CN109481734A - 一种生物性高仿生人工气管的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种生物性高仿生人工气管的制备方法，先提取外耳廓软骨细胞，消化、分散，体外培养扩增；利用3D打印技术制备环状浇注模具；将天然胶原溶解于去离子水中，将此胶原溶液注入浇注模具中浇注成环状胶原支架；将胶原支架冷冻干燥，然后将胶原支架置入EDC溶液中进行初步交联，将交联后的支架再冷冻和干燥，完成支架的制备；将制备好的支架取出，进行环氧消毒获得最终的胶原环状支架；将P2期的软骨细胞接种到消毒后的环状胶原支架上，形成细胞‑胶原环状支架复合物，体外培养形成软骨环；选用医用硅胶管作为支撑物，将体外培养的软骨环与单纯的的胶原环交替套于医用硅胶管上，得到完整的高仿生再生气管。本发明赋予单一软骨环更好的力学强度。

Description

一种生物性高仿生人工气管的制备方法
技术领域
本发明涉及医疗器械领域，涉及一种仿生器官，具体来说是一种生物性高仿生人工气管的制备方法。
背景技术
目前为止，由肿瘤、创伤等所引起的长段气管缺损的治疗在临床上仍属于一大难题。长段气管缺损往往需要植入气管替代物。理想的气管替代物应具有以下优点：（1）良好的生物相容性；（2）软骨环与纤维结缔组织相交替的仿生结构；（3）适宜的力学强度；（4）有利于血管化。现有的气管替代物主要包括同种异体气管和组织工程气管。
同种异体气管由于其供体有限，难以应用到长段气管缺损患者。此外，同种异体气管由于其免疫原性的存在，易引起宿主的免疫排斥反应，导致气管植入物的失败。组织工程的发展为气管移植指明了方向。组织工程气管是应用具有良好生物相容性的材料为支架，结合组织培养技术，体外培养出具有特定形状和良好力学性能的气管再生物。虽然组织工程气管解决了异体免疫、供体来源的问题，但如何构建出具有精准仿生天然气管的结构功能一直是组织工程气管的难题之一。
天然气管结构是一个由软骨环与纤维结缔组织交替连接而成中空管状结构，该结构不但能够维持气管中空结构以发挥通气功能，还能够保证颈部正常的伸缩及侧向弯曲功能，并且对气管软骨及内腔的上皮结构提供了丰富的血供。目前学者们应用组织工程技术构建的气管几乎均为一体化长段软骨管（一整块的完整的软骨组织）。虽然可以通过3D打印技术精准控制其长度与内径大小，然而这只能算是初级的气管仿生，比如CN201510468731.3号专利中所描述的气管支架构建就是一体化构建整段气管支架，进而体外软骨培养。大块管状软骨体外构建存在构建难度高，管壁软骨厚度难以控制，力学强度不足等缺点。就算经过极其精细的程序构建出了足够力学强度的均质软骨管，其仍然不具备天然气管所特有的软骨环与纤维结缔组织相交替的结构，必然会影响颈部气管正常的伸缩及弯曲功能，并且不利于气管软骨及内腔上皮的血液供应，其最终的结果是导致长段气管修复失败。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物性高仿生人工气管的制备方法，所述的这种生物性高仿生人工气管的制备方法要解决现有技术中的一体化长段气管构建难度高，影响颈部气管正常的伸缩及弯曲功能，并且不利于气管软骨及内腔上皮的血液供应，其最终导致长段气管修复失败的技术问题。
本发明提供了一种生物性高仿生人工气管的制备方法，包括如下步骤：
1)提取兔外耳廓软骨细胞，消化、分散，体外培养扩增；
2)利用3D打印技术，参照天然气管软骨环规格，制备环状浇注模具；
3)将天然胶原充分溶解于去离子水中，使天然胶原的质量百分比浓度为1%，将此胶原溶液注入上述浇注模具中浇注成环状胶原支架；
4)将上述的环状胶原支架放入-60~-100℃的冰箱中冷冻1-3小时，再放入真空冷冻干燥箱中干燥36~72小时，然后将环状胶原支架置入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液中进行交联，将交联后的支架放入-60~-100℃的冰箱中冷冻1-3小时，再放入真空冷冻干燥箱中干燥36~72小时，完成环状胶原支架的制备；
5)将制备好的环状胶原支架取出，进行环氧消毒，获得环状胶原支架；
