CN101327338B - 多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及制备方法。取猪、兔、狗或牛的膀胱，经消化液，低渗缓冲液、含表面活性剂的高渗缓冲液、含核酸酶的缓冲液和去离子水等处理后，再经冷冻、冻干和灭菌后得到无菌的膀胱无细胞基质。所述的膀胱无细胞基质不含细胞、无尿路上皮层、无粘膜下层、无血管系统，具有良好的生物相容性，具有合适的超微结构特征，保留有生物活性因子，包括细胞黏附因子、生长因子和趋化因子，是一种理想的组织工程膀胱的支架材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料及其制备方法，具体的来说，是涉及一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及制备方法。
背景技术
膀胱的先天畸形、感染、外伤、肿瘤等病变均可导致膀胱结构破坏和功能障碍而需行膀胱替代手术。胃肠道是目前用于膀胱替代的主要替代物。然而，由于胃肠道处在泌尿系的环境中，可能会引起代谢紊乱，感染，结石形成甚至恶变等一系列并发症。因此，探寻合理的膀胱替代物是摆在我们面前的一项挑战，而组织工程技术无疑为我们提供了有力的工具。
组织工程膀胱的基本原理就是将体外培养的膀胱种子细胞，接种到支架材料上，形成细胞-支架材料的复合体，再将其用于膀胱替代。缺乏理想的支架材料仍然是目前组织工程膀胱的研究和应用的一个难题。以往的研究证实，人工合成的多聚物(如聚乙醇酸、聚乳酸等)支架材料由于机械力学、生物相容性、结构和功能等原因而未能得到满意的结果。猪小肠粘膜下层由于其厚度太薄，可能并不适合进行膀胱全层的构建；而且有研究证实，在猪小肠粘膜下层接种尿路上皮细胞24小时后即出现细胞死亡，这是由于猪小肠粘膜下层有核酸物质的残留，免疫组化分析表明还有猪小肠样结构出现。
膀胱无细胞基质(BAM)是将膀胱进行脱细胞处理后得到的支架材料，具有良好的生物相容性。动物实验证明，利用BAM进行膀胱替代后，观察到尿路上皮细胞再生良好，BAM替代区的尿路上皮细胞和膀胱本身的尿路上皮几乎一样；但是，膀胱平滑肌细胞再生欠佳，在BAM替代的中心区，平滑肌细胞较稀少，排列杂乱不规则(Brown等，Biomaterials2002；23(10)：2179-2190.Cayan等，J Urol 2002；168(2)：798-804.Obara等，Urology2006；68(4)：892-897.Urakami等，World J Urol 2007；25(2)：207-213.Probst等，BJU Int2000；85(3)：362-371.Piechota等，J Urol 1998；159(5)：1717-1724.Sutherland等，JUrol 1996；156(2 Pt 2)：571-577.Redd等，J Urol 2000；164(3 Pt 2)：936-941.Kajbafzadeh等，J Surg Res 200715；139(2)：189-202.Cartwright等J Biomed Mater ResA2006；77(2)：390-395)。在英国约克大学研究人员Bolland和Ingham等人的研究(Bolland等，Biomaterials 2007；28(6)：1061-1070)和所申请的膀胱无细胞基质制备的专利中(专 利号GB2433745)，他们发明了采用物理扩张猪膀胱的方法来促进脱细胞的效率，在他们所制备的BAM中，细胞成分被完全去除，所制备的BAM具备有良好的机械力学性能。但是，利用他们所制备的BAM进行细胞接种实验，结果表明：接种猪膀胱平滑肌细胞后，培养7天，未观察到细胞侵入BAM，培养14天也仅观察到少量的细胞侵入到BAM中，培养21天也未观察到平滑肌细胞在BAM中均匀分布。
组织工程膀胱的支架材料应具备合适的超微结构特征：合适的孔径、较高的高孔隙率和孔与孔之间互相交通(Hollister，Nat Mater 2005；4(7)：518-524)。只有具备合适的超微结构特征，大量的膀胱种子细胞才能快速的黏附到支架材料上，快速向材料中心区长入，并均匀地分布在支架材料中。现有的BAM制备技术对其超微结构的影响还不明确，在Bolland和Ingham等人的研究，BAM接种猪膀胱平滑肌细胞之后，细胞未能快速侵入，也不能均匀地分布在BAM中，这可能是因为他们所制备的BAM不具备合适的超微结构特征，不能满足组织工程膀胱支架材料的要求。因此，制备BAM时，使其具有多孔的超微结构特征，才能作为组织工程膀胱的支架材料。
目前，在所有的BAM的制备方案中，研究者们均着眼于脱细胞的效率，而忽视了脱细胞过程中所使用的曲拉通X-100，脱氧胆酸纳以及十二烷基硫酸钠等对细胞外基质中生物活性因子的影响。近来，研究发现，膀胱细胞外基质本身含有大量的内源性的生物活性因子，包括VEGF，bFGF，PDGF-BB，TGFβ1，KGF，EGF，BMP4等(Chun等，Biomaterials2007；28(29)：4251-4256)。在以往的研究中，用这些所制备的BAM进行膀胱替代后，膀胱平滑肌细胞再生欠佳，在BAM替代的中心区，平滑肌细胞较稀少，排列杂乱不规则，可能是因为在制备BAM时，破坏了这些内源性的生物活性因子。因此，在制备BAM的时，如果既能彻底地去除细胞成分，又能有效的保留BAM本身所含有的内源性的生物活性因子，那么，所制成的保留有生物活性因子的BAM将是更理想的组织工程膀胱的支架材料。
