.2011.06.037,Eleftherios A.Makris,MD1,Pasha Hadidi,BS1和Kyriacos A.Athanasiou,Ph.D.,P.E.1)。

图4，图A是半月板的示意图，其描绘横截面视图。胶原纤维的周向和径向对齐赋予半月板生物力学特性。图B描绘表面区带、层状区带和内部(深)区域。靠近半月板表面的表面区带和层状区带中的胶原纤维是随机取向的。在半月板中较深处的纤维沿周向和径向方向两者取向。

图5是描绘半月板的各个部分上的轴向负荷力F的分量的力图。垂直于半月板表面的轴向负荷力(F)和水平力(f_r)通过压缩股骨(F_f)产生。F由于胫骨升高力(F_t)而引起反弹，而f_r导致半月板的径向挤压，这通过来自前后插入韧带的拉力来抵消。因此，在轴向压缩期间沿周向方向产生拉伸环向应力，其受到周向取向的胶原纤维的抵抗。(改编自：The kneemeniscus:structure-function,pathophysiology,current repair techniques,andprospects for regeneration.Biomaterials.2011年10月；32(30):7411–7431.doi:10.1016/j.biomaterials.2011.06.037,Eleftherios A.Makris,MD1,Pasha Hadidi,BS1和Kyriacos A.Athanasiou,Ph.D.,P.E.1)。

图6提供两个无细胞3D半月板样结构的图像，其具有打印的合成组织纤维结构的预编程的区带特异性支架含量和协调图案化。比例尺＝1cm。

图7是一系列显微镜图像，其描绘小直径纤维中的自发胶原纤维对齐。在不同直径的微流体通道中的聚合胶原纤维取向包括；30um(图a)，100um(图b)，400um(图c)和无通道(图d)(Lee等人，2006)。

图8示出一系列图像，其示出使用3D生物打印系统打印的基于藻酸盐的纤维直径的即时调制，以及比较平均纤维直径的图表。图A、图B和图C描绘3种不同直径的基于藻酸盐的纤维，其通过在3D生物打印系统中在3种不同压力设定下打印而生成。多根纤维中宽度的定量表明每个压力设定下的平均直径是一致的(图，右)。

图9是3D生物打印的半月板的各个层中的合成组织纤维图案化的图示。装载有细胞外基质(ECM)(例如胶原)的特定直径的合成组织纤维结构以重现胶原的微图案化和半月板的区带架构的方式图案化。基底区带和表面区带含有以较大直径纤维打印的随机取向纤维。内部区带含有在较小直径的图案化纤维内对齐的周向和径向对齐的胶原。

图10示出来自工程化3D组织中的胶原纤维的双光子成像的数据。图A：在静电纺丝明胶(ESG)支架上培养90天后，原代人类气道上皮细胞和成纤维细胞的3D共培养物的甲醛固定、H&E染色的切片。图B：未染色切片的双光子成像表明在与沉积胶原的成纤维细胞相似的方向上，平行于ESG支架表面取向的纤维状胶原(紫色)的沉积。图C：未染色组织的发射光谱表明非中心对称的胶原纤维生成特定的二次谐波信号(SHG)(Wadsworth等人，2014)。

图11是具有区带特异性细胞和ECM含量的半月板组织的图示。“红-红生物墨水”和“白-白生物墨水”用于生成具有区带架构的组织。将所需的细胞类型(例如，MSC衍生的软骨细胞或原代半月板衍生的细胞)以适当的生理密度接种到红-红和白-白区带中。根据组织区带修改支架的特定ECM含量。组织中心区带中的“白-红”区带含有红-红和白-白生物墨水和细胞的混合物。生物打印系统有助于控制半月板植入物的任何给定区带中的细胞(细胞类型和细胞密度)和ECM含量。

具体实施方式

本发明的各方面包括合成组织结构，其包括由生物打印机沉积的一个或多个层，其中每个层包含一种或多种合成组织纤维，所述合成组织纤维包含任选地包含细胞、并且任选地包含一种或多种活性剂的固化的生物相容性基质，其中基质材料、细胞类型、细胞密度和/或活性剂的量中的至少一个在层内在至少一个方向上变化。优选地，所述层中的至少一个包含从生物打印机分配的具有可变组成的单个连续合成组织纤维。如本文所用的术语“固化的”是指在沉积后维持其形状保真度和结构完整性的材料的固体或半固体状态。如本文所用的术语“形状保真度”意指材料维持其三维形状的能力。在一些实施方案中，固化材料是能够将其三维形状维持约30秒或更长，诸如约1、10或30分钟或更长，诸如约1、10、24或48小时或更长的时间段的材料。如本文所用的术语“结构完整性”意指材料在包括其自身重量的负荷下保持在一起，同时抵抗破损或弯曲的能力。

在一些实施方案中，固化的组合物是具有大于约15、20或25千帕(kPa)，更优选地大于约30、40、50、60、70、80或90kPa，仍然更优选地大于约100、110、120或130kPa的弹性模量的组合物。优选的弹性模量范围包括约15、25或50Pa至约80、100、120或140kPa。

本发明的另外方面包括用于修复和/或替换哺乳动物受试者中受损或患病的半月板组织的人造半月板植入物，其包含从生物打印机分配的一种或多种合成组织纤维，作为固化的生物相容性基质，所述基质任选地含有细胞并且任选地含有一种或多种活性剂，其中基质材料、细胞类型、细胞密度和/或活性剂的类型和/或量中的至少一个在纤维内在至少一个方向上变化。

如图1所提供，任选地含有多种哺乳动物细胞的固化的生物相容性基质从生物打印机分配，从而在沉积表面上形成一种或多种合成组织纤维并且最终形成层。因此，在从打印头分配已经固化的基质之后，不需要随后的交联或其他固化步骤。因此，第二层可易于沉积在第一层的顶部上，同时维持第一层的结构完整性，并且这个过程可继续沉积多个层，一个在下一个层的顶部上，直到获得具有所需几何形状的三维结构。

