CN109676915B - 一种车轮状多孔支架及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种车轮状多孔支架及其制备方法与应用，多孔支架是由生物材料制得的三维多孔结构，包括多个层叠设置的车轮状单元，所述车轮状单元包括设于同一平面的若干个不同大小的圆形梁，沿所述圆形梁的径向呈辐射状设有多条不同长度的直线梁。该结构不但能改善组织工程多孔支架内外部孔的连通性，便于内外营养和废物的交换，改善周围细胞和组织的长入情况，同时还提高组织工程多孔支架的压缩强度，结构稳定性以及抗疲劳等力学性能，便于在组织修复再生过程中积极传递力学信号和维持结构的完整性。
Description
技术领域
本发明属于生物医学材料与组织修复技术领域，具体涉及一种车轮状多孔支架及其制备方法与应用。
背景技术
在生物医学材料与组织修复领域，通常将组织工程多孔支架植入到组织缺损处，随着组织缺损部位不断地承受着生理力学的循环负载，周围的细胞和组织不断地长入支架内部并受到力学的刺激不断地分泌细胞外基质，组织多孔支架不断地降解以及组织的不断形成，从而重建出新的与自身形态和功能相适应的组织和器官，以达到组织修复的目的。
在组织重建过程中，尤其对于骨骼和关节软骨等功能性和生理负重组织，组织工程多孔支架的力学性能则扮演着重要的角色。一个与周围组织有良好匹配力学性能的组织工程多孔支架不但可以为细胞和组织的生长提供暂时性的支撑，同时能够维持支架内部孔的连通性以便于内外营养物质和废物的交换。对于承受力学负载的组织部位，还要求组织工程支架能够承受一定的力学负载，向细胞组织传递力学信号以及始终保持结构力学性能的完整性。
关于组织工程多孔支架力学性能的影响因素，目前已经有较为丰富的报道，比如通过各种不同的支架制作和成型技术，例如纤维纺织技术、粒子滤除技术、气体发泡技术、相分离技术、微球烧结技术等来研究组织工程多孔支架的材料组成、孔形状、孔尺寸、孔取向、孔隙率以及支架结构等等对其力学性能的影响。比如利用粒子滤除技术，通过制备不同尺寸的致孔剂来获得不同孔尺寸的多孔支架，从而研究其力学性能；利用纤维纺织技术，通过制备不同孔取向的多孔支架，从而研究其力学性能等等。但是这些技术都在具有不同结构设计的多孔支架制备上存在限制，从而不能探索并获得更好结构力学的组织工程多孔支架，而3D打印技术的可个性化定制特点可以帮我们实现更加合适的支架设计。
3D打印技术已经被广泛应用于生物医学工程领域。3D打印方法可以是熔融挤出、低温挤出、激光烧结、数字光处理、电子束熔化成型、分层实体制造、粉末粘结以及光固化成型等等。组织工程多孔支架的模型设计可以通过软件建模，比如支架结构设计软件SolidWorks、3D Studio Max、CINEMA 4D、Maya、Rhinocero、Google Sketchup等等。在建立模型后，可以选择不同的生物材料去利用3D打印系统进行制备从而得到所需的样品。根据现有的报道，目前通过3D打印技术制备得到的组织工程多孔支架，在结构设计上，主要是四方型以及六方型等以直线型梁为设计元素。
专利CN101874751A公开了一种多层多孔支架及其制备方法，以多孔材料，按既定尺寸剪裁后，通过含聚合物/致孔粒子/溶剂组分混合的可致孔的粘合剂粘合，固化粘结后，除去致孔剂，制成具有相互连通多层结构的多孔支架，支架具有多层结构，支架各层间含有多孔的过渡层，支架上下层的孔之间相互连通，适合于组织重建过程中不同细胞的过渡和组织间的融合，避免重建组织层与层之间的弱化分离，但该多层多孔支架压缩强度不强，结构稳定性及抗疲劳等力学性能有待于提高。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种既能改善支架内外孔的连通性，又能提高支架力学性能的车轮状多孔支架。
本发明的另一个目的就是为了提供一种车轮状多孔支架的制备方法及其在生物医学材料与组织修复领域的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种车轮状多孔支架，是由生物材料制得的三维多孔结构，包括多个层叠设置的车轮状单元，所述车轮状单元包括设于同一平面的若干个不同大小的圆形梁，沿所述圆形梁的径向呈辐射状设有多条不同长度的直线梁。在一个单元中，首先由多个不同直径的圆形梁以同一个圆心在同一个平面上构成了一层圆环状的支架，然后多条不同长度的直线梁架在圆环层上始终指向圆心，按照不同角度旋转构成第二层辐射线条状的支架，得到的两层支架合并成一个类似车轮状的单元，将这个单元进行对个复制叠加，或邻近层错位不同的角度叠加得到一定尺寸的多孔支架。