另外，组织工程膀胱植入体内后，需要快速血管化，建立血液循环，以进行营养物质供应和气体交换(Jain等，Nat Biotechnol 2005；23(7)：821-823)。目前研究证实，支架材料的超微结构在血管化方面发挥重要作用；孔径大，高孔隙率和孔与孔之间交通较好的支架材料，血管化就会迅速且充分(Druecke等，J Biomed Mater Res A 2004；68(1)：10-18)。膀胱细胞外基质本身所含有的生物活性因子如VEGF，bFGF，PDGF-BB等，均是能促进血管新生的生长因子。因此，利用多孔的并保留有内源性生物活性因子的BAM作为支架材料构建组织工程膀胱，植入体内后，有望促进其充分快速血管化，建立血液循环。
综上所述，本领域迫切需要提供一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质，作为组织工程膀胱的支架材料。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及制备方法，使得制备的膀胱无细胞基质具有合适的超微结构特征，同时又较好地保留了膀胱细胞外基质中的生物活性因子，为组织工程膀胱研究和应用提供一种理想的支架材料。
本发明的目的通过以下的技术方案实施
一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质，其特征在于：
a)所述的膀胱无细胞基质不含细胞、无尿路上皮层、无粘膜下层、无血管系统；
b)上述的膀胱无细胞基质具有良好的生物相容性；
c)上述的膀胱无细胞基质中保留有生物活性因子，包括促进细胞黏附的黏附因子、促进细胞增殖的生长因子和促进细胞迁移的趋化因子；
d)上述的膀胱无细胞基质的超微结构特征：孔径大小60-250μm，孔隙率80-90％。
上述的膀胱无细胞基质，其特征在于所述的膀胱无细胞基质的质厚度为0.5-3.0mm。
上述的膀胱无细胞基质，其特征在于所述的膀胱无细胞基质来自下列动物的膀胱：猪、兔、狗或牛。
上述多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质的制备方法，其特征在于制备步骤如下：
a)将动物的正常膀胱和部分尿道置于缓冲液中，迅速带到实验室后仔细去除外表面的脂肪和浆膜组织，经尿道插入输液皮条导管并将其用丝线固定在尿道上，然后经此输液皮条导管用缓冲液冲洗膀胱，将膀胱腔内的尿液冲洗干净；
b)经输液皮条导管向膀胱腔内灌入消化液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此消化液中，室温中振荡消化，然后倒出此消化液；
c)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
d)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入低渗缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此低渗缓冲液中，静置过夜，然后倒出此低渗缓冲液；
e)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
f)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入含表面活性剂的高渗缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含表面活性剂的高渗缓冲液中，室温中振荡洗涤，然后倒出此含表面活性剂的高渗缓冲液；
g)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
h)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入含核酸酶的缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含核酸酶的缓冲液中，室温中振荡洗涤，然后倒出此含核酸酶的缓冲液，得到膀胱无细胞基质；
i)将上述的膀胱无细胞基质用缓冲液冲洗；
j)将上述的膀胱无细胞基质用去离子水冲洗；
k)将上述的膀胱无细胞基质置于深低温冰箱中冷冻，再在冷冻干燥机中冻干，得到冻干的膀胱无细胞基质；
l)将上述的冻干的膀胱无细胞基质进行灭菌，得到无菌的膀胱无细胞基质；
m)将上述的无菌的膀胱无细胞基质低温密封保存，备用。
上述的制备方法，其特征在于在步骤a，c，e，g和i中所述的缓冲液为4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗次数为3次。
上述的制备方法，其特征在于在步骤b中所述的消化液为含0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四钠的消化液，PH为7.2-7.4；灌入膀胱内的消化液的体积为30ml-500ml溶液，室温中振荡消化时间为0.5-4小时。
