CN105056302A - 一种生物性复合人工气管的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明结合3D打印技术提供了一种生物性人工气管及其制备方法,本发明所用材料具有同时具备柔韧性和一定机械强度,满足气管作为胸腔内空腔脏器的物理机械性能;其次,本发明的人工气管结构多孔疏松,有利于养份的扩散和自体血管的长入;另外,本发明将由受体自己的气道上皮细胞和软骨细胞扩增得到的种子细胞打印在气管壁内,避免了患者对于细胞的排异反应;而且,种子细胞由终末分化的成熟细胞组成,避免了使用干细胞所带来的诱导分化难题和成瘤风险;同时,本发明中的细胞的空间分布在打印中精确可控,按照组织学规律分布加速了修复过程;最后,气管支架可在体内降解,减少了异物残留体内所带来的并发症,避免了二次手术取出的风险。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械领域,尤其涉及一种生物性复合人工气管的制备方法及其应用。
背景技术
气管的恶性肿瘤、良性占位性病变或者气管狭窄、外伤,行长段气管切除(成人大于全长的50%,儿童大于30%)后,切缘不能直接进行吻合,需要气管替代物的植入,才可进行吻合,恢复气管的呼吸通气功能。而据Neville等提出理想的气管替代材料需要具备以下几种特质:(1)封密的管腔结构;(2)质地柔韧;(3)良好的生物相容性;(4)低炎性反应;(5)低免疫性;(6)有助于生长气管上皮细胞的管内壁。随着科研人员在气管重建上的研究的深入,气管重建替代物的选择越来越多,逐渐成熟。因此同种异体气管移植和组织工程气管一直以来是气管外科的研究热点。
同种异体气管移植包含了气管粘膜上皮和气管软骨的移植。研究表明,气管粘膜上皮细胞具有较高MHCI和MHCII抗原,气管粘膜细胞外基质的完整可以促进移植段气管的再血管化和再细胞化,所以在去除气管上皮细胞抗原性的同时,最大限度的保留细胞外基质的完整性,有望在降低气管免疫原性的同时,增加气管移植的成功概率。同种异体原位气管移植所面临的最大难题之一是免疫排斥所致的移植物失功,其中上皮细胞是免疫攻击的靶目标和重要环节。提高受体上皮的覆盖率和实现再上皮化作为减低上皮组织诱发的免疫排斥反应的技术手段,成为近年来研究的热点。国内外应用鼠气管原位和异位移植模型的多项实验表明,一旦异体移植气管能够完成再上皮化,具有受体表型的上皮组织,该段气管组织便将能够维持管腔的持久通畅,受体便能得到长久存活。
理想的气管支架应该最大限度地降低移植气管的免疫原性,并且尽可能的保留细胞外基质。组织工程气管正好满足了这些基本条件,并可以不受供体缺乏的影响,是目前该领域研究的热点,可能是解决长段气管损伤后气管外科重建的有效方法。组织工程是在体外构建具有生命力的活体植入体内。从而达到修复缺损、重建功能、提高生活质量之目的。Vacanti等应用生物相容性好并有生物降解性能的聚合物作为支架材料,结合细胞分离和组织培养技术成功地在裸鼠皮下再中了新的透明软骨。在此基础上,Vacanti等将从新生牛肩关节分离出来的软骨细胞种植于2.5cm×40cm大小的Polyglylacticacid(PGA)无纺支架网上,包裹在硅胶管周围植入裸鼠体内,4周后大体和组织学观察有新生软骨形成。
然而,现有的静电纺织技术和同轴收集方法中仍存在有待改进提高的空间。比如:如何加快制作周期,现在完整制作一段组织工程气管需要1~2周左右的时间,随着管径的增大,这种制作周期还将进一步加大。制作产品容易受到环境、人为因素的影响,不同批次的产品存在一定的技术差异。这些问题都将是下一阶段工作的重点。
最近的十年,增材制造技术,也就是人们熟悉的“三维打印技术”的快速发展,为生物医学界带来新的启迪。它是一种个性化制备复杂支架和组织工程植入物的多功能快速成型技术。而生物打印在传统三维打印的基础上,进一步实现了对于细胞空间分布的精确定位。可是,由于目前设备发展的限制以及气管结构和功能的特殊性,目前尚无成熟实用的气管生物打印方案存在。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出了一种空间分布合理、支架材料配方优化、内部结构设计完善的适用于临床的安全可靠的生物性复合人工气管。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案为:
一种生物性复合人工气管的制备方法,包括以下步骤:
步骤一,利用支气管镜,无菌刷取支气管上皮细胞,体外培养扩增;提取耳廓软骨细胞,消化、分散,体外培养扩增;
步骤二,将胶原和透明质酸与去离子水混合,经滤菌器过滤除菌,得到软材料;将壳聚糖经乙醇熏蒸后,于紫外灯下照射彻底灭菌,均匀分散于灭菌培养液中;
步骤三,将所述步骤二中所得的软材料和培养液以1:1的体积比相混合,制成重悬细胞的软材料混合物;
步骤四,将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇溶于二氯甲烷中,超声搅拌使分散均匀后,置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发,制得硬材料混合物;
