CN105013011A - 一种组织工程半月板支架的3d生物打印制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，为组织工程半月板研究提供新的工艺方法，步骤为：1）构建半月板三维模型，获得多层切片的CAD数据模型；2）制备可降解生物支架材料P(LLA-CL)；3）在3D生物打印机的料筒中加入支架材料P(LLA-CL)，依据CAD数据模型，打印得到可负载细胞的半月板三维支架；4）通过3D生物打印机，向半月板三维支架中注入生长因子，得到半月板组织；5）完成半月板移植。

Description

一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，特别适用于生物医学组织工程支架材料的制备，具体为一种组织工程半月板三维支架的3D生物打印制备方法。

背景技术

半月板由纤维软骨组成，是膝关节的重要组成部分，具有吸收震荡、传递负荷、营养关节软骨、润滑和增加关节接触面积以及维持关节稳定等重要功能，并可在一定程度上缓和股骨与胫骨之间的不一致性。半月板严重损伤或切除后，半月板对关节软骨的保护作用丧失、关节软骨退变加速，导致膝关节不稳和载荷传递紊乱，以至骨性关节炎的发生。随着对半月板结构和功能认识的深入，在半月板损伤的治疗中应尽量保留和修复半月板已成为共识，然而，并非所有损伤的半月板均可得到修复。对于半月板完全破坏、无法修复或已被切除者， 半月板的移植或再造修复成为人们最为关注的问题。

组织工程以新型支架材料为基础为半月板提供了潜在的治疗策略。目前常用的组织工程半月板支架均未能很好的模仿人体半月板的三维形态、结构和机械力学性能。例如静电纺丝是一个简单实用的，能编造出具有高孔隙率，纳米到微米级，与细胞外基质结构相似的支架的编制方法，目前常见的静电纺丝纳米纤维支架的孔径过小且丝状结构无序排列，不利于细胞向其内部生长；例如3D生物打印制备植入假体的方法，采用金属粉末或尼龙等，打印设备采用激光烧结技术类型（SLS），该方法的制备品是不具备活性的支撑假体，不具备生物降解性，也不能植入活性细胞。本发明采用的3D生物打印可以自由控制孔隙结构与孔隙率，同时本发明用具有良好弹性和生物降解性的聚乳酸-聚己内酯共聚物（P(LLA-CL) ）作为支架材料，运用3D生物打印的方法制备三维，多孔隙的半月板支架。

基于传统组织工程原理的治疗措施包括：应用种子细胞促进半月板损伤的愈合；应用天然或人工合成的半月板假体替代切除的半月板组织；体外构建组织工程化半月板，然后植入体内，实现半月板的再生。由于工艺及装备技术的局限，目前制备骨软骨支架在一体化成形方面存在局限，因而修复的组织在分散应力、抵抗剪切力、以及限制组织液在骨与软骨之间自由交换等功能方面还无法满足临床需求。组织工程发展到20世纪，三维打印（Three Dimensional Printing，简称3D打印）技术为制备软骨支架提供了新的思路和方法，为半月板缺损的治疗提供了新的思路成为基础和临床研究的热点。

发明内容

本发明的目的是为解决患者膝关节半月板受损修复，提供一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，为组织工程半月板研究提供新的工艺方法。

本发明的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，步骤为：

1）构建半月板三维模型，载入到3D生物打印机应用软件中进行处理，对半月板三维模型进行分层切片，获得多层切片的CAD数据模型；

2）制备可降解生物支架材料P(LLA-CL)，以L-乳酸与ε-己内酯为原料，在催化条件下进行开环共聚反应，制备出高分子量的P(LLA-CL)无规共聚物；

3）在3D生物打印机的料筒中加入支架材料P(LLA-CL)，依据CAD数据模型，打印得到可负载细胞的半月板三维支架；

4）  通过3D生物打印机，向半月板三维支架中注入生长因子，得到半月板组织；

5）将半月板组织安装在取出的已损坏的半月板的对应位置，完成半月板移植。

进一步的，所述步骤1）中构建半月板三维模型是根据核磁共振的医学影像数据进行三维重建得到的，具体为：

S1：对健康人的完好膝关节进行核磁共振，扫描原始数据，存入数据库；在3D生物打印机的图形处理软件中通过图像分割、编辑、三维计算处理，行成与患者受损的半月板相对应的半月板三维模型；

S2：将步骤S1建立的半月板三维模型进行镜像操作，得到适用于患者的受损半月板的三维模型；

S3：在受损半月板三维模型上添加骨桩模型；

S4：对半月板的替代三维模型的局部结构进行修正并保存。

进一步的，所述骨桩模型的长*宽*厚为8-12 mm*10-15 mm*1-3 mm。

进一步的，所述半月板三维模型中半月板本体为多孔结构，骨桩为不带孔的实体。

进一步的，所述步骤2）中共聚反应的压强小于0.5Pa，温度为120-150℃，催化剂与原料的摩尔比为6000- 8000:1，聚合时间为36-48h，所述催化剂为辛酸亚锡。