固化的生物相容性基质可有利地包含藻酸盐，或任何其他合适的生物相容性聚合物，其可在从打印头分配时瞬间固化。在一个优选的实施方案中，基于藻酸盐的基质被打印并在打印时通过在从打印头分配之前或之后与二价阳离子交联溶液(例如，CaCl₂溶液)接触而同时交联。在特别优选的实施方案中，基于藻酸盐的生物相容性基质还包含一种或多种生理学材料，如本文更详细描述的。在另外优选的实施方案中，固化的生物相容性基质在每种合成组织纤维的整个径向横截面中包含均匀的藻酸盐组合物。

在一些实施方案中，合成组织纤维结构包含多个单独的隔室(沿合成组织纤维的长度组织)，其通过在相同的连续合成组织纤维结构的每个隔室中顺序沉积不同的基质材料(例如，天然和/或合成聚合物)、不同的细胞类型、不同的细胞浓度和/或不同类型和/或量的活性剂来产生。例如，在一些实施方案中，合成组织纤维结构包括第一隔室和第二隔室，第一隔室包含第一基质材料，第二隔室包含第二基质材料。在一些实施方案中，合成组织纤维结构包括第一隔室和第二隔室，第一隔室包含第一细胞类型，第二隔室包含第二细胞类型。在一些实施方案中，合成组织纤维结构包括第一隔室和第二隔室，第一隔室包含第一细胞浓度，第二隔室包含第二细胞浓度。在一些实施方案中，合成组织纤维结构包括第一隔室和第二隔室，第一隔室包含第一活性剂，第二隔室包含第二活性剂。基质材料、细胞类型、细胞浓度和/或活性剂的类型和/或量的任何组合可用于本发明的合成组织纤维结构的不同隔室中，以实现所需的生物力学特性和/或生物活性。

根据本发明的实施方案的合成组织纤维结构可包括不同基质材料(例如，天然和/或合成聚合物)的受控图案化和交联技术，以在给定隔室内产生所需的横截面轮廓。例如，在一些实施方案中，合成组织纤维结构包括具有实心、管状或多孔横截面轮廓的隔室。可在根据本发明的实施方案的合成组织纤维结构中产生的横截面轮廓的非限制性实例包括Jun，Yesl等人“Microfluidic spinning of micro-and nano-scale fibers for tissueengineering.”Lab on a Chip 14.13(2014):2145-2160中所述的那些横截面轮廓，其公开内容通过引用整体并入本文。

在一些实施方案中，使用软件工具将所得的合成组织纤维图案化，以形成任选地含有多种哺乳动物细胞和/或多种生物相容性基质材料的层。在某些实施方案中，以顺序方式沉积多个层以生成包括多个区带的多层半月板植入物。在一些实施方案中，半月板植入物包括至少一个基底区带、至少一个内部区带和至少一个表面区带，其中所述内部区带包含至少一个层，所述层包含至少一个周向取向的合成组织纤维，以及至少一个径向取向的合成组织纤维。优选地，所述层中的至少一个包含从生物打印机分配的具有可变组成的单个连续合成组织纤维。

本发明的半月板植入物的一个优点是基质组合物、细胞类型、细胞密度和活性剂类型和/或浓度可在植入物的任何层的任何部分中的任何给定点处受控，从而有助于半月板植入物的生成，所述植入物更类似于半月板组织的自然架构，并且具有所希望的生物力学特性，包括但不限于植入物周边上的增强锚定区域，半月板植入物内的周向和径向定向的纤维结构，以及植入物的特定区域和/或区带内的特定细胞类型和细胞密度。

本发明的另一个优点是可将一种或多种活性剂(在本文中更详细地描述)选择性地添加到合成组织纤维的不同隔室，以允许活性剂在半月板植入物的一个或多个层内精确定位，包括但不限于在无细胞植入物周边上增加适当活性剂的浓度以促进内源细胞向内生长。本发明的半月板植入物在以下进一步详细描述。

半月板解剖学：

半月板是一对新月形的纤维软骨，其由位于对应的股骨髁与胫骨坪之间的内侧和外侧组件两者组成。(图2)。前插入韧带和后插入韧带牢固地连接半月板，并且它们将半月板良好地固定到胫骨坪。半月板通常是楔形的，并且外侧半月板的长度大约是32.4-35.7mm，并且宽度大约是26.6-29.3mm，而内侧半月板的长度大约是40.5-45.5mm，并且宽度大约是27mm。每个都是光滑的白色复合组织，其由细胞、专门的细胞外基质(ECM)材料和区带特异性神经支配和血管形成组成。半月板在出生时完全血管化，然而，随着时间的推移，血管向外退缩直到(在人类中)10岁时，周边处的大约10％-30％的半月板血管化。因此，成人半月板具有两个不同的区带，外部、血管/神经区带(红-红区域)和内部完全无血管/无神经区带(白-白区带)。这些区域由狭窄的中心(红-白)区带隔开，所述区带具有外部(红-红)和内部(白-白)区带两者的特征(图3)。至关重要的是，每个区域的自我修复能力与血液供应直接相关，使内部白-白区带易受创伤和退行性病变的影响。

半月板细胞和生物化学组成

半月板是高度水合的组织，其包含大约72％的水，其余28％主要包含ECM和细胞。胶原构成大部分ECM(75％)，其次是糖胺聚糖(GAG，17％)、DNA(2％)、粘附糖蛋白(<1％)和弹性蛋白(<1％)。这些比例根据组织区带、年龄和状况而变化。半月板的细胞组分是区带特异性的，包括纤维软骨细胞和软骨细胞样细胞两者。