上述的制备方法，其特征在于在步骤d中所述的低渗缓冲液为10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含5mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶；向膀胱腔内灌入的低渗缓冲液体积为60-1200ml，静置过夜的温度为4℃。
上述的制备方法，其特征在于在步骤f中所述的含表面活性剂的高渗缓冲液，其中的表面活性剂是曲拉通X-100，浓度为0.5-1.5％；其中的高渗缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含0.5M氯化钠，10mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶；向膀胱腔内灌入的含表面活性剂的高渗缓冲液体积为60-1200ml，室温中振荡洗涤时间为12-48小时。
上述的制备方法，其特征在于在步骤h中所述的含核酸酶的缓冲液，其中的核酸酶为I型脱氧核糖核酸酶和A型核糖核酸酶，二者浓度分别为25-100U/ml和1-2U/ml；缓冲液为10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 7.6，内含2mM氯化镁，2mM氯化钙和150mM氯化钠；向膀胱腔内灌入的含核酸酶的缓冲液的体积为60-1200ml，室温中振荡洗涤时间为12-36小时。
上述的制备方法，其特征在于在步骤j中所述的去离子水为4℃预冷的无菌去离子水，冲洗次数为3次。
上述的制备方法，其特征在于在步骤k中所述的膀胱细胞无细胞基质置于深低温冰箱中的冷冻温度为-20℃至-70℃，冷冻时间为2-6小时；冷冻干燥机中冻干的时间为24-96小时。
上述的制备方法，其特征在于在步骤l中所述的膀胱无细胞基质灭菌的方法为环氧乙烷灭菌。
上述的制备方法，其特征在于在步骤m中所述的低温保存的温度为-20℃至4℃。将上述所制备的膀胱无细胞基质进行如下分析：
1.组织学检测，观察其有无细胞成分残留；
2.扫描电镜分析，观察其超微结构特征；
3.种子细胞培养，培养人膀胱平滑肌细胞(HBSMC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，进行直接接触细胞毒性实验，分析BAM的生物相容性；
4.细胞黏附实验和细胞接种实验，观察大量的种子细胞(HBSMC和HUVEC)是否能快速黏附到BAM上，是否能快速侵入BAM并均匀地分布在BAM之中，从而分析BAM是否具有合适的超微结构特征。
5.将BAM匀浆后，吸取上清液，用该上清液包被培养板，观察其对细胞黏附的效果，分析BAM是否保留有促进细胞黏附的黏附因子；
6.制备BAM条件培养基，观察BAM条件培养基对细胞生长、增殖、迁移和刮伤愈合的效果，分析BAM是否保留有促进细胞增殖的生长因子和促进细胞迁移的趋化因子；
有益效果
本发明提供了一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及其制备方法。
本发明将猪、兔、狗或牛的膀胱，联合使用物理、化学和酶消化等脱细胞技术，所制备的膀胱无细胞基质不含细胞，无尿路上皮层、无粘膜下层、无血管系统，具有良好的生物相容性。同时，本发明所用的膀胱为来自大动物猪、兔、狗或牛的膀胱，能为制备动物的膀胱无细胞基质并在人体的应用奠定基础。另外，本发明所用的动物膀胱取材方便，来源丰富，技术操作简单，制备成本低廉。
与现有的BAM相比，本发明所制备的BAM具有三维多孔的超微结构特征，即孔径大小60-250μm，孔隙率80-90％，厚度0.8-3.0mm范围。细胞黏附和细胞接种实验表明，接种细胞后，大量细胞快速地黏附到BAM中，然后快速地向内部侵入并均匀地分布在BAM中；HBSMC在部分区域还形成细胞团块，HUVEC还形成管状样结构。因此，本发明所制备的BAM具有合适的超微结构特征，能够满足组织工程膀胱的支架材料的要求。
本发明也建立了一种新的评价无细胞基质是否保留有生物活性因子的方法。将无菌的BAM匀浆处理后，其匀浆上清液包被培养板能明显地促进HBSMC和HUVEC的黏附，这表明本发明所制备的BAM保留有促进细胞黏附的黏附因子。另外，制备BAM的条件培养基，该条件培养基含有能促进HBSMC和HUVEC生长、增殖、迁移和刮伤愈合的生长因子和趋化因子，这些生物活性因子是由BAM释放到培养基中的。因此，本发明所制备的BAM还保留有促进细胞增殖的生长因子和促进细胞迁移的趋化因子。
综上所述，本发明所制备的膀胱无细胞基质不含细胞、无尿路上皮层、无粘膜下层、无血管系统，具有良好的生物相容性，具有合适的超微结构特征，保留有生物活性因子，是一种理想的组织工程膀胱的支架材料。
本发明所制备的膀胱无细胞基质可接种尿路上皮细胞和平滑肌细胞，用于构建组织工程膀胱壁；可再联合接种内皮细胞或者内皮细胞的前体细胞，将组织工程膀胱在体外进行预血管化；可接种多潜能的干细胞，如骨髓间充质干细胞，脂肪干细胞和胚胎干细胞，使其诱导分化为膀胱组织。另外，本发明所制备的膀胱无细胞基质，还可以作为输尿管、膀胱和尿道的替代材料，并可以用于异种动物；并可复合外源性的重组生物活性因子，如重组人或鼠VEGF，bFGF，PDGF-BB，EGF等等，以促进组织再生和血管新生。
本发明所制备的一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质，可经紫外线照射，戊二醛、京尼平交联处理，以延长体内降解时间；可经乙酸、I型胶原酶等处理进一步增大孔径，提高孔隙率。