进一步地，所述圆形梁等间距同心设置，两两相邻直线梁之间的夹角相等。
进一步地，相邻圆形梁之间间距为100μm-5cm。
进一步地，所述直线梁的长度为100μm-2cm。
进一步地，所述圆形梁与直线梁的截面为圆形，直径为10μm-1cm。
进一步地，所述生物材料选自聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚羟基脂肪酸酯、羟基乙酸淀粉钠、羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物、聚己二酸、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯-1,4-环己烷二甲醇酯、尼龙11、聚氨酯、明胶、琼脂、胶原、海藻酸钠、纤维蛋白、聚氨基葡萄糖、羟基磷灰石、磷酸三钙、珍珠质、生物玻璃、不锈钢粉、纯钛粉、钛合金粉、铝合金粉、镍基合金粉、铜基合金粉或钴铬合金粉中的一种或多种。
一种车轮状多孔支架的制备方法，采用3D打印制得，其制备方法主要包括如下步骤：
(1)采用三维设计软件构造一层圆环状的梁：主要为多个不同直径的圆形梁以同一个圆心在同一个平面上组合成圆环状；
(2)在此基础上再构造一层辐射状的梁：主要为多条不同长度的直线梁架在圆环层上始终指向圆心按照不同的角度旋转组合成辐射状；
(3)一个支架单元：将一层圆形梁和一层辐射状的梁上下叠加成为一个车轮状支架单元；
(4)车轮状支架模型：由多个单元上下叠加组合而成；
(5)制备车轮状支架实体模型：将设计好的车轮状支架模型采用3D打印方法进行制备得出。
进一步地，所述3D打印包括熔融沉积快速成型、低温挤出、激光烧结、数字光处理、电子束熔化成型、分层实体制造、粉末粘结或光固化成型中的一种或多种。
进一步地，所述多孔支架通过三维设计软件设计得到，包括SolidWorks、3DStudio Max、CINEMA 4D、Maya、Rhinocero、Google Sketchup、CATIA、UnigraphicsNX、AutoCAD、Pro/Engineer、Cimatron、LightWave 3D、Poser、FormZ或Blender的一种或多种。
所述多孔支架可用于人体内组织的替换、修复和再生，尤其适用于骨和软骨等需要承载力学负荷的组织部位，可应用于因先天性、运动创伤、老龄化及意外事故等所导致的骨软骨组织或者其他需要承载力学负荷的组织部位缺损的替换、修复与再生治疗。
本发明设计了一种类似车轮状多孔支架，由直线梁和圆形梁两种元素构成一个单元，然后多个单元经过层层叠加组合而成三维多孔模型，该模型可以通过3D打印的方法结合不同的生物材料从而简便而快捷地制造得到。本发明首次将直线梁和圆形梁这两种元素组合作为3D打印组织工程多孔支架的结构设计，该结构不但能改善组织工程多孔支架内外部孔的连通性，便于内外营养和废物的交换，改善周围细胞和组织的长入情况，同时还提高组织工程多孔支架的压缩强度，结构稳定性以及抗疲劳等力学性能，便于在组织修复再生过程中积极传递力学信号和维持结构的完整性。综合来说，它能更好地应用于人体内各类组织的替换，修复和再生，尤其适用于骨和软骨等需要承载力学负荷的组织部位，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为实施例1中车轮状多孔支架的立体结构示意图；
图2为实施例1中车轮状多孔支架的俯视结构示意图；
图3为实施例1中车轮状多孔支架的侧面剖析图；
图4为实施例11中车轮状多孔支架3D打印制备过程示意图；
图5为实施例11中车轮状多孔支架的实物样品图；
图6为实施例11中车轮状多孔支架通过扫描电镜对其表面进行观察研究的结果图；
图7为实施例12中车轮状多孔支架的三个单元的结构设计模型经过3D打印制备后进行观察研究的结果图；
图8为实施例17中车轮状多孔支架经过3D打印制备后通过micro-CT系统对其整体和内部结构的观察研究结果图；
图9为实施例18中车轮状多孔支架经过3D打印制备后通过电子万能试验机对其压缩力学性能测试过程示意图；