半月板的组成在每个区带中均不同。在外部红-红区带中，细胞在形态上更像成纤维细胞，具有许多突起。这个区带中的ECM主要是纤维状胶原类型-I(80％)。内部白-白区带具有与透明软骨非常相似的ECM，具有更多的胶原-II(42％)、降低的胶原-I的比例(28％)和更高的GAG浓度。这个区带中的细胞被称为纤维软骨细胞或软骨细胞样细胞。半月板的表面层具有另一种不同的细胞类型，其具有潜在的干细胞样特性。半月板的区带特异性ECM组分由驻留在组织内的细胞生成，因此半月板细胞的表型标记物可包括ECM蛋白表达或基因表达，诸如：COL1A1(胶原-1)、COL2A2(胶原-2)、VCAN(多功能蛋白聚糖)、ACAN(聚集蛋白聚糖)、CSPG4(软骨素-6-硫酸盐)、Sox9和Col10a(胶原-10a)。与每个半月板区带中的独特细胞类型相似，细胞密度在每个区带中也不同。血管(红-红)和无血管(白-红，白-白)区带分别具有12,820个细胞/mm³和27,199个细胞/mm³的平均细胞密度，并且纤维软骨细胞比成纤维细胞样细胞更多(Cengiz等人，2015)。半月板是高度异质的，具有细胞表型和ECM组成的区带特异性变化。

表1中描述膝盖半月板的细胞类型和生物化学支架含量的异质分布。红-红区带的特征是成纤维细胞样细胞和胶原I主导的细胞外基质(ECM)，以及痕量的胶原-II。白-红和白-白区带含有纤维软骨细胞和富含胶原-II的基质，以及更高比例的糖胺聚糖(GAG)。

表1：

胶原纤维图案化赋予半月板生物力学特性

半月板的微观解剖学几何形状与其生物力学特性密切相关。半月板的水合性质(～72％水)赋予对压缩应力的抵抗力，因为水是不可压缩的，然而，半月板具有相当大的拉伸强度，这通过整个组织中10μm直径的胶原纤维的有序排列来赋予(图4)(Baker等人，2007)。半月板的表面和层状区带由随机取向的胶原纤维构成，而半月板中较深处的纤维沿周向和径向方向取向。在正常使用时，膝盖内产生几倍体重的力，半月板通过周向对齐的胶原纤维的致密网络传递50％-100％的这种负荷(图4)。这种有序的架构在纤维方向上产生非常高的拉伸特性(50-300MPa)(Baker等人，2007)。当膝盖承受轴向负荷时，在周向方向上产生拉伸环向应力，并且这种应力试图将半月板挤出膝关节(图5)。然而，周向对齐的胶原纤维的拉伸强度和前后插入韧带的牢固附接有助于防止半月板的挤出并且显著降低应力并保护胫骨软骨。相比之下，如果前或后插入韧带或周边周向胶原纤维破裂，则负荷传递机制改变，这损害胫骨软骨。在新鲜冷冻的尸体人类半月板中测量抗压强度，12％应变下的轴向和径向压缩模量分别是83.4kPa和76.1kPa，拉伸模量大几个数量级(Chia和Hull，2008)。

组织工程化的目标是生成重现天然组织功能的结构。在半月板的情况下，挑战在于生成能够长期植入到膝关节中、同时还具有承受其在日常生活中所暴露于的相当大的压缩力所必需的生物力学强度的活组织。半月板是一种令人惊讶的复杂组织，具有mm、μm和nm尺度的特定架构，所有这些都有助于组织的生物力学功能。到目前为止，半月板工程化在一定程度上受到研究人员可用的制造工具的限制，诸如使用铸件来模塑水凝胶，或将细胞接种到预制支架上。这些方法不能生成重现功能所必需的微尺度架构。相比之下，本文所述的半月板植入物能够实现对一种或多种基质材料、细胞类型、细胞密度和活性剂组合物的点对点控制，这有助于生成更类似于半月板的天然结构特征的植入物。

半月板是异质组织，细胞和ECM组分分布在特定区带中。区带特异性对于赋予再生和生物力学功能至关重要。本发明的人造半月板植入物采用不同基质材料、细胞类型、细胞密度和活性剂组合物在3D组织的精确区域和/或区带中的特定放置，从而允许重新产生半月板的红-红、白-红、白-白区带架构(图6)。

已证明人类半月板内的细胞密度以区带特异性方式变化(红-红区带中大约是13x10⁶个细胞/ml，并且白-白和白-红区带中是28x10⁶个细胞/ml(Cengiz等，2015))。细胞密度在维持适当的细胞表型、ECM组织和对应的组织生物力学中起着至关重要的作用。在一些实施方案中，本发明的半月板植入物包含范围是约0至约100x10⁶个细胞/mL或更多的细胞密度。因此，在一些实施方案中，本发明的半月板植入物可具有从植入物内的一个位置到另一个位置变化的细胞密度。例如，在某些实施方案中，半月板植入物包括具有在至少一个方向上变化的细胞密度的层。在其他实施方案中，本发明的植入物是无细胞的并且设计用于内源性细胞向内生长。

胶原赋予大多数组织拉伸强度，并且直径大约100nm的多种胶原原纤维组合以生成直径大约10μm的强卷曲螺旋纤维。半月板的生物力学功能通过在周向和径向方向上的胶原纤维对齐来赋予(图4)。在一些实施方案中，本发明的半月板植入物包含图案化的胶原原纤维，其通过调节用于产生植入物的合成组织纤维结构的直径而产生。

先前的研究已示出，不同直径的微流体通道可指导胶原原纤维的聚合以形成沿通道长度取向、但仅在100μm或更小的通道直径下的纤维(Lee等人，2006)(图7)。在这些取向基质中生长的原代内皮细胞显示在胶原纤维的方向上对齐。在另一项研究中，Martinez等人证明纤维素珠支架内的500μm通道可指导胶原和细胞对齐(Martinez等人，2012)。在一些实施方案中，本发明的半月板植入物包括合成组织纤维结构，其具有范围是约20μm至约500μm，诸如约50μm、约75μm、约100μm、约125μm、约150μm、约175μm、约200μm、约225μm、约250μm、约275μm、约300μm、约325μm、约350μm、约375μm、约400μm、约425μm、约450μm或约475μm的直径(图7)。通过调节纤维直径，可控制本发明的半月板植入物内的胶原纤维的取向。因此，合成组织纤维结构及其内的胶原纤维因此可被图案化以产生具有生理上精确排列的周向和径向对齐的胶原纤维的半月板植入物，这对于赋予半月板植入物必需的生物力学特性是重要的(图8)。