具体实施方式
实施例1猪膀胱无细胞基质的制备，制备步骤如下：
a)将体重为20公斤的猪的膀胱和部分尿道置于4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4中，迅速带到实验室后仔细去除外表面的脂肪和浆膜组织，经尿道插入输液皮条导管并将其用丝线固定在尿道上，然后经此输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4冲洗膀胱3次，将膀胱腔内的尿液冲洗干净；
b)经输液皮条导管向膀胱腔内灌入100ml含0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四钠的消化液，PH为7.2-7.4，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此消化液中，室温中振荡消化2小时，然后倒出此消化液；
c)再经输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次，然后倒出此缓冲液；
d)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入300ml的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含5mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此低渗缓冲液中，4℃静置过夜，然后倒出此低渗缓冲液；
e)再经输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次，然后倒出此缓冲液；
f)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入300ml的含1.0％曲拉通X-100的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含0.5M氯化钠，10mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶；夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含曲拉通X-100的高渗缓冲液中，室温中振荡洗涤24小时，然后倒出此含曲拉通X-100的高渗缓冲液；
g)再经输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次，然后倒出此缓冲液；
h)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入300ml的含50U/ml I型脱氧核糖核酸酶和1U/mlA型核糖核酸酶的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 7.6，内含2mM氯化镁，2mM氯化钙和150mM氯化钠，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含核酸酶的缓冲液中，室温中振荡洗涤24小时，然后倒出此含核酸酶的缓冲液，得到猪膀胱无细胞基质；
i)将上述的猪膀胱无细胞基质用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次；
j)将上述的猪膀胱无细胞基质用4℃预冷的无菌去离子水冲洗3次；
k)将上述的猪膀胱无细胞基质置于-70℃的深低温冰箱中冷冻3小时，再在冷冻干燥机中冻干48小时，得到冻干的猪膀胱无细胞基质；
l)将上述的冻干的猪膀胱无细胞基质进行环氧乙烷灭菌，得到无菌的猪膀胱无细胞基质；
m)将上述的无菌的猪膀胱无细胞基质4℃密封保存，备用。
取上述步骤i中的猪膀胱无细胞基质经10％中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋并进行切片(5μm)。进行HE染色观察有无细胞核残留和细胞外基质的情况；同时进行免疫组织化学染色观察有无细胞成分(平滑肌肌动蛋白，结蛋白和波形蛋白)的残留和细胞外基质中I型胶原的保留情况。结果表明，在HE染色中，猪膀胱无细胞基质无细胞核，呈疏松多孔样，无尿路上皮层、无粘膜下层、无血管系统。免疫组化染色表明猪膀胱无细胞基质的平滑肌肌动蛋白、结蛋白和波形蛋白染色均阴性，I型胶原蛋白染色阳性。
取步骤l中的无菌的猪膀胱无细胞基质进行内腔面和纵切面的超微结构观察，将所获得图像用Image Pro Plus软件进行测量分析其孔径大小，孔隙率(孔的面积/图像总面积)，全层厚度。结果表明，冻干的猪膀胱无细胞基质具有多孔的超微结构特征：孔径大小100-180μm，孔隙率85％，孔与孔之间互相沟通，厚度1.8mm；猪膀胱无细胞基质的内腔面呈多孔样，无尿路上皮，无完整的粘膜下层。
实施例2兔膀胱无细胞基质的制备，制备步骤如下：
a)将体重为4公斤的新西兰白兔的膀胱和部分尿道置于4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4中，迅速带到实验室后仔细去除外表面的脂肪和浆膜组织，经尿道插入输液皮条导管并其用丝线固定在尿道上，然后经此输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4冲洗膀胱3次，将膀胱腔内的尿液冲洗干净；