图10为实施例18中车轮状多孔支架经过3D打印制备后通过电子万能试验机对其压缩力学性能测试得到的应力应变曲线图；
图11为实施例18中车轮状多孔支架经过3D打印制备后通过电子万能试验机对其压缩力学性能测试得到的压缩模量结果图；
图12为实施例19中在由3个单元叠加组合而成车轮状多孔支架上种植大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)过程示意图(a)；并培养7天后的对其进行激光共聚焦拍摄观察研究的结果图(b)以及结果放大图(c)；
图13为实施例20中将3个单元叠加组合而成车轮状多孔支架植入大鼠皮下1个月后取出进行大体观察和组织切片观察研究的结果图；
图14为实施例20中将3个单元叠加组合而成车轮状多孔支架植入大鼠皮下3个月后取出进行大体观察和组织切片观察研究的结果图；
图15为实施例22中将车轮状多孔支架样品通过浸没式循环力学测试仪检测其抗疲劳力学性能过程的示意图；
图16为实施例22中将车轮状多孔支架样品通过浸没式循环力学测试仪检测其抗疲劳力学性能的应力应变闭合曲线结果图；
图17为实施例22中将车轮状多孔支架样品通过浸没式循环力学测试仪检测其抗疲劳力学性能的统计循环次数和应变结束点的关系结果图；
图中：1-圆形梁；2-直线梁。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
在SolidWorks2018软件中建立车轮状多孔支架模型，其立体结构示意图如图1所示，圆形梁1和直线梁2的直径统一为0.2毫米。在一个单元内，圆形梁1与圆形梁1之间的中心距离皆为0.7毫米。架在圆形梁1上面的直线梁2分别朝着圆形梁1的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为5.1毫米、3.7毫米、5.1毫米、3.7毫米和5.1毫米。其中，圆形梁1有8圈，直线＝梁2有16根。圆形梁1和直线梁2两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米，该车轮状多孔支架的俯视图和侧视剖析图分别如图2和3所显示。
实施例2
在SolidWorks2018软件中建立车轮状多孔支架模型，梁的直径统一为0.2毫米。在一个单元内，圆形梁与梁之间的中心距离皆为0.7毫米，架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为5.1毫米、3.7毫米、5.1毫米、3.7毫米和5.1毫米。其中，圆形的梁有8圈，直线型的梁有16根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将3个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为1.2毫米。
实施例3
在SolidWorks2018软件中建立车轮状多孔支架模型，梁的直径统一为0.2毫米。在一个单元内，圆形梁与梁之间的中心距离皆为0.7毫米，架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为5.1毫米、3.7毫米、5.1毫米、3.7毫米和5.1毫米。其中，圆形的梁有8圈，直线型的梁有16根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为30°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米。
实施例4
在SolidWorks2018软件中建立车轮状多孔支架模型，梁的直径统一为0.5毫米。在一个单元内，圆形梁与梁之间的中心距离皆为0.7毫米，架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为5.1毫米、3.7毫米、5.1毫米、3.7毫米和5.1毫米。其中，圆形的梁有8圈，直线型的梁有16根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米。
实施例5