半月板是一种本质上异质的结构，具有不同组成和架构的区带。本发明的半月板植入物包括复杂的生物结构，其包括独特的材料组成和架构，包括但不限于纤维直径、ECM组成、细胞组成和细胞密度。控制用于生成本发明的半月板植入物的合成组织纤维结构的这些和其他方面的能力使得能够构建在天然半月板组织中存在的区带架构。

在某些实施方案中，使用自动控制系统生成本发明的半月板植入物，所述自动控制系统调节一种或多种合成组织纤维的一种或多种特征，以便例如在单独的纤维结构内、在单独的纤维结构之间、在层内或跨层、在区带内或跨区带并且基本上在整个结构中的任何点处实现材料转换。因此，实现半月板植入物组成的点对点控制。此外，还可根据需要调节关键参数，诸如纤维直径和层厚度。这种自动控制水平对于准确地重建在天然膝盖半月板中存在的异质组成和形态是重要的。

本发明的合成组织纤维支持各种各样的人类细胞的活体生长。可精细调整合成组织纤维结构以包含例如不同的ECM蛋白、GAG和生长因子，以优化特定细胞类型的基质。计算机控制的合成组织纤维结构的沉积能够将细胞和基质材料精确地放置到特定位置中，以生成生理学相关的异质半月板植入物。

在某些实施方案中，通过调节胶原的图案化和/或通过调节用于生成合成组织纤维结构的基质材料(例如，藻酸盐、胶原)的一种或多种特征来控制半月板植入物的机械特性。例如，在一些实施方案中，如上所述，一个或多个锚定区域围绕植入物的周边放置，以便有助于例如通过缝合等进行附接和/或固定。锚定区域可通过并入更高强度的材料来生成，例如，更硬的合成材料，包括但不限于聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚氨酯(PU)或它们的任何组合。根据本发明的实施方案的锚定区域可含有例如双网络水凝胶，其通过组合至少两种不同的水凝胶材料生成，包括但不限于：藻酸盐、明胶甲基丙烯酸酐(GelMA)、甲基丙烯酰基聚乙二醇(PEGMA)、结冷胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺或它们的任何组合。另外，高强度纤维可由高浓度的生物聚合物生成，所述生物聚合物包括但不限于：胶原、壳聚糖、丝素蛋白或它们的任何组合，并且这些可并入到一个或多个锚定区域中。

根据本发明的实施方案的人造半月板植入物可包括0至约12个锚定区域，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个锚定区域。根据本发明的实施方案的锚定区域的大小范围可以是约5mm²至约40mm²，诸如约6、7、8、9或10mm²，或约12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36或38mm²。

根据本发明的实施方案的锚定区域可通过将更高强度的材料并入到缝合点中来生成，例如，更硬的合成材料，例如像聚己内酯(PCL)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)、聚氨酯(PU)或它们的任何组合。根据本发明的实施方案的锚定区域可任选地含有双网络水凝胶，其通过组合至少两种不同的水凝胶材料生成，包括但不限于藻酸盐、明胶甲基丙烯酸酐(GelMA)、甲基丙烯酰基聚乙二醇(PEGMA)、结冷胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺或它们的任何组合。另外，高强度纤维可由高浓度的生物聚合物生成，所述生物聚合物包括但不限于胶原、壳聚糖、丝素蛋白或它们的任何组合。在一些实施方案中，这些生物聚合物中的一种或多种可并入到一个或多个锚定区域中。在一些实施方案中，人造半月板植入物层的整个周边包括增强基质材料。在一些实施方案中，所述周边包括多个增强的锚定区域，其包含一种或多种增强的基质材料。

在一些实施方案中，可将高强度纤维并入(例如，图案化)到人造半月板植入物的一个或多个增强的周边区域中，以增加沿植入物周边的强度。在一些实施方案中，将高强度纤维并入到植入物的整个周边中。在人造半月板植入物的锚定区域和/或增强的周边区域内，高强度材料层可与针对细胞存活和向内生长优化的较软材料层交替。通过增加纤维材料的浓度、通过增加打印纤维的填充密度、通过增加打印纤维的直径或通过它们的任何组合，可赋予锚定区域和/或增强的周边区域内增加的强度。在一些实施方案中，可通过将例如无毒染料并入到可打印锚定材料中来对锚定区域进行着色，以在手术期间充当视觉引导，从而向外科医生通知人造半月板植入物的增强区域的位置，所述增强区域适合于缝线的放置。

在人类半月板中，胶原纤维的正确取向和对齐对于赋予组织适当的生物力学特性是至关重要的。如先前所讨论的，可通过将交联过程限制于小于大约100μm的小直径通道或纤维来引导自发胶原纤维取向和随后的细胞对齐(Lee等人，2006)(Onoe等人，2006)。在某些实施方案中，本发明的半月板植入物包括一层，其中一种或多种合成组织纤维结构被配置来促进与合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。因此，在某些实施方案中，一种或多种合成组织纤维以径向和/或周向取向沉积，并且被配置来促进与一种或多种合成组织纤维的径向和/或周向方向取向对齐的胶原纤维的沉积。以这种方式，可实现胶原纤维的周向和/或径向取向。

在一些实施方案中，调节合成组织纤维的直径，使得胶原纤维适当地对齐；例如半月板的表面和周边含有随机取向的(例如，无序的)胶原纤维，而一个或多个内部区域含有周向和径向对齐的纤维。图9中示出本发明的半月板植入物中的多个层中的每个中的合成组织纤维取向的非限制性实例的图示。

半月板损伤和手术修复的选择

半月板的损坏在膝关节中非常常见。半月板病变通常按不同年龄组分类。年轻人患者(<40岁)的半月板损伤通常由创伤或先天性半月板疾病引起，而老年人患者(>40岁)的半月板损伤往往与退行性撕裂相关联。半月板损伤可简单地临床分为周边半月板病变和无血管半月板病变。已开发许多外科技术来修复血管(红-红)区带中的半月板撕裂，在具有稳定膝盖的年轻患者中具有高的总体成功率(63％-91％)。半月板的无血管(白-白)区带中的损坏和撕裂通常与修复后的不良预后相关联，并且因此已尝试几种不同的治疗策略，具有不同的结果。最值得注意的包括使用半月板旁滑膜组织，对周边半月板边缘进行环锯术以及半月板撕裂的缝合，血管进入通道的产生，以及间充质干细胞和/或生长因子的使用。上述技术均未被普遍采用，因此整形外科医生的主要策略是在无法修复或退行性半月板损伤的情况下进行部分半月板切除术，即使这种治疗策略不能阻止膝盖OA的发展。部分半月板切除术可通过降低股骨髁与胫骨坪之间的接触面积而导致OA。改变膝关节软骨的负荷特征可通过损害、炎症和进一步的组织变性的恶性循环而导致半月板和关节软骨的进行性退化。