步骤五,分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心,弃去上清后,重悬于所述步骤三的软材料混合物中,分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料;
步骤六,将所述步骤五中的支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料分别置于两只低温墨仓内,安装直径为0.2毫米的打印针头,加载于3D打印机上备用;将所述步骤四中的硬材料混合物置于高温墨仓内,安装直径为0.1毫米的打印机针头,加载于3D打印机上备用;
步骤七,使用建模软件构建三维立体圆筒状结构:首先构建一圈轮辐状结构,作为水平稳固支架,指定打印材料为所述硬材料混合物;然后构建4个同心圆结构,重叠于所述轮辐状结构之上,四圆由内向外依次指定材料为:硬材料混合物、支气管上皮细胞生物复合材料、软骨细胞生物复合材料和硬材料混合物;将全部模型结构复制并累加,得到完整人工气管模型;
步骤八,将结构模型导入打印机并进行3D打印,得到生物性复合人工气管。
为了进一步优化上述技术方案,本发明所采取的技术措施还包括:
上述步骤八具体步骤包括:
步骤1,将结构模型导入打印机驱动程序,分层解析;
步骤2,将一片无菌载玻片置于打印机作业平台上,校准定位打印机针头;
步骤3,设置打印机运行参数:硬材料混合物加热温度为180-220℃,内部结构间隙为0.01-0.25毫米,墨仓内驱动气压为0.2-0.4Bar,针头运行速度为5-10毫米/秒;支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料保持室温,内部结构间隙为0.01-0.1毫米,墨仓内驱动气压为0.1-0.3Bar,针头运行速度为10毫米/秒;
步骤4,启动打印流程,按照设置的运行参数打印;
步骤5,全部生物性复合人工气管打印完成后,用超声雾化机将5-10%三聚磷酸钠水溶液均匀喷于生物性复合人工气管上,使之充分交联;
步骤6,封闭制作完成的生物性复合人工气管两端,将其浸没于培养液中,检查气密性并保存。
上述步骤二为将5-10%胶原和3-7%透明质酸按照质体积比与去离子水混合,经滤菌器过滤除菌,得到软材料;将壳聚糖经乙醇熏蒸后,于紫外灯下照射24小时彻底灭菌,以5-10%质量体积比分散于灭菌培养液中。
上述步骤四为将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中,超声搅拌使分散均匀后,置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发,制得硬材料混合物。
上述步骤五为分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心,弃去上清后,按照1×106个/毫升的细胞浓度重悬于所述步骤三的软材料混合物中,分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料。
上述步骤七中构建的轮辐高度为1毫米,间距为15°,内径为30毫米,外径为37毫米。
上述步骤七中构建的4个同心圆结构高均为1毫米,宽均为0.5毫米;四个同心圆圆心重合,半径等差0.5毫米,最小圆直径与轮辐结构内径相同,最大圆直径与轮辐结构外径相同。
本发明还提供一种根据上述方法所制备的生物性复合人工气管。
本发明还提供一种根据上述方法所制备的生物性复合人工气管的相关应用。
本发明采用上述技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:
本发明采用生物相容性好的生物材料配方用于打印人工气管,并能直接在临床应用,避免了对于供体气管的依赖;其次,本发明所用材料具有同时具备柔韧性和一定机械强度,满足气管作为胸腔内空腔脏器的物理机械性能;再次,本发明的人工气管结构多孔疏松,有利于养份的扩散和自体血管的长入;另外,本发明将由受体自己的气道上皮细胞和软骨细胞扩增得到的种子细胞打印在气管壁内,避免了患者对于细胞的排异反应;而且,种子细胞由终末分化的成熟细胞组成,避免了使用干细胞所带来的诱导分化难题和成瘤风险;同时,本发明中的细胞的空间分布在打印中精确可控,按照组织学规律分布(上皮朝向管腔,软骨朝向纵膈)加速了修复过程;最后,气管支架可在体内降解,减少了异物残留体内所带来的并发症,避免了二次手术取出的风险。
附图说明
图1为本发明构建的轮辐状结构的俯视图;
图2为本发明构建的轮辐状结构的立体图;
图3为一个轮辐状结构叠加一个同心圆结构的示意图;
图4为同心圆结构的材料分层示意图;
图5为打印完毕时完整的生物性复合人工气管的结构示意图;
具体实施方式
本发明提供了一种生物性复合人工气管的制备方法,包括以下步骤:
步骤一,利用支气管镜,无菌刷取支气管上皮细胞,体外培养扩增;提取耳廓软骨细胞,消化、分散,体外培养扩增;
步骤二,将胶原和透明质酸与去离子水混合,经滤菌器过滤除菌,得到软材料;将壳聚糖经乙醇熏蒸后,于紫外灯下照射彻底灭菌,均匀分散于灭菌培养液中;
步骤三,将所述步骤二中所得的软材料和培养液以1:1的体积比相混合,制成重悬细胞的软材料混合物;