在SolidWorks2018软件中建立车轮状多孔支架模型，梁的直径统一为0.2毫米。在一个单元内，圆形梁与梁之间的中心距离皆为0.8毫米，架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为5.1毫米、3.7毫米、5.1毫米、3.7毫米和5.1毫米。其中，圆形的梁有8圈，直线型的梁有16根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米。
实施例6
在SolidWorks2018软件中建立车轮状多孔支架模型，梁的直径统一为0.2毫米。在一个单元内，圆形梁与梁之间的中心距离皆为0.7毫米，架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为6.0毫米、4.0毫米、6.0毫米、4.0毫米和6.0毫米。其中，圆形的梁有8圈，直线型的梁有16根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米。
实施例7
在3D Studio Max软件中建立车轮状多孔支架模型，梁的直径统一为0.3毫米。在一个单元内，圆形梁与圆形梁之间的中心距离为0.5米，架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、45°和90°，以及相应的长度皆为5毫米。其中，圆形的梁有8圈，直线型的梁有8根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米。
实施例8
在SolidWorks2019软件中建立车轮状多孔支架模型，圆形梁的直径为0.2毫米，而直线梁的直径为0.3毫米。在一个单元内，圆形梁与梁之间的中心距离分别为0.50、0.60、0.70和0.80毫米，架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、30°、60°和90°，以及相应的长度分别为4毫米、4.5毫米、5毫米和5.5毫米。其中，圆形的梁有5圈，直线型的梁有12根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为30°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米。
实施例9
在SolidWorks2016软件中建立车轮状多孔支架模型，圆形梁和直线梁的直径统一为0.5毫米。在一个单元内，圆形梁与圆形梁之间的中心距离皆为1毫米。架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为4毫米、3毫米、4毫米、3毫米和4毫米。其中，圆形的梁有8圈，直线型的梁有16根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将30个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，该模型的直径为12毫米，高度为12毫米。
实施例10
在SolidWorks2016软件中建立车轮状多孔支架模型，圆形梁和直线梁的直径统一为0.2毫米。在一个单元内，圆形梁与圆形梁之间的中心距离皆为0.2毫米。架在圆形梁上面的直线梁分别朝着圆形梁的中心分别旋转0°、22.5°、45°、67.5°和90°，以及相应的长度分别为1毫米、1.5毫米、1毫米、1.5毫米和1毫米。其中，圆形的梁有5圈，直线型的梁有16根。圆形梁和直线梁两层叠加组合成为一个单元，类似车轮状。将10个这样的单元叠加，单元与单元之间错位角度为0°，即可得到车轮状多孔支架模型，结果如图1所显示，该模型的直径为4毫米，高度为4毫米。
实施例11
三维多孔支架的制备
将实施例1中设计好的车轮状多孔支架模型的STL文件导入熔融挤出打印系统转化为系统可识别的x3g格式。采用常见的生物材料聚乳酸线材(Mw～110,000Da，直径为1.75-1.77毫米)作为3D打印的材料，将熔融沉积快速成型打印系统的参数设置为挤出头直径为0.2毫米，熔融温度为230摄氏度，层高为0.2毫米和打印速度为90毫米每秒。3D打印系统通过控制挤出头在X-Y-Z轴上的移动实现层层堆积的方式从而构建得到车轮状多孔支架，示意图如图4所示。得到车轮状多孔支架样品如图5所示，然后通过相机进行整体的拍摄和经过90秒的喷金后采用六硼化镧扫描电镜(20kV)进行支架表面观察研究，结果图如图6所示。
实施例12
三维多孔支架的制备