人造半月板植入物：

如上所述，本发明的各方面包括人造半月板植入物，其包括至少一个基底区带、至少一个内部区带和至少一个表面区带，其中所述区带中的每个包括层，所述层包含至少一种从生物打印机分配的合成组织纤维，作为固化的生物相容性基质，所述基质任选地包含细胞，并且任选地包含一种或多种活性剂，如本文所述。在一些实施方案中，基质材料、细胞类型、细胞密度和/或活性剂的类型和/或量的一种或多种可在给定层的至少一个方向上变化。例如，在一些实施方案中，半月板植入物层可具有沿第一侧较低，并且跨越所述层朝向相对侧增加(以线性或非线性方式)的细胞密度。在某些实施方案中，给定层中的细胞密度可在两个方向上变化。例如，在一些实施方案中，给定层中的细胞密度可跨越层在x方向和y方向两者上增加(以线性或非线性方式)。在某些实施方案中，细胞密度可从0变化至100x10⁶个细胞/mL或更多。

在一些实施方案中，本发明的人造半月板植入物的至少一层可包含至少一种周向和/或径向取向的合成组织纤维。一种或多种周向和/或径向纤维可具有相同或不同的直径、相同或不同的基质材料、相同或不同的细胞类型以及相同或不同的细胞密度。在某些实施方案中，合成组织纤维的直径可从20μm变化至500μm。

在某些实施方案中，合成组织纤维被配置来促进与合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。在某些实施方案中，合成组织纤维配置来促进随机取向的胶原纤维的沉积。如图10中所提供的，3D工程化组织中的胶原纤维呈现取决于用于产生3D组织的支架材料的一种或多种特征的取向。相似地，可调节本发明的人造半月板植入物的各方面以控制植入物材料内的胶原纤维的取向。

在某些实施方案中，如上所述，使用层的顺序沉积来构造本发明的半月板植入物，使得半月板植入物包括内部区带、中心区带和外部区带，如图11中所提供。在某些实施方案中，可控制存在于任何给定区带中的细胞类型、细胞密度和/或基质材料，从而产生类似于天然半月板组织的天然架构和生物力学特征的半月板植入物。

生物相容性基质材料：

在特别优选的实施方案中，固化的生物相容性基质在生理学上是相容的，即有助于细胞生长、分化和连通。“生理基质材料”意指在天然哺乳动物组织中存在的生物材料。此类生理基质材料的非限制性实例包括：纤连蛋白、血小板反应蛋白、糖胺聚糖(GAG)(例如，透明质酸、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、软骨素-4-硫酸盐或硫酸角蛋白)、脱氧核糖核酸(DNA)、粘附糖蛋白和胶原(例如，胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V、胶原VI或胶原XVIII)。

哺乳动物细胞类型：

可用于本发明的半月板植入物的哺乳动物细胞类型的非限制性实例包括：成纤维细胞、软骨细胞、半月板纤维软骨细胞、干细胞、骨髓基质(干)细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导的多能干细胞、分化的干细胞、组织衍生的细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、成肌细胞、成软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞以及它们的任何组合。

细胞可从供体(同种异体)或从受体(自体)获得。细胞也可来自已建立的细胞培养系，或者可以是经过基因工程化和/或操作以获得表型的所需基因型的细胞。在一些实施方案中，还可使用组织片，其可在同一结构中提供许多不同的细胞类型。在一个优选的实施方案中，人造半月板植入物包含患者特异性骨髓衍生的间充质干细胞。在一个优选的实施方案中，人造半月板植入物包含原代半月板软骨细胞。在一个优选的实施方案中，人造半月板植入物包含微血管内皮细胞。在一个优选的实施方案中，人造半月板植入物包含患者特异性诱导的多能干细胞衍生的软骨细胞。

在一些实施方案中，细胞可从合适的供体(人类或动物)获得，或者从待植入细胞的受试者获得。哺乳动物物种包括但不限于人类、猴、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠。在一个实施方案中，细胞是人类细胞。在其他实施方案中，细胞可衍生自动物，诸如狗、猫、马、猴或任何其他哺乳动物。

不受任何特定理论的束缚，接种的细胞数量不限制产生的最终组织(例如，半月板)，然而，最佳细胞密度可改善本发明的半月板植入物的一种或多种特性。

细胞可存在于半月板植入物内的任何位置，例如，在基底区带内、在内部区带内和/或在表面区带内。在一些实施方案中，为了模拟天然半月板纤维软骨结构，可将不同类型的细胞在空间上放置在半月板植入物的某些区带中。例如，在一些实施方案中，一种或多种成纤维细胞可放置在半月板植入物的第一区域中和/或各个层中。在一些实施方案中，一种或多种软骨细胞可放置在半月板植入物的第一区域中和/或各个层中。

特定类型的并且具有特定密度的细胞可放置到本发明的半月板植入物的任何所需区带中。在一些实施方案中，一种或多种干细胞(例如骨髓干细胞)可放置在本发明的半月板植入物的至少一部分和/或其各个层内。在一些实施方案中，至少一部分干细胞可分化成软骨形成表型。本领域普通技术人员可易于将干细胞分化成所需的表型(例如，软骨形成表型)，例如，通过将细胞暴露于本领域公认的细胞分化因子和/或可商购获得的分化培养基来执行。