进一步的，所述高分子量的P(LLA-CL)无规共聚物的重均分子量为3.0×10⁵-7.0×10⁵，分子量分布系数为1.1-1.5。

进一步的，所述步骤3）中取支架材料P(LLA-CL)加入到支架打印头的料筒内，加热到120-180℃，然后将3D生物打印机的X、Y、Z三轴调整到打印成型合适的位置；启动打印程序，支架打印头在具有层片信息的CAD数据模型直接驱动下，将材料挤出在载有灭菌玻璃底板的打印平台上，不同的层面之间再层层交错叠加粘结，形成半月板形状的三维结构体，得到可负载细胞的半月板三维支架。

进一步的，所述步骤3）中打印头直径为150-250μm，挤出速度为0.02-0.025mm/s，打印速度为3-8mm/s，层厚0.02-0.08mm。

进一步的，所述步骤5）中半月板移植方法为将组织工程半月板的两个骨桩穿过预设的骨隧道，用可降解骨钉将骨桩固定于胫骨上，用丝线将半月板外缘缝合于关节囊上即完成半月板移植。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明通过运用3D生物打印的方法制备半月板支架，能很好的模仿人体半月板的三维形态、结构，定向的孔隙结构利于引导细胞贴壁生长。同时用具有良好弹性和生物降解性的聚乳酸-聚己内酯共聚物（P(LLA-CL) ）作为支架材料，在生物支架制备品中植入细胞，具有活性，靠细胞增殖与支架逐步降解，最终形成人体的活性组织，满足组织工程半月板对力学性能的要求。

附图说明

图1. 本发明的3D生物打印制备的半月板结构图；

 图2. 三维重建后的半月板模型示意图；

 图3. 本发明的3D生物打印制备的半月板植入膝关节时的结构示意图。

 具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，是通过核磁共振（MRI）对患者完好膝关节中与受损半月板对应的完好半月板成像，利用MRI成像数据重建出用于修复的半月板三维模型，借助3D生物打印设备制备半月板支架，植入细胞培养。本发明通过3D生物打印制备半月板支架，可以准确控制支架的结构、孔隙率，利于细胞贴壁繁殖，同时选用的可降解材料满足对半月板支架的生物相容性与机械性能要求。具体包括如下步骤：

1）构建半月板三维模型，是根据核磁共振的医学影像数据进行三维重建得到的，具体为：

S1：对健康人的完好膝关节进行核磁共振（MRI），扫描原始数据，存入数据库；在3D生物打印机的图形处理软件中通过图像分割、编辑、三维计算处理，行成与患者受损的半月板相对应的膝关节中同侧（外侧或内侧）半月板三维模型。

S2：将步骤S1建立的半月板三维模型进行镜像操作，得到适用于患者的受损半月板的三维模型（如图2所示）。

S3：在受损半月板三维模型上添加骨桩模型（1），所述骨桩模型的长*宽*厚为8-12 mm*10-15 mm*1-3 mm；优选为10mm*12mm*2mm，用于半月板移植时与骨骼固定。

S4：在3D生物打印机的图形处理软件中对半月板的替代三维模型的局部结构进行修正，进行曲面形态优化，提高光顺度，将修正后的半月板三维模型保存为stl格式的模型文件，以便进行3D生物打印。

2）对半月板三维模型进行分层切片

将修正后的半月板三维模型载入到3D生物打印机应用软件中，并对其进行摆放定位、添加支撑、设置孔隙率和孔径、切片分层等处理，获得多层切片的二维数据模型。处理中半月板本体（2）设置成多孔结构，用来固定的骨桩（1）设置成不带孔的实体。

3）可降解生物支架材料P(LLA-CL)的制备

以L-乳酸与ε-己内酯为原料，在催化条件下进行开环共聚反应，制备出高分子量的P(LLA-CL)无规共聚物。工艺条件为：聚合反应容器内压强小于0.5Pa，聚合温度为120-150℃，催化剂与原料的摩尔比为6000- 8000:1，聚合时间为36-48h，制备的P(LLA-CL)无规共聚物的重均分子量为3.0×10⁵-7.0×10⁵，分子量分布系数为1.1-1.5。所述催化剂为辛酸亚锡。

本发明优选的工艺条件为：以L-乳酸与ε-己内酯为原料，在辛酸亚锡为催化剂的条件下进行开环共聚反应，聚合反应容器内压强小于0.5Pa，聚合温度为130℃，n(M)/n(I)比值为8000:1，聚合时间为36h，制备出重均分子量为65.6×10⁴、分子量分布系数为1.15的P(LLA-CL)65/35无规共聚物。