6)使用步骤1）P2期的软骨细胞，按100万个细胞/ml的浓度，接种到消毒后的环状胶原支架上，形成细胞-环状胶原支架复合物，体外培养8周形成软骨环；
7)选用与步骤5）的环状胶原支架内径相匹配的医用硅胶管作为支撑物，将体外培养8周的软骨环与单纯的步骤5）的环状胶原支架，交替套于医用硅胶管上，得到完整的高仿生再生气管。
具体的，所述的软骨环与环状胶原支架之间没有间隙。
本发明还提供了采用上述的方法制备的一种生物性高仿生人工气管，包括一个支撑物，所述的支撑物由医用硅胶管构成，所述的支撑物的外周套设有两个以上数目的软骨环和两个以上数目的环状胶原支架，所述的软骨环和环状胶原支架沿支撑物的延伸方向交替排列在支撑物的外周，任意一个软骨环与其相邻的环状胶原支架之间的间隙均为零。
本发明的生物性高仿生人工气管相比已有技术具有更好的力学强度。
本发明采用天然胶原为原料制备成环状支架，一部分通过接种软骨细胞且体外培养形成软骨环，然后与另一部分不接种细胞的胶原环状支架交替套叠在硅胶管内支撑上，模拟天然气管软骨环与纤维结缔组织相交替的结构，最终构建的组织工程气管在结构与功能上对天然气管做到了精确仿生。
本发明利用天然胶原作为原料制备环状胶原支架：支架内、外径可控，支架厚度可控；在平面水平上将软骨细胞接种到支架材料；大约8周时间材料降解，行成单纯软骨环；然后将体外培养8周的软骨环与单纯环状胶原支架环，交替套于硅胶管，确保各环之间没有间隙，得到完整高仿生气管。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明通过组织工程方法构建的软骨环，不存在免疫排斥放应（天然胶原被认为是无免疫原性的生物材料）；赋予单一软骨环更好的力学强度，从而提升整段气管力学强度，达到长期维持管状中空结构的目的。目前很多组织工程气管多采用有一定力学强度的支架来维持其官腔结构，专利号CN201510468731.3所述气管支架的构建方式。本发明采用天然结缔组织链接软骨环，赋予整段软骨具有拉伸性以及弯曲性，解决了临床实际需求；将复杂的长段气管构建简化为简单的单个软骨环构建，不仅可以简化构建组织工程气管的难度，而且有利于对气管结构的精准控制及有效缩短构建长段气管时间。未来应用到体内，随着胶原环状支架的降解，血管结缔组织将随之长入，最终有利于组织工程气管软骨环及内腔上皮的血供。
附图说明
图1是本发明一种生物性高仿生人工气管的制备方法的工艺流程图。
图2是细胞-环状胶原支架复合物体外构建的效果图。
图3是体外构建软骨环的大体观及组织学结构。
图4是体外构建软骨环的力学性能检测。
图5为本发明的一种生物性高仿生人工气管的结构示意图。
具体实施方式
实施例1
如图1所示，本发明提供了一种生物性高仿生人工气管的制备方法，包括如下步骤：
1)取4周龄新西兰大耳白兔，2%戊巴比妥钠静脉麻醉后于无菌条件下切取单侧耳廓，眼科剪游离软骨层，将软骨层剪切成碎片后加入胶原酶消化液消化6小时，而后取其消化上清液离心（1800rpm，8min，37℃）、重悬软骨细胞，以1.0*104/cm2（约0.8~1*106个/培养皿）的浓度接种至10cm培养皿，置于37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，常规方法培养扩增至第二代；
2)利用3D打印技术，参照天然气管软骨环规格，制备环状浇注模具（内径1.6cm,外径2.0cm）；
3)将天然胶原充分溶解于去离子水中，使得天然胶原的质量百分比浓度为1%，将此胶原溶液注入上述的浇注模具中浇注成环状胶原支架；
4)将上述的环状胶原支架放入-60~-100℃冰箱冷冻1-3小时，再放入真空冷冻干燥箱中干燥36~72小时，然后将环状胶原支架置入EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）溶液(0.5g/100ml)中进行交联，将交联后的支架放入-60~-100℃冰箱冷冻1-3小时，再放入真空冷冻干燥箱中干燥36~72小时，完成环状胶原支架的制备；
5)将制备好的支架取出，进行环氧消毒获得环状胶原支架3；
6)使用步骤1）P2期的软骨细胞，按100万个细胞/ml的浓度，接种100微升到消毒后的环状胶原支架上，形成细胞-环状胶原支架复合物，体外培养8周形成软骨环2；