哺乳动物细胞的适当生长条件是本领域熟知的(Freshney,R.I.(2000)Cultureof Animal Cells,a Manual of Basic Technique.Hoboken N.J.,John Wiley&Sons；Lanza等人Principles of Tissue Engineering,Academic Press；第2版，2000年5月15日；以及Lanza和Atala,Methods of Tissue Engineering Academic Press；第1版，2001年10月)。细胞培养基通常包括必需营养素和任选的其他要素，诸如生长因子、盐、矿物质、维生素等，其可根据培养的一种或多种细胞类型进行选择。可选择特定成分以增强细胞生长、分化、特定蛋白质的分泌等。通常，标准生长培养基包括Dulbecco改良Eagle培养基，低葡萄糖(DMEM)，具有110mg/L丙酮酸和谷氨酰胺，补充有10％-20％胎牛血清(FBS)或小牛血清和100U/ml青霉素是合适的，本领域技术人员熟知的各种其他标准培养基也是如此。生长条件将根据使用的哺乳动物细胞的类型和所需的组织而变化。

人类细胞的另外来源包括但不限于骨髓衍生的间充质干细胞(MSC)和原代人类半月板衍生的软骨细胞。MSC对于再生医学目的是有吸引力的，因为它们可从患者中分离并且易于扩展以用作自体移植物组织替换物。与供体同种异体移植物不同，受体来源的MSC自体移植物具有零人间疾病传播或免疫介导的组织排斥的风险。MSC的另一个优点是将MSC分化为纤维软骨细胞样细胞的培养方案被良好地定义。已证明化学成分确定的培养基在培养的MSC中诱导软骨形成表型，并且在10周的时间内通过在微球培养物中的MFC来促进纤维软骨ECM的沉积(Mauck 2006和Brendon 2007)。

在2D细胞培养条件下软骨细胞的去分化促进对更复杂的生理培养条件的影响的研究。氧气对细胞行为具有基本影响，并且由于缺乏含氧血液供应，半月板无血管区带的细胞处于低氧条件下。若干研究调查低氧生长条件对软骨细胞表型的影响；与在常氧(21％O₂)条件下生长的相同细胞相比，在低氧(5％O₂)培养物中生长的牛关节软骨细胞显示在蛋白质水平上重新表达大量的胶原-II(Domm等人，2002)。半月板处于常规压缩应力下，并且已假定机械刺激是触发适当的软骨细胞表型所必需的。在1MHz的频率下的超声波刺激被证明增加ECM沉积在2D和3D培养物中的软骨细胞附近，但是所述效应是短暂的，仅持续28天(Hsu等人，2006)。Upton等人从半月板的内部和外部区带分离细胞，并将它们在柔性膜上以单层生长。当暴露于5％的双轴应变时，两种细胞群均显示增加NO和总蛋白质表达(Upton等人，2006)。为了获得最佳的半月板生物力学性能，可利用低氧培养和机械应变来最大化3D培养物中的MSC衍生的软骨细胞或原代半月板细胞的表型分化。

活性剂：

在一些方面，根据本发明实施方案的半月板植入物可包含至少一种活性剂。此类活性剂的非限制性实例包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-12、BMP-13、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2、血小板衍生的生长因子-AA、血小板衍生的生长因子-BB、富血小板血浆、IGF-I、IGF-II、GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、血管内皮细胞衍生的生长因子、多效生长因子、内皮素、烟酰胺、胰高血糖素样肽-I、胰高血糖素样肽-II、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、原弹性蛋白、凝血酶衍生肽、层粘连蛋白、含有细胞结合结构域的生物肽和含有肝素结合结构域的生物肽、治疗剂以及它们的任何组合。

如本文所用的术语“治疗剂”是指在受试者中局部或全身起作用的生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。治疗剂的非限制性实例，也称为“药物”，描述于熟知的参考文献中，诸如Merck Index、Physician's Desk Reference和The PharmacologicalBasis of Therapeutics，并且它们包括但不限于药剂；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或病患的物质；影响身体结构或功能的物质；或者前药，它们在被置于生理环境中后变得具有生物活性或更具活性。在一些实施方案中，可使用一种或多种治疗剂，其能够在植入受试者后从本文所述的半月板植入物释放到相邻的组织或流体中。治疗剂的实例包括但不限于抗生素、麻醉剂、促进半月板再生或组织愈合的任何治疗剂或减轻疼痛、感染或炎症的任何治疗剂或它们的任何组合。

另外的活性剂可包括但不限于蛋白质、肽、核酸类似物、核苷酸、寡核苷酸、核酸(DNA、RNA、siRNA)、肽核酸、适体、抗体或其片段或部分、抗原或表位、激素、激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子及其片段和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗微生物化合物、抗炎剂、抗真菌剂、抗病毒药、毒素、前药、小分子、药物(例如，药物、染料、氨基酸、维生素、抗氧化剂)或它们的任何组合。

适合包含在本发明的半月板植入物中的抗生素的非限制性实例包括：氨基糖苷类(例如，新霉素)、安沙霉素、碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类(例如，头孢唑啉、头孢克洛、头孢托仑、头孢托仑、头孢托吡酯)、糖肽(例如，万古霉素)、大环内酯类(例如，红霉素、阿奇霉素)、单环内酰胺类、青霉素类(例如，阿莫西林、氨苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林)、多肽(例如，杆菌肽、多粘菌素B)、喹诺酮类(例如，环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、氧氟沙星等)、磺胺类药物(例如，柳氮磺胺吡啶、甲氧苄啶、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异恶唑(复方新诺明))、四环素类(例如，多西环素、米诺环素、四环素等)、氯霉素、林可霉素、克林霉素、乙胺丁醇、莫匹罗星、甲硝唑、吡嗪酰胺、甲砜霉素、利福平、甲砜霉素、氨苯砜、氯法齐明、奎奴普丁、甲硝唑、利奈唑胺、异烟肼、磷霉素、夫西地酸或它们的任何组合。