4）打印半月板三维支架

采用生物打印机，取半月板支架材料P(LLA-CL) 10克加入到支架打印头的料筒内，所述支架打印头采用步进电机驱动。启动料筒的加热装置，将半月板支架材料加热到150℃，然后将生物打印机的X、Y、Z三轴调整到打印成型合适的位置。启动打印程序，支架打印头在具有层片信息的CAD模型直接驱动下，将材料挤出在载有灭菌玻璃底板的打印平台上，打印头直径为150-250μm，挤出速度为0.02-0.025mm/s，打印速度为3-8mm/s，层厚0.02-0.08mm。优选的，打印头直径为200μm，挤出速度为0.0225mm/s，打印速度为6mm/s，层厚0.05mm。不同的层面之间再层层交错叠加粘结，形成半月板形状的三维结构体（如附图3所示），结构体的孔隙直径为200μm，孔隙率为90%，得到可负载细胞的半月板三维支架。

5）向组织工程半月板支架中注入生长因子

通过生物打印机，向组织工程半月板支架中注入结缔组织生长因子（CTGF），生长因子能够刺激人体内部的干细胞，促使他们重新生成半月板组织。

6）  半月板移植

移植时，如图3所示，将半月板组织（2）安装在取出的已损坏的半月板的对应位置，组织工程半月板的两个骨桩（1）穿过预设的骨隧道（3），用可降解骨钉（4）将骨桩（1）固定于胫骨上，用丝线将半月板外缘缝合于关节囊上即完成半月板移植。

以上实施例仅是本发明若干种优选实施方式中一种，应当指出，本发明不限于上述实施例；对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，步骤为：

1）构建半月板三维模型，载入到3D生物打印机应用软件中进行处理，对半月板三维模型进行分层切片，获得多层切片的CAD数据模型；

2）制备可降解生物支架材料P(LLA-CL)，以L-乳酸与ε-己内酯为原料，在催化条件下进行开环共聚反应，制备出高分子量的P(LLA-CL)无规共聚物；

3）在3D生物打印机的料筒中加入支架材料P(LLA-CL)，依据CAD数据模型，打印得到可负载细胞的半月板三维支架；

通过3D生物打印机，向半月板三维支架中注入生长因子，得到半月板组织；

5）将半月板组织安装在取出的已损坏的半月板的对应位置，完成半月板移植。

2.根据权利要求1所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述步骤1）中构建半月板三维模型是根据核磁共振的医学影像数据进行三维重建得到的，具体为：

S1：对健康人的完好膝关节进行核磁共振，扫描原始数据，存入数据库；在3D生物打印机的图形处理软件中通过图像分割、编辑、三维计算处理，行成与患者受损的半月板相对应的半月板三维模型；

S2：将步骤S1建立的半月板三维模型进行镜像操作，得到适用于患者的受损半月板的三维模型；

S3：在受损半月板三维模型上添加骨桩模型； 

S4：对半月板的替代三维模型的局部结构进行修正并保存。

3.根据权利要求2所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述骨桩模型的长*宽*厚为8-12 mm*10-15 mm*1-3 mm。

4.根据权利要求2所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述半月板三维模型中半月板本体为多孔结构，骨桩为不带孔的实体。

5.根据权利要求1所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述步骤2）中共聚反应的压强小于0.5Pa，温度为120-150℃，催化剂与原料的摩尔比为6000- 8000:1，聚合时间为36-48h，所述催化剂为辛酸亚锡。

6.根据权利要求5所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述高分子量的P(LLA-CL)无规共聚物的重均分子量为3.0×10⁵-7.0×10⁵，分子量分布系数为1.1-1.5。

7.根据权利要求1所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述步骤3）中取支架材料P(LLA-CL)加入到支架打印头的料筒内，加热到120-180℃，然后将3D生物打印机的X、Y、Z三轴调整到打印成型合适的位置；启动打印程序，支架打印头在具有层片信息的CAD数据模型直接驱动下，将材料挤出在载有灭菌玻璃底板的打印平台上，不同的层面之间再层层交错叠加粘结，形成半月板形状的三维结构体，得到可负载细胞的半月板三维支架。

8.根据权利要求7所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述步骤3）中打印头直径为150-250μm，挤出速度为0.02-0.025mm/s，打印速度为3-8mm/s，层厚0.02-0.08mm。

9.  根据权利要求1所述的一种组织工程半月板支架的3D生物打印制备方法，其特征在于，所述步骤5）中半月板移植方法为将组织工程半月板的两个骨桩穿过预设的骨隧道，用可降解骨钉将骨桩固定于胫骨上，用丝线将半月板外缘缝合于关节囊上即完成半月板移植。