将实施例2中设计好的车轮状多孔支架模型的STL文件导入熔融挤出打印系统转化为系统可识别的x3g格式。采用常见的生物材料聚乳酸线材(Mw～110,000Da，直径为1.75-1.77毫米)作为3D打印的材料，将熔融沉积快速成型打印系统的参数设置为挤出头直径为0.2毫米，熔融温度为230摄氏度，层高为0.2毫米和打印速度为90毫米每秒。3D打印系统通过控制挤出头在X-Y-Z轴上的移动实现层层堆积的方式从而构建得到车轮状多孔支架。得到由3个单元组成的车轮状多孔支架样品后，通过相机进行整体的拍摄观察，结果如图7所示。
实施例13
三维多孔支架的制备
将实施例3中设计好的车轮状多孔支架模型的STL文件导入3D打印系统转化为系统可识别的z-code文件格式。设置参数为：奇数单元采用生物材料聚乳酸颗粒作为3D打印的材料，将熔融沉积快速成型打印系统的参数设计为挤出头直径为0.2毫米，熔融温度为230摄氏度，层高为0.2毫米和打印速度为90毫米每秒；而偶数单元采用生物材料乳酸-羟基乙酸共聚物作为3D打印的材料，将乳酸-羟基乙酸共聚物充分溶解在二氯甲烷溶液中形成具有一定流动性的粘稠物，然后将低温挤出打印系统的参数设置为挤出头直径为0.2毫米，打印头温度为10摄氏度，层高为0.2毫米和打印速度为100毫米每秒。3D打印系统通过交叉控制熔融挤出头和低温挤出头在X-Y-Z轴上的移动实现聚乳酸和乳酸-羟基乙酸共聚交叉层层堆积的方式从而构建得到车轮状多孔支架。
实施例14
三维多孔支架的制备
将实施例5中设计好的车轮状多孔支架模型的STL文件导入3D打印系统转化为系统可识别的z-code文件格式。采用聚乙烯醇与胶原的复合物作为3D打印的材料。将5克聚乙烯醇加入到10毫升的胶原溶液(0.1摩尔每毫升)中，室温下搅拌溶解均匀后，将混合物转移到3D打印机的料筒中进行备用，然后将低温挤出打印系统的参数设置为挤出头直径为0.5毫米，打印头温度为10摄氏度，层高为0.5毫米，打印速度为90毫米每秒和打印平台设置为4摄氏度。3D打印系统通过控制低温挤出头在X-Y-Z轴上的移动实现层层堆积的方式从而构建得到车轮状聚乙烯醇与胶原多孔复合支架。
实施例15
三维多孔支架的制备
将实施例5中设计好的车轮状多孔支架模型的STL文件导入3D打印系统转化为系统可识别的z-code文件格式。采用聚醚醚酮粉末作为3D打印的材料。将10克聚醚醚酮粉末加入到3D打印机的金属料筒中进行备用，然后将熔融沉积快速成型打印系统的参数设置为挤出头直径为0.5毫米，打印头温度为250摄氏度，层高为0.5毫米，打印速度为90毫米每秒和打印平台设置为室温。先将挤出喷头升温到250摄氏度然后保持温度30分钟充分熔融后再进行打印，3D打印系统通过控制熔融挤出头在X-Y-Z轴上的移动实现层层堆积的方式从而构建得到车轮状聚醚醚酮多孔支架。
实施例16
三维多孔支架的制备
将实施例10中设计好的车轮状多孔支架模型的STL文件导入熔融挤出打印系统转化为系统可识别的x3g格式。采用常见的生物材料聚乳酸线材(Mw～110,000Da，直径为1.75-1.77毫米)作为3D打印的材料，将熔融沉积快速成型打印系统的参数设置为挤出头直径为0.2毫米，熔融温度为230摄氏度，层高为0.2毫米和打印速度为90毫米每秒。3D打印系统通过控制挤出头在X-Y-Z轴上的移动实现层层堆积的方式从而构建得到直径为4毫米以及高度为4毫米的车轮状多孔支架。
实施例17
三维多孔支架的micro-CT观察
将实施例11中制备得到的车轮状多孔支架样品采用高精度微计算机断层扫描成像系统对其整体和内部结构的观察研究。高精度微计算机断层扫描成像系统的设置参数是：分辨率为9微米；X射线的电压为45千伏；X射线的电流为551毫安；滤光片为Al 0.2毫米；扫描角度为360度；旋转角度为0.4度。得到的断层扫描照片采用系统自带的GPUReconServer软件进行三维重构和分析。得到的三维重构样品采用系统自带的CTvox软件进行添加伪彩，结果图如图8所示。
实施例18
三维多孔支架的压缩力学性能测试
将实施例11中制备得到的车轮状多孔支架样品采用电子万能试验机对其压缩力学性能测试研究，测试过程示意图如图9所示。电子万能试验机的设置参数是：在恒温恒湿的条件下，10kN的力学传感器；压缩速度为每分钟8.0毫米；直到位移到达80％时停止测试。电子万能试验机得到的应力应变曲线结果图如图10所示，取其前面线性部分的斜率作为支架样品的压缩模量(E)如图11所示。
