CN105233342B - 一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法，将脱细胞处理的沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合比例为2.0：0.25～2.0：2.0，再次加入乙基二甲基胺丙基碳化二甲胺充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；将交联后的支架先后置于低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。本发明所制备的软骨支架具有仿生及多孔隙特点，可在体外诱导干细胞向软骨细胞分化，促进软骨基质成分蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达，可用于体外构建组织工程化关节软骨，为修复关节软骨缺损提供高品质支架材料。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法。
背景技术
外伤、感染等各种原因引起的关节软骨缺损临床上十分常见，由于关节软骨无血液供应、神经支配和淋巴循环，自身修复能力较差。一旦软骨损伤的面积较大(>2.0cm)基本不能自行修复，甚至可以加速关节软骨退变，导致关节功能障碍影响患者生活质量。目前的治疗方法虽然有很多的方式方法，比如，微骨折法、软骨镶嵌成形术、软骨下骨钻孔等，但是远期效果却不理想，难以修复为透明关节软骨。
自从“组织工程”概念的提出以后，软骨缺损的患者有了新希望。理想的组织工程需具备以下三个要素：种子细胞、生长因子和支架材料。支架材料为细胞的生长提供最初的支持，将生长因子和细胞联系起来，后期随着细胞的生长和细胞不断的分泌自身的基质的情况下支架材料被逐渐降解，转而被分泌的正常的细胞基质所替代。组织工程软骨成功的关键就在于寻找到一种理想的软骨基质支架。
软骨支架材料有很多种，关于软骨支架的制备方式、方法亦有很多种。其中，天然材料的优势是生物相容性好、易降解、降解产物易吸收且毒副作用小，其缺点是结构与性能存在差异，来自生物体存在疾病传播的可能，大批量制备困难。人工合成支架材料种类较多，因具有物理机械性能好、降解可控、来源不受限制等优点而被广泛关注，主要材料包括聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚氧化乙烯、PLA-PGA复合物(PLGA)、聚环氧乙烯、聚己内酯等。但人工合成的高分子生物材料有一定的致癌作用；存在免疫原性，易发生炎症、排斥反应；亲水性差；生物相容性欠佳；降解后的代谢产物有一定的腐蚀性，可能导致细胞死亡。
依据仿生学原理，要想获得最好的修复软骨结果，就要选用与软骨基质成分尽量相似的软骨组织工程支架。人脐带Wharton's jelly中富含透明质酸、糖胺多糖及胶原等，与天然软骨细胞外基质类似，是一种潜在的软骨支架天然材料。在化学成分上人脐带Wharton's jelly虽然与软骨细胞外基质类似，但其毕竟不能直接作为软骨细胞外基质应用，需要改变人脐带Wharton's jelly的一般物理特性，如密度、吸水率、降解率，将其改造成适合软骨细胞生长代谢需要的软骨支架。目前，吴鸿等已经应用人脐带Wharton's jelly构建出组织工程支架，改变了人脐带Wharton's jelly的物理结构，但未按照软骨细胞外基质成分特点进行复合配比改造。为此，我们在对单纯人脐带Wharton's jelly基础上进行物理性能以及成分复合改造，制备符合软骨基质特点的仿生多孔组织工程支架材料，使支架适应软骨细胞生物学要求，以提高构建组织工程软骨的质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法，旨在能够构建一种良好的仿生的天然软骨组织工程支架，使干细胞能够更好的向软骨细胞分化。
本发明是这样实现的，一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法，所述软骨组织工程支架的制备方法将脱细胞处理的沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素的质量比例为2.0：0.25～2.0：2.0，再次加入EDAC充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；将交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。进而制备出一种天然的软骨组织工程仿生支架。
进一步，所述沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合之前需要分离制备人脐带沃顿胶，低温干燥后计量；向沃顿胶中加适量的无菌三蒸水，于-5℃反复粉碎成Wharton胶匀浆；再次加入无菌三蒸水低渗混匀，将低渗Wharton胶匀浆再放入液氮中冷冻15min，取出37℃水浴快速复温解冻，重复3次，使细胞膜破碎，之后向悬液中加入2.5g/L胰酶，37℃反复震荡消化30min，离心后获取脱细胞完全的沃顿胶悬液；
进一步，沃顿胶悬液与硫酸软骨素的质量比例为2.0：0.25～2.0：2.0；
进一步，所述软骨组织工程支架的制备方法具体包括以下步骤：
步骤一，分离制备人脐带沃顿胶，并计量，低温保存后，粉碎成悬液；
步骤二，经反复低渗冻融及酶消化制备脱细胞的沃顿胶悬液；
步骤三，将脱细胞处理的沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素的质量比例为2.0：0.25～2.0：2.0，再次加入EDAC充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；
步骤四，将以上交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。
进一步，本发明所制备的组织工程软骨支架为仿生及多孔材料，检测其物理性能，孔隙率93.2％，密度89.0μg/mm3，吸水率1159％，降解率20.6％。
本发明提供的软骨组织工程支架的制备方法，在实验中发现干细胞与仿生多孔软骨支架复合培养后，其在蛋白多糖表达、II型胶原免疫荧光染色及PCR检测II型胶原mRNA表达方面均显著优于单纯Wharton胶物理结构改造的支架(图2)。本发明制备的仿生多孔组织工程软骨支架能更好的诱导干细胞转化为软骨细胞，提高体外构建组织工程软骨质量，从而为建立软骨组织工程库乃至软骨缺损的修复提供了高品质的支架材料。