b)经输液皮条导管向膀胱腔内灌入40ml含0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四钠的消化液，PH为7.2-7.4，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此消化液中，室温中振荡消化0.5小时，然后倒出此消化液；
c)再经输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次，然后倒出此缓冲液；
d)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入80ml的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含5mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此低渗缓冲液中，4℃静置过夜，然后倒出此低渗缓冲液；
e)再经输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次，然后倒出此缓冲液；
f)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入80ml的含1.0％曲拉通X-100的50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含0.5M氯化钠，10mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶；夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含曲拉通X-100的高渗缓冲液中，室温中振荡洗涤12小时，然后倒出此含曲拉通X-100的高渗缓冲液；
g)再经输液皮条导管用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次，然后倒出此缓冲液；
h)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入80ml的含25U/ml I型脱氧核糖核酸酶和1U/ml A型核糖核酸酶的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 7.6，内含2mM氯化镁，2mM氯化钙和150mM氯化钠，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含核酸酶的缓冲液中，室温中振荡洗涤12小时，然后倒出此含核酸酶的缓冲液，得到兔膀胱无细胞基质；
i)将上述的兔膀胱无细胞基质用4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗3次；
j)将上述的兔膀胱无细胞基质用4℃预冷的无菌去离子水冲洗3次；
k)将上述的兔膀胱无细胞基质置于-70℃的深低温冰箱中冷冻2小时，再在冷冻干燥机中冻干24小时，得到冻干的兔膀胱无细胞基质；
l)将上述的冻干的兔膀胱无细胞基质进行环氧乙烷灭菌，得到无菌的兔膀胱无细胞 基质；
m)将上述的无菌的兔膀胱无细胞基质4℃密封保存，备用。
取上述步骤i中的兔膀胱无细胞基质经10％中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋并进行切片(5μm)。进行HE染色观察有无细胞核残留和细胞外基质的情况；同时进行免疫组织化学染色观察有无细胞成分(平滑肌肌动蛋白，结蛋白和波形蛋白)的残留和细胞外基质中I型胶原的保留情况。结果表明，在HE染色中，兔膀胱无细胞基质不含细胞，呈疏松多孔样，无尿路上皮层、无粘膜下层、无血管系统。免疫组化染色表明兔膀胱无细胞基质的平滑肌肌动蛋白、结蛋白和波形蛋白染色均阴性，I型胶原蛋白染色阳性。
取步骤1中的无菌的兔膀胱无细胞基质进行内腔面和纵切面的超微结构观察，将所获得图像用Image Pro Plus软件进行测量分析其孔径大小，孔隙率(孔的面积/图像总面积)，全层厚度。结果表明，冻干的兔膀胱无细胞基质具有多孔的超微结构特征：孔径大小60-120μm，孔隙率88％，孔与孔之间互相沟通，厚度0.6mm；兔膀胱无细胞基质的内腔面无尿路上皮，无完整的粘膜下层。
实施例3.种子细胞的分离、培养和鉴定
3.1HBSMC的分离、培养和鉴定
一小块无明显肿瘤生长的膀胱组织，用机械分离法将尿路上皮层完整去除，采用浓度为0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四钠和0.1％I型胶原酶序贯消化，将所得的细胞悬液接种于含10％FBS的DMEM/F-12全培养基进行原代培养和传代培养。倒置显微镜进行形态学观察，并用细胞爬片免疫染色观察平滑肌肌动蛋白，结蛋白的表达。
倒置显微镜下观察，体外培养的人膀胱平滑肌细胞呈长梭形，融合后呈典型的“峰谷”样形态；平滑肌肌动蛋白和结蛋白染色均阳性，阳性率大于98％。本发明选用第2-5代的HBSMC.