实施例19
三维多孔支架的体外细胞实验
将实施例12中制备得到的由3个单元组成的车轮状多孔支架样品经过浓度为75％酒精浸泡24小时消毒杀菌，然后用磷酸盐缓冲液洗涤30分钟，最后用细胞培养基置换30分钟作为备用。从新生7天的SD大鼠骨髓腔里提取新鲜的间充质干细胞，经过培养传代后，将第二代间充质干细胞以每毫升5×107个细胞的密度滴加到已经灭菌好的车轮状组织工程三维多孔支架样品上，示意图如图12a所示，最后将种有间充质干细胞的支架样品放在恒温37摄氏度，二氧化碳浓度为5％以及湿度为95％的培养箱条件下进行培养7天，其中每2天换一次培养液。
7天后，将种有间充质干细胞的支架样品用4％的多聚甲醛固定10分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟；接着浸泡在浓度为0.1％的Triton X-100破膜液中10分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟；接着在室温下浸泡在浓度为1微克每毫升的Phalloidin-TRITC溶液中染细胞骨架约1个小时，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟；接着在室温下浸泡在浓度为5微克每毫升的DAPI溶液中进行染细胞核约10分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5分钟；最后将染色完的支架样品采用激光共聚焦设备进行拍摄，分别采用10倍和20倍的物镜，结果图分别如图12b和12c所示。
实验结果：可以通过荧光染色的照片清晰地观察到，间充质干细胞在车轮状多孔支架的表面有良好的生长状态。总的来说，车轮状多孔支架有良好的细胞相容性。
实施例20
三维多孔支架的体内皮下植入实验
将实施例12中制备得到的由3个单元组成的车轮状多孔支架样品经过浓度为75％酒精浸泡24小时消毒杀菌，然后用磷酸盐缓冲液洗涤30分钟作为备用。实验采用体重为200至300克的SD雌性大鼠作为动物模型。经过一周的饲养适应环境后，向大鼠腹腔内注射浓度为4％的水合氯醛溶液，注射剂量为每千克体重注射10毫升，然后将其安置在手术实验操作台上，采用碘伏消毒拟植入背部部位，然后用手术刀片割一个长度为12-15毫米的切口，然后用钝止血钳轻轻地分离皮肤和皮下粘膜组织，接着将消毒好的支架样品埋植到皮下，最后进行缝合和用碘伏擦拭伤口。术后分别经过一个月和三个月，大鼠被腹腔注射过量的浓度为4％的水合氯醛溶液以致死亡，取出支架进行拍摄和进行后续的组织切片观察，结果图分别如图13和14所示。
实验结果：通过组织切片的观察，车轮状多孔支架样品并没有对皮下组织产生明显的炎症反应，而且在图13中发现，植入一个月后，已经有组织和血管长入支架的内部，而如图14所示，植入三个月后，组织基本长满支架的内部空隙以及组织内布满了大小的血管。说明了车轮状多孔支架有利于周围组织和血管的快速长入，也证实了其具有良好的组织相容性。
实施例21
三维多孔支架的体内膝关节植入实验
将实施例16中制备得到的车轮状多孔支架样品经过浓度为75％酒精浸泡24小时消毒杀菌，然后用磷酸盐缓冲液洗涤30分钟作为备用。实验采用体重为2.9至3.3千克的雌性新西兰大白兔作为动物模型。经过一周的饲养适应环境后，采用戊巴比妥钠溶液麻醉新西兰大白兔，注射剂量为每千克体重注射1毫升，然后将其四肢安置在手术实验操作台上，拟植入的膝关节部位被剃毛后采用碘伏消毒。在双侧膝关节上切开内侧髌旁切口，直到露出股骨髁。采用带有刻度标记的外科钻头在股内侧髁上形成直径4毫米、深度4毫米的骨软骨缺损，用无菌生理盐水冲洗缺损。然后将车轮状多孔支架轻轻压入膝关节内侧髁。植入术后，逐层缝合关节囊、皮肤等手术切口并用碘伏擦拭消毒伤口。所有兔子都被关在有自来水和食物的笼子里，可自由活动。最后，术后肌肉注射庆大霉素3天，每日1次，避免术后感染。术后分别经过一个月和四个月，新西兰大白兔被注射过量的戊巴比妥钠溶液以致死亡，取出膝关节进行micro-CT观察和进行后续的组织生物学测试，从而评估其应用于人体膝关节骨和软骨等需要承载力学负荷的组织部位的效果。
实施例22
三维多孔支架的抗疲劳力学测试实验