抗体的非限制性实例包括：阿昔单抗、阿达木单抗、阿仑单抗、巴利昔单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、赛妥珠单抗、达利珠单抗、依库珠单抗、依法珠单抗、吉妥珠单抗、替依莫单抗、英夫利昔单抗、莫诺单抗-CD3、那他珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、帕利珠单抗、帕尼单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、阿妥莫单抗三胺五乙酸、阿西莫单抗、阿特利珠单抗、贝妥莫单抗、贝利单抗、贝索单抗、比西单抗、康纳单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、地诺单抗、依决洛单抗、依芬古单抗、厄妥索单抗、伊瑞西珠、法索单抗、芳妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、戈利木单抗、伊戈伏单抗、英西单抗、拉美珠单抗、美泊利单抗、莫托维珠、尼妥珠单抗、巯诺莫单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、帕妥珠单抗、罗维珠单抗、鲁利单抗、硫索单抗、他珠单抗、特巴珠单抗、托珠单抗、优特克单抗、维西珠单抗、伏妥莫单抗、扎鲁木单抗、扎木单抗或它们的任何组合。

适用于如本文所述的半月板植入物的酶的非限制性实例包括：过氧化物酶、脂肪酶、直链淀粉、有机磷酸酯脱氢酶、连接酶、限制性内切核酸酶、核糖核酸酶、DNA聚合酶、葡萄糖氧化酶和漆酶。

适用于本发明的半月板植入物的活性剂的另外的非限制性实例包括：细胞生长培养基，诸如Dulbecco改良Eagle培养基、胎牛血清、非必需氨基酸和抗生素；生长和形态发生因子，诸如成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、胰岛素样生长因子)、骨形态发生生长因子、骨形态发生样蛋白、转化生长因子、神经生长因子和相关蛋白质(生长因子是本领域已知的，参见例如Rosen和Thies，CELLULAR&MOLECULAR BASIS BONE FORMATION&REPAIR(R.G.Landes公司,Austin,Tex.,1995)；抗血管生成蛋白，诸如内皮抑素，以及其他天然来源或基因工程化蛋白；多糖、糖蛋白或脂蛋白；抗感染剂，诸如抗生素和抗病毒剂、化学治疗剂(即，抗癌剂)、抗排斥剂、镇痛剂和镇痛剂组合、抗炎剂、类固醇或它们的任何组合。

修复半月板缺损的方法：

本发明的各方面包括用于修复和/或替换受试者中的至少一部分半月板的方法。可将本文所述的任何半月板植入物植入到有需要的受试者中，以完成半月板修复或再生。因此，本文还提供在受试者中修复半月板缺损或促进半月板再生的方法。在一个实施方案中，一种方法包括将如本文所述的半月板植入物植入需要半月板修复或再生的缺损部位中。

术语“受试者”包括但不限于人类，非人类灵长类动物，诸如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，诸如牛、羊、猪、山羊和马；家养的哺乳动物，诸如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠等。所述术语不指示特定年龄或性别。因此，包括成人和新生儿以及胎儿，无论是男性还是女性。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，受试者是人类受试者。

在一些实施方案中，一种方法可包括将半月板植入物或其锚定区域固定在缺损部位处，和/或将半月板植入物的一个或多个锚定区域固定到受试者内的至少一个解剖结构。在一些实施方案中，一种方法还可包括从受试者移除至少一部分有缺陷的半月板。

在一些实施方案中，一种方法还可包括向受试者全身和/或局部(例如，至半月板植入物部位)施用至少一种本文所述的活性剂。

本文提及的所有专利和专利出版物均通过引用整体在此并入。

本领域技术人员在阅读前述描述之后将做出某些改变和改进。应理解，为了简明和可读性，并非所有此类修改和改进都包括在本文中，而是适当地在以下权利要求的范围内。

Claims

1.一种合成组织结构，其包括由生物打印机沉积的多个层，每个层包含一种或多种合成组织纤维，所述合成组织纤维包含固化的生物相容性基质，所述基质任选地包含细胞，并且任选地包含活性剂，其中所述层中的至少一个包含在所述至少一个层内在至少一个方向上变化的基质材料、细胞类型、细胞密度或活性剂的量或类型。

2.根据权利要求1所述的合成组织结构，其中所述层中的至少一个包含从所述生物打印机分配的单个连续合成组织纤维。

3.根据权利要求2所述的合成组织结构，其中从所述生物打印机分配的所述单个连续合成组织纤维具有可变组成。

4.根据权利要求1所述的合成组织结构，其中所述层中的至少一个包含在至少一个方向上在类型和/或量上变化的基质材料。

5.根据权利要求4所述的合成组织结构，其中所述层中的每一个包含在至少一个方向上在类型和/或量上变化的基质材料。

6.根据权利要求1所述的合成组织结构，其中所述层中的至少一个包含在至少一个方向上变化的细胞类型和/或细胞密度。

7.根据权利要求6所述的合成组织结构，其中所述层中的每一个包含在至少一个方向上变化的细胞类型和/或细胞密度。

8.根据权利要求1所述的合成组织结构，其中所述层中的至少一个包含在至少一个方向上在类型和/或量上变化的活性剂。

9.根据权利要求8所述的合成组织结构，其中所述层中的每一个包含在至少一个方向上在类型和/或量上变化的活性剂。

10.根据权利要求1所述的合成活组织结构，其中所述层中的每一个包含在所述层内在至少一个方向上变化的基质材料、细胞类型、细胞密度或活性剂的量。

11.根据权利要求1所述的合成组织结构，其还包括一个或多个锚定区域。

12.根据权利要求1所述的合成组织结构，其还包括一个或多个增强的周边区域。

13.一种半月板植入物，其包括：

至少一个基底区带；

至少一个内部区带；以及

至少一个表面区带；

其中所述区带中的至少一个包括层，所述层包含从生物打印机分配的一种或多种合成组织纤维，作为固化的生物相容性基质，所述基质任选地包含细胞，其中所述基质材料在所述层的中心与所述层的周边之间在类型和/或量上变化。

14.根据权利要求13所述的半月板植入物，其中所述区带中的每一个包括层，所述层包含在所述层的中心与所述层的周边之间在类型和/或量上变化的基质材料。

15.根据权利要求13所述的半月板植入物，其中所述区带中的至少一个包括层，所述层包含至少一种活性剂，所述活性剂在所述层的中心与所述层的周边之间在类型和/或量上变化。