7)选用与5）的环状胶原支架内径相匹配的医用硅胶管作为支撑物，将体外培养8周的软骨环2与单纯的步骤5）的环状胶原支架3，交替套于医用硅胶管1上，确保各环之间没有间隙，得到完整高仿生气管（如图5所示）。
图2显示了细胞-环状胶原支架复合物体外构建的效果图；其中，A1，环状胶原支架大体观；A2，环状胶原支架电镜；B1，环状胶原支架接种软骨细胞后12小时大体观；B2，环状胶原支架接种软骨细胞后12小时对应电镜；C1，体外培养2周后大体观；C2，体外培养2周后电镜。可以看到细胞接种到环状胶原支架中后，细胞可以在支架中粘附，增殖，并且分泌软骨基质。
图3显示了构建成功的软骨环的大体观和组织学结构。A，体外培养4周后软骨环大体观；C1-C3，体外培养4周软骨环侧面HE,翻红O和II型胶原染色；D1-D3，体外培养4周软骨环环状切面HE,翻红O和II型胶原染色;B，体外培养8周后软骨环大体；E1-E3，体外培养8周软骨环侧面HE,翻红O和II型胶原染色；F1-F3，体外培养8周软骨环环状切面HE,翻红O和II型胶原染色；可以看到当体外培养到8周的时间，支架基本降解，并且已经形成了软骨结构，具有典型的软骨陷窝及丰富的软骨基质成分（蛋白多糖和二型胶原）。
图4显示了体外构建软骨环的力学性能测试结果；其中，A，软骨环厚度;B，软骨环宽度；C，软骨环重量；D，软骨环DNA含量；E，软骨环GAG（糖胺多糖）含量；F，软骨环总胶原含量；G，软骨环杨氏模量；H，软骨环压缩最大力；I，软骨环拉断最大力。该图显示出体外构建8周后的软骨环基本上具备与天然气管软骨环相似的生理结构和力学性能。
具体的，A,B图是通过游标卡尺量出软骨环的厚度和宽度；C图是用称量天平称出软骨环的重量；D是用的DNA检测试剂盒检测出单位重量的标本中所含的DNA含量；E图是用GAG检测试剂盒按照DMMB法检测单位重量的标本中所含的GAG含量；F图是用总胶原检测试剂盒检测单位重量的标本中所含的总胶原含量；G是用力学测试仪按示意图所示方向压缩软骨环，然后得到力与位移曲线，再计算出相应的杨氏模量；H是按示意图所示方向压缩软骨环（圆环直径方向），直到软骨环压缩到最大所需的最大力；I是按示意图所示方向拉伸软骨环（圆环直径方向），直到软骨环拉断所需的最大力。

Claims (3)

1.一种生物性高仿生人工气管的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
提取兔外耳廓软骨细胞，消化、分散，体外培养扩增；
利用3D打印技术，参照天然气管软骨环规格，制备环状浇注模具；
将天然胶原充分溶解于去离子水中，使天然胶原的质量百分比浓度为1%，将此胶原溶液注入上述浇注模具中浇注成环状胶原支架；
将上述的环状胶原支架放入-60~-100℃的冰箱中冷冻1-3小时，再放入真空冷冻干燥箱中干燥36~72小时，然后将环状胶原支架置入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液中进行交联，将交联后的支架放入-60~-100℃的冰箱中冷冻1-3小时，再放入真空冷冻干燥箱中干燥36~72小时，完成环状胶原支架的制备；
将制备好的环状胶原支架取出，进行环氧消毒，获得环状胶原支架；
使用步骤1）P2期的软骨细胞，按100万个细胞/ml的浓度，接种到消毒后的环状胶原支架上，形成细胞-环状胶原支架复合物，体外培养8周形成软骨环；
选用与步骤5）的环状胶原支架内径相匹配的医用硅胶管作为支撑物，将体外培养8周的软骨环与单纯的步骤5）的环状胶原支架，交替套于医用硅胶管上，得到完整的高仿生再生气管。
2.根据权利要求1所述的一种生物性高仿生人工气管的制备方法，其特征在于：所述的软骨环与环状胶原支架之间没有间隙。
3.采用权利要求1所述的方法制备的一种生物性高仿生人工气管，其特征在于；包括一个支撑物，所述的支撑物由医用硅胶管构成，所述的支撑物的外周套设有两个以上数目的软骨环和两个以上数目的环状胶原支架，所述的软骨环和环状胶原支架沿支撑物的延伸方向交替排列在支撑物的外周，任意一个软骨环与其相邻的环状胶原支架之间的间隙均为零。
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