目前，卢世璧、吴鸿等学者已经应用人脐带Wharton胶构建出组织工程支架，发明注重人脐带Wharton胶的物理结构与形态改造，未按照软骨细胞外基质成分特点进行成分复合配比，本发明的新型仿生复合支架在Wharton胶成分基础上增加了软骨基质重要成分即硫酸软骨素，恰当成分复合比例配比，更符合干细胞向软骨细胞分化的微环境要求，使用本发明方法制造的仿生多孔支架比单纯的Wharton胶支架，其体外构建组织工程关节软骨质量(大体观察、组织染色、蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达等)明显提高，显示修复关节软骨损伤良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明提供的软骨组织工程支架制备方法流程图。
图2是不同支架与干细胞复合诱导分化后，软骨细胞表达Ⅱ型胶原表达免疫荧光染色情况。
图2中：2A：单纯Wharton胶改造支架复合干细胞培养诱导分化软骨细胞Ⅱ型胶原表达免疫荧光呈弱阳性。2B：仿生多孔组织工程软骨支架复合干细胞培养诱导分化软骨细胞Ⅱ型胶原表达免疫荧光呈强阳性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例，仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例的软骨组织工程支架含有脱细胞处理的人脐带沃顿胶与硫酸软骨素，沃顿胶悬液与硫酸软骨素的质量比例为2.0：0.25～2.0：2.0；
如图1所示，本发明实施例的一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法包括以下步骤：
S101：分离制备人脐带沃顿胶，并计量，低温保存后，粉碎成悬液；
S102：经反复低渗冻融及酶消化制备脱细胞的沃顿胶悬液；
S103：将脱细胞处理的沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合不同比例后，再次加入EDAC充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；
S104：将以上交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。
下面结合本发明的具体实施例对本发明的应用原理做进一步的说明：
实施例1：
步骤一，分离制备人脐带沃顿胶，并计量，低温保存后，粉碎成悬液；
步骤二，经反复低渗冻融及酶消化制备脱细胞的沃顿胶悬液；
步骤三，将脱细胞处理的沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液：硫酸软骨素＝2：0.25，再次加入EDAC充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；
步骤四，将以上交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。
实施例2：
步骤一，分离制备人脐带沃顿胶，并计量，低温保存后，粉碎成悬液；
步骤二，经反复低渗冻融及酶消化制备脱细胞的沃顿胶悬液；
步骤三，将脱细胞处理的沃顿胶悬液与不同比例硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素的质量比例为2.0：0.75；再次加入EDAC充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；
步骤四，将以上交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。
实施例3：
步骤一，分离制备人脐带沃顿胶，并计量，低温保存后，粉碎成悬液；
步骤二，经反复低渗冻融及酶消化制备脱细胞的沃顿胶悬液；
步骤三，将脱细胞处理的沃顿胶悬液与不同比例硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素的质量比例为2.0：1.0；再次加入EDAC充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；
步骤四，将以上交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。
实施例4：
步骤一，分离制备人脐带沃顿胶，并计量，低温保存后，粉碎成悬液；
步骤二，经反复低渗冻融及酶消化制备脱细胞的沃顿胶悬液；
步骤三，将脱细胞处理的沃顿胶悬液与不同比例硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素的质量比例为2.0：1.5；再次加入EDAC充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；
步骤四，将以上交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法，其特征在于，所述仿生多孔组织工程软骨支架制备方法：将脱细胞处理的沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合，沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合的质量比例为2.0：0.25～2.0：2.0，再次加入1％乙基二甲基胺丙基碳化二甲胺(EDAC)充分混匀后，室温下置于距光源5～10cm处在258nm波长紫外光照射下交联；将交联后的支架先后置于-20℃冰箱、-80℃低温冰箱使支架定型，真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥，获得成型支架，密封袋内贮存密封，60℃辐照消毒，4℃保存备用；
所述沃顿胶悬液与硫酸软骨素混合之前需要从人脐带中分离制备人脐带沃顿胶，并低温干燥后计量，向沃顿胶中加适量无菌三蒸水，于-5℃反复粉碎成Wharton胶匀浆；再次加入无菌三蒸水低渗混匀，将低渗Wharton胶匀浆再放入液氮中冷冻15min，取出37℃水浴快速复温解冻，重复3次，使细胞膜破碎，之后向悬液中加入2.5g/L胰酶，37℃反复震荡消化30min，离心后获取脱细胞完全的沃顿胶悬液。
2.如权利要求1所述的一种仿生多孔组织工程软骨支架制备方法，其特征在于，其支架的物理性能参数达到：孔隙率93.2％，密度89.0μg/mm3，吸水率1159％，降解率20.6％。
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