步骤四,将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇溶于二氯甲烷中,超声搅拌使分散均匀后,置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发,制得硬材料混合物;
步骤五,分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心,弃去上清后,重悬于所述步骤三的软材料混合物中,分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料;
步骤六,将所述步骤五中的支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料分别置于两只低温墨仓内,安装直径为0.2毫米的打印针头,加载于3D打印机上备用;将所述步骤四中的硬材料混合物置于高温墨仓内,安装直径为0.1毫米的打印机针头,加载于3D打印机上备用;
步骤七,使用建模软件构建三维立体圆筒状结构:首先构建一圈轮辐状结构,作为水平稳固支架,指定打印材料为所述硬材料混合物;然后构建4个同心圆结构,重叠于所述轮辐状结构之上,四圆由内向外依次指定材料为:硬材料混合物、支气管上皮细胞生物复合材料、软骨细胞生物复合材料和硬材料混合物;将全部模型结构复制并累加,得到完整人工气管模型;
步骤八,将结构模型导入打印机并进行3D打印,得到生物性复合人工气管。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍,以使更好的理解本发明,但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一
利用支气管镜,无菌移植受体刷取支气管上皮细胞,体外培养扩增;手术提取耳廓软骨,消化分散,体外培养扩增。
将10%胶原和5%透明质酸按照质体积比与去离子水混合,经滤菌器过滤除菌,得到软材料。将壳聚糖经乙醇熏蒸后,于紫外灯下照射24小时彻底灭菌,以8%质量体积比分散于培养液中。
将上述两种溶液1:1混合,制成用于重悬细胞的软材料混合物。
体外扩增的两种细胞分别消化、重悬、计数后离心,弃去上清液,按照100万/毫升的细胞浓度重悬于前述软材料混合物中,制成含细胞的软材料混合物(支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料)。
将含细胞的软材料混合物分别置于两只低温墨仓内,安装直径为0.2毫米的打印针头,加载于打印机上备用。
将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇按照19:1溶于二氯甲烷中,超声搅拌使分散均匀后,置于通风处内使二氯甲烷自然挥发,得到硬材料混合物。
将硬材料混合物剪碎置于高温墨仓内,安装直径为0.1毫米的打印机针头,加载于打印机上备用。
使用建模软件构建三维立体圆筒状结构:
首先构建一圈轮辐状结构(图1),作为水平向稳固支架。轮辐高度为1毫米,间距为15°,内径30毫米,外径37毫米,指定打印材料为硬材料。
构建4个同心圆结构(图2),重叠于轮辐状结构之上(图3)。圆高均为1毫米,宽均为0.5毫米。四圆圆心重合,半径等差0.5毫米,最小圆直径与轮辐结构内径相同,最大圆直径与轮辐结构外径相同。四圆由内向外依次指定材料如下:硬材料、含上皮细胞软材料、含软骨细胞软材料、硬材料(图4)。
将上述全部模型结构复制并累加,得到完整人工气管模型(图5)。
将模型导入打印机驱动程序,分层解析。
将一片无菌载玻片置于打印机作业平台上,校准定位打印针头。
设置打印机运行参数:硬材料混合物加热温度为185℃,内部结构间隙为0.01毫米,墨仓内驱动气压为0.3Bar,针头运行速度为7毫米/秒;软材料(支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料)温度为室温,内部结构间隙为0.1毫米,墨仓内驱动气压为0.1Bar,针头运行速度为10毫米/秒。
启动打印流程,按照上述参数打印。
全部支架打印完成后,用超声雾化机将8%三聚磷酸钠水溶液均匀喷于人工气管上。经过20分钟,使之充分交联。
封闭制作完成的人工气管两端,将其浸没于培养液中,检查气密性良好。
本发明一种生物性复合人工气管的制备方法所制备的人工气管,采用生物相容性好的生物材料配方用于打印人工气管,并能直接在临床应用,避免了对于供体气管的依赖;其次,本发明所用材料具有同时具备柔韧性和一定机械强度,满足气管作为胸腔内空腔脏器的物理机械性能;再次,本发明的人工气管结构多孔疏松,有利于养份的扩散和自体血管的长入;另外,本发明将由受体自己的气道上皮细胞和软骨细胞扩增得到的种子细胞打印在气管壁内,避免了患者对于细胞的排异反应;而且,种子细胞由终末分化的成熟细胞组成,避免了使用干细胞所带来的诱导分化难题和成瘤风险;同时,本发明中的细胞的空间分布在打印中精确可控,按照组织学规律分布(上皮朝向管腔,软骨朝向纵膈)加速了修复过程;最后,气管支架可在体内降解,减少了异物残留体内所带来的并发症,避免了二次手术取出的风险。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种生物性复合人工气管的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤一,利用支气管镜,无菌刷取支气管上皮细胞,体外培养扩增;提取耳廓软骨细胞,消化、分散,体外培养扩增;