3.2HUVEC的分离、培养和鉴定
一段长约20cm的脐带，用生理盐水将脐静脉冲洗3次，然后在脐静脉中灌入0.1％I型胶原酶溶液消化10分钟，将消化下来的细胞收集重悬于含生长因子MV BulletKit、10％FBS的EGM-2全培养基，接种到培养瓶中进行原代培养和传代培养。利用倒置显微镜进行形态学观察；利用流式细胞技术观察CD146和CD105的表达情况。
倒置显微镜下观察，体外培养的HUVEC呈椭圆形；流式细胞分析，其表达CD146和CD105，双阳性率达100％。本发明中均使用2-5代的HUVEC。
实施例4.猪BAM的生物相容性的检测
选用第4代的HBSC和HUVEC，采用直接接触细胞毒性实验，将这两种细胞分别用于猪BAM的生物相容性检测。用1ml全培养基分别重悬4×104个HBSMC或5×104个HUVEC并接种到有0.1％明胶预包被的24孔板，培养过夜。将8mm×mm大小的猪BAM轻轻地放到含有细胞地孔中作为实验孔。同时设立对阴性对照和空白对照：只有细胞而无猪BAM的孔作为对照孔；只有培养基而没有细胞，含或不含猪BAM的孔作为空白对照。此后每日更换一半地培养基，培养48或96小时后，每孔加入80μl的CCK-8试剂，HBSC继续培养3小时，HUVEC继续培养4小时。然后将变成黄色的培养基转移到96孔板(150μl/孔)，并用酶标仪读取450nm的OD值(620nm作为参考波长)。实验孔和对照孔的OD值分别减去对应的空白孔的OD值，用Independent Samples Student’s t-test分析实验孔和对照孔是否有统计学差异(p＜0.05即认为有统计学差异)。
直接接触细胞毒性实验表明，猪BAM中无细胞毒性物质残留：在培养48-96小时后，猪BAM组和对照组的细胞活性无明显差异(p＞0.05)。
上述结果表明，猪BAM具有良好的生物相容性。
实施例5.验证猪BAM是否具有合适的超微结构特征
5.1.细胞黏附实验
首先将冻干的且无菌的1.5×1.5cm2大小的猪BAM放到ultra-low attachment 24-wellplates孔中，使其能改完整地覆盖孔底，无猪BAM的tissue culture treated 24-wellplates作为对照培养板，每组4个复孔；实验孔和对照孔分别加入1ml细胞密度为5×105/ml的细胞悬液；分别于培养1小时和3小时，收集培养基，计数培养基中未黏附到猪BAM或者tissue culture treated plates孔底的细胞数，从而计算出黏附细胞数，然后计算出黏附细胞所占的百分数，数据用单因素方差分析进行统计学分析，组间比较采用LSD检验进行统计处理(p＜0.05即认为有统计学差异)。
本细胞黏附实验旨在观察猪BAM是否具有合适的超微结构特征以支持大量细胞的快速黏附。细胞黏附实验的结果发现，接种HBSMC后培养1小时，有71.5±3.4％的细胞黏附到猪BAM，明显高于对照组的27.5±2.5％(p＜0.05)；培养3小时，黏附细胞达到83±2.6％，明显高于对照组的34.3±3.3％，(p＜0.05)。接种HUVEC后培养1小时，有73.5±5.5％的细胞黏附到猪BAM，明显高于对照组的34±5.2％(p＜0.05)；培养3小时，黏附细胞达到89±2.6％，明显高于对照组的41±2.6％(p＜0.05)。