16.根据权利要求15所述的半月板植入物，其中所述区带中的所述层中的每一个包含至少一种活性剂，所述活性剂在所述层的中心与所述层的周边之间在类型和/或量上变化。

17.根据权利要求13所述的半月板植入物，其中所述区带中的至少一个的一层的周边区域包含至少一种活性剂，所述活性剂适于随着时间的推移从所述基质释放。

18.根据权利要求17所述的半月板植入物，其中所述层的整个周边包含至少一种活性剂，所述活性剂适于随着时间的推移从所述基质释放。

19.根据权利要求17所述的半月板植入物，其中所述区带中的每个中的每个层的周边区域包含至少一种活性剂，所述活性剂适于随着时间的推移从所述基质释放。

20.根据权利要求19所述的半月板植入物，其中所述层中的每个的整个周边包含至少一种活性剂，所述活性剂适于随着时间的推移从所述基质释放。

21.根据权利要求13-20中任一项所述的半月板植入物，其中所述区带中的至少一个中的至少一个层包含多种活性剂。

22.根据权利要求13-20中任一项所述的半月板植入物，其中所述区带中的每个中的所述层中的每个包含多种活性剂。

23.根据权利要求13-22中任一项所述的半月板植入物，其中所述活性剂中的至少一种是抗炎剂。

24.根据权利要求13-23中任一项所述的半月板植入物，其中所述层中的至少一个包含从所述生物打印机分配的连续合成组织纤维。

25.根据权利要求24所述的半月板植入物，其中从所述生物打印机分配的所述连续合成组织纤维包含可变组成。

26.根据权利要求13-25中任一项所述的半月板植入物，其还包括一个或多个增强的周边区域。

27.根据权利要求13-25中任一项所述的半月板植入物，其还包括一个或多个锚定区域。

28.根据权利要求13所述的半月板植入物，其中所述半月板植入物具有弓形形状，所述弓形形状具有前端、后端、在其之间的在所述前端与所述后端之间限定弯曲路径的中间部分、内侧和外侧。

29.根据权利要求28所述的半月板植入物，其中所述细胞密度以径向方式从所述内侧向所述外侧增加。

30.根据权利要求28所述的半月板植入物，其中一种或多种增强基质材料的浓度以径向方式从所述内侧向所述外侧增加。

31.根据权利要求28所述的半月板植入物，其中一种或多种活性剂的量以径向方式从所述内侧向所述外侧增加。

32.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中：

所述基底区带包括至少一个包含至少一种随机取向的合成组织纤维的层；

所述内部区带包括至少一个层，所述层包含：

至少一种周向取向的合成组织纤维；和

至少一种径向取向的合成组织纤维；并且

所述表面区带包括至少一个包含至少一种随机取向的合成组织纤维的层。

33.根据权利要求32所述的半月板植入物，其中所述周向取向的合成组织纤维具有第一直径，并且其中所述径向取向的合成组织纤维具有不同的第二直径。

34.根据权利要求32所述的半月板植入物，其中所述周向取向的合成组织纤维和所述径向取向的合成组织纤维具有相同的直径。

35.根据权利要求32所述的半月板植入物，其中所述周向取向的合成组织纤维包含第一固化的生物相容性基质，并且其中所述径向取向的合成组织纤维包含不同的第二固化的生物相容性基质。

36.根据权利要求32所述的半月板植入物，其中所述周向取向的合成组织纤维和所述径向取向的合成组织纤维包含相同的固化的生物相容性基质。

37.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中所述合成组织纤维结构具有范围是约20μm至约500μm的直径。

38.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中所述内部区带包括至少一个层，所述至少一个层包含至少一种合成组织纤维，所述合成组织纤维被配置来促进与所述合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。

39.根据权利要求38所述的半月板植入物，其中所述内部区带包括至少一个层，所述至少一个层包含至少一种周向取向的合成组织纤维，所述合成组织纤维被配置来促进与所述周向取向的合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。

40.根据权利要求38所述的半月板植入物，其中所述内部区带包括至少一个层，所述至少一个层包含至少一种径向取向的合成组织纤维，所述合成组织纤维被配置来促进与所述径向取向的合成组织纤维的纵向方向对齐的胶原纤维的沉积。

41.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中所述固化的生物相容性基质在生理学上是相容的。

42.根据权利要求41所述的半月板植入物，其中所述固化的生物相容性基质包含以下中的一种或多种：胶原、纤连蛋白、血小板反应蛋白、糖胺聚糖(GAG)、脱氧核糖核酸(DNA)、粘附糖蛋白、弹性蛋白以及它们的组合。

43.根据权利要求42所述的半月板植入物，其中所述胶原是：胶原I、胶原II、胶原III、胶原IV、胶原V、胶原VI或胶原XVIII。

44.根据权利要求42所述的半月板植入物，其中所述GAG是：透明质酸、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、软骨素-4-硫酸盐或硫酸角质素。

45.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中所述合成组织纤维包含在径向横截面上均匀的固化的生物相容性基质材料。

46.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中所述哺乳动物细胞选自由以下组成的组：成纤维细胞、软骨细胞、纤维软骨细胞、原代人类半月板衍生的软骨细胞、干细胞、骨髓细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、骨髓衍生的间充质干细胞、诱导的多能干细胞、分化的干细胞、组织衍生的细胞、微血管内皮细胞以及它们的组合。

47.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中所述细胞密度的范围是0至约100x 10⁶个细胞/mL。

48.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其还包括位于所述基底区带下方的无细胞鞘。

49.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其还包括位于所述表面区带上方的无细胞鞘。

50.根据前述权利要求中任一项所述的半月板植入物，其中所述至少一种活性剂选自由以下组成的组：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-12、BMP-13、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2、血小板衍生的生长因子-AA、血小板衍生的生长因子-BB、富血小板血浆、IGF-I、IGF-II、GDF-5、GDF-6、GDF-8、GDF-10、血管内皮细胞衍生的生长因子、多效生长因子、内皮素、烟酰胺、胰高血糖素样肽-I、胰高血糖素样肽-II、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、原弹性蛋白、凝血酶衍生肽、层粘连蛋白、含有细胞结合结构域的生物肽和含有肝素结合结构域的生物肽、治疗剂以及它们的任何组合。