步骤二,将胶原和透明质酸与去离子水混合,经滤菌器过滤除菌,得到软材料;将壳聚糖经乙醇熏蒸后,于紫外灯下照射彻底灭菌,均匀分散于灭菌培养液中;
步骤三,将所述步骤二中所得的软材料和培养液以1:1的体积比相混合,制成重悬细胞的软材料混合物;
步骤四,将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇溶于二氯甲烷中,超声搅拌使分散均匀后,置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发,制得硬材料混合物;
步骤五,分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心,弃去上清后,重悬于所述步骤三的软材料混合物中,分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料;
步骤六,将所述步骤五中的支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料分别置于两只低温墨仓内,安装直径为0.2毫米的打印针头,加载于3D打印机上备用;将所述步骤四中的硬材料混合物置于高温墨仓内,安装直径为0.1毫米的打印机针头,加载于3D打印机上备用;
步骤七,使用建模软件构建三维立体圆筒状结构:首先构建一圈轮辐状结构,作为水平稳固支架,指定打印材料为所述硬材料混合物;然后构建4个同心圆结构,重叠于所述轮辐状结构之上,四圆由内向外依次指定材料为:硬材料混合物、支气管上皮细胞生物复合材料、软骨细胞生物复合材料和硬材料混合物;将全部模型结构复制并累加,得到完整人工气管模型;
步骤八,将结构模型导入打印机并进行3D打印,得到生物性复合人工气管。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤八具体包括:
步骤1,将结构模型导入打印机驱动程序,分层解析;
步骤2,将一片无菌载玻片置于打印机作业平台上,校准定位打印机针头;
步骤3,设置打印机运行参数:硬材料混合物加热温度为180-220℃,内部结构间隙为0.01-0.25毫米,墨仓内驱动气压为0.2-0.4Bar,针头运行速度为5-10毫米/秒;支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料保持室温,内部结构间隙为0.01-0.1毫米,墨仓内驱动气压为0.1-0.3Bar,针头运行速度为10毫米/秒;
步骤4,启动打印流程,按照设置的运行参数打印;
步骤5,全部生物性复合人工气管打印完成后,用超声雾化机将5-10%三聚磷酸钠水溶液均匀喷于生物性复合人工气管上,使之充分交联;
步骤6,封闭制作完成的生物性复合人工气管两端,将其浸没于培养液中,检查气密性并保存。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤二为将5-10%胶原和3-7%透明质酸按照质体积比与去离子水混合,经滤菌器过滤除菌,得到软材料;将壳聚糖经乙醇熏蒸后,于紫外灯下照射24小时彻底灭菌,以5-10%质量体积比分散于灭菌培养液中。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤四为将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与聚乙二醇按照19:1的比例溶于二氯甲烷中,超声搅拌使分散均匀后,置于通风橱内使二氯甲烷自然挥发,制得硬材料混合物。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤五为分别将所述步骤一中扩增培养的支气管上皮细胞和软骨细胞消化、重悬、计数并离心,弃去上清后,按照1×106个/毫升的细胞浓度重悬于所述步骤三的软材料混合物中,分别制得支气管上皮细胞生物复合材料和软骨细胞生物复合材料。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤七中构建的轮辐高度为1毫米,间距为15°,内径为30毫米,外径为37毫米。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤七中构建的4个同心圆结构高均为1毫米,宽均为0.5毫米;四个同心圆圆心重合,半径等差0.5毫米,最小圆直径与轮辐结构内径相同,最大圆直径与轮辐结构外径相同。
8.一种根据权利要求1-7任意一项方法所制备的生物性复合人工气管。
9.一种根据权利要求1-7任意一项方法所制备的生物性复合人工气管的应用。
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