将实施例11中制备得到的车轮状多孔支架样品经过经过浸泡式循环力学测试仪测试其抗疲劳性能。实验采用PBS缓冲溶液作为浸泡液，将样品放在仪器托盘的中央，然后升温至37摄氏度模拟人体内部环境，设置循环负载的力为18N-180N，加载频率为1Hz，循环次数为10000次，测试示意图为图15所示。测试结束后，分别取1，10,100,1000,10000次循环下的应力应变闭合曲线进行观察分析，结果如图16所示。统计循环次数和应变结束点的关系可以得到样品的疲劳起始点，结果图如图17所示。
实验结果：通过对样品进行10000次的循环力学加载后，观察应力应变闭合曲线闭合曲线，发现车轮状多孔支架样品具有一定的抗疲劳能力；通过统计循环次数和应变结束点的关系，得到车轮状多孔支架样品的疲劳起始点大概在2500次循环力学加载的时候出现，说明了车轮状多孔支架样品具有良好的抗疲劳性能。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种车轮状多孔支架，是由生物材料制得的三维多孔结构，其特征在于，包括多个层叠设置的车轮状单元，所述车轮状单元包括设于同一平面的若干个不同大小的圆形梁，沿所述圆形梁的径向呈辐射状设有多条不同长度的直线梁，所述圆形梁和直线梁从外向内延伸至近圆心处；
在一个车轮状单元中，由多个不同直径的圆形梁以同一个圆心在同一个平面上构成了一层圆环状的支架，然后多条不同长度的直线梁架在圆环层上始终指向圆心，按照不同角度旋转构成第二层辐射线条状的支架，得到的两层支架合并成一个类似车轮状的单元；
所述多孔支架用于人体骨和软骨需要承载力学负荷的组织部位。
2.根据权利要求1所述的一种车轮状多孔支架，其特征在于，所述圆形梁等间距同心设置，两两相邻直线梁之间的夹角相等。
3.根据权利要求2所述的一种车轮状多孔支架，其特征在于，相邻圆形梁之间的间距为100 μm - 5 cm。
4.根据权利要求1所述的一种车轮状多孔支架，其特征在于，所述直线梁的长度为100μm - 2 cm。
5.根据权利要求1所述的一种车轮状多孔支架，其特征在于，所述圆形梁与直线梁的截面为圆形，直径为10 μm - 1 cm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种车轮状多孔支架，其特征在于，所述生物材料选自聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙烯醇、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚羟基脂肪酸酯、羟基乙酸淀粉钠、羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物、聚己二酸、聚对二氧环己酮、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙二醇酯-1,4-环己烷二甲醇酯、尼龙11、聚氨酯、明胶、琼脂、胶原、海藻酸钠、纤维蛋白、聚氨基葡萄糖、羟基磷灰石、磷酸三钙、珍珠质、生物玻璃、不锈钢粉、纯钛粉、钛合金粉、铝合金粉、镍基合金粉、铜基合金粉或钴铬合金粉中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的一种车轮状多孔支架的制备方法，其特征在于，采用3D打印制得。
8.根据权利要求7所述的一种车轮状多孔支架的制备方法，其特征在于，所述3D打印包括熔融沉积快速成型、低温挤出、激光烧结、数字光处理、电子束熔化成型、分层实体制造、粉末粘结或光固化成型中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的一种车轮状多孔支架的制备方法，其特征在于，所述多孔支架通过三维设计软件设计得到，包括SolidWorks、3D Studio Max、CINEMA 4D、Maya、Rhinocero、Google Sketchup、CATIA、UnigraphicsNX、AutoCAD、Pro/Engineer、Cimatron、LightWave 3D、Poser、FormZ或Blender的一种或多种。
10.如权利要求1所述的一种车轮状多孔支架的应用，其特征在于，所述多孔支架用于人体内组织的替换、修复和再生。
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