5.2.细胞接种实验
首先将冻干且无菌的0.5×0.5cm2大小的猪BAM放到ultra-low attachment 24-wellplates孔中；分别调整HBSMC密度为1×107/ml或HUVEC密度为5×106/ml，分别取100μl细胞悬液加入到不同的猪BAM之上，使其慢慢水化，只加入培养基而没有细胞的猪BAM作为对照孔；培养1小时，使细胞黏附；然后将有细胞或无细胞的猪BAM转移到25-cm2的培养瓶中，加入10ml培养基，并将培养瓶保持直立，继续培养，此后每日更换培养基；分别于培养1天和培养3天后，取出猪BAM，包埋于OCT中，在冰冻切片机内切片(5μm)，进行HE染色，观察细胞侵入猪BAM和在猪BAM中的空间分布情况。
细胞接种实验旨在观察猪BAM是否具有合适的超微结构特征以支持种子细胞快速侵入并均匀分布在BAM中。结果表明，猪BAM接种HBSMC后培养1天，HBSMC开始向猪BAM中心侵入；培养3天后，HBSMC均匀地分布在猪BAM中，部分区域还形成细胞团块。猪BAM接种HUVEC之后1天，HUVEC也快速地向猪BAM中心区侵入；培养3天后，观察到HUVEC较均匀的分布在猪BAM中，还形成管状养结构。
细胞黏附和细胞接种实验表明，接种细胞后，大量细胞快速地黏附到膀胱无细胞基质中，然后快速地向内部侵入并均匀地分布在膀胱无细胞基质中。因此，本发明所制备的BAM具有合适的超微结构特征，能够满足组织工程膀胱的支架材料的要求。
实施例6.验证猪BAM是否保留有生物活性因子
6.1BAM匀浆，取上清液
取一块2cm×2cm的无菌的猪BAM放玻璃组织匀浆器中，加入2ml 4℃预冷的无菌的10mM PBS(PH7.2-7.4)中，4℃研磨匀浆30分钟；然后将匀浆液移至离心管中，4℃、12000转/分离心10分钟；吸取上清液，将上清液4℃保存备用。
6.2观察猪BAM匀浆上清液包被培养板后对细胞黏附的效果
取6.1中所制备的猪BAM匀浆上清液，包被培养板作为实验组，用PBS代替上清液包被培养板作为对照组；然后在猪BAM匀浆上清液包被组和对照组中分别接种HBSMC和HUVEC，分别培养0.5，1和3小时后，将黏附细胞消化下来，计数黏附细胞数，计算出黏附细胞所占初始细胞总数的百分率，数据用单因素方差分析进行统计学分析，组间比较采用LSD检验进行统计处理(p＜0.05即认为有统计学差异)。
本黏附实验旨在验证猪BAM中是否保留有促进细胞黏附的黏附因子。实验结果表明，用猪BAM匀浆上清液包被培养板后，能明显的促进HBSMC和HUVEC的黏附，细胞黏附快于对照组。这表明，本发明所制备的猪BAM保留有促进细胞黏附的黏附因子。
6.3制备BAM条件基础培养基、BAM条件全培养基，对照基础培养基、对照全培养基
首先分别配制20ml的含0.5％胎牛血清、0.5％牛血清白蛋白的DMEM/F-12基础培养基和20ml的含0.5％胎牛血清的EBM-2基础培养基；20ml的含10％胎牛血清的DMEM/F-12全培养基和20ml的含生长因子MV BulletKit、10％胎牛血清的EGM-2全培养基；分另将上述四种培养基均分为两份，即每份10ml；分别于10ml DMEM/F-12基础培养基、10ml EBM-2基础培养基、10ml DMEM/F-12全培养基和10ml EGM-2全培养基中各浸入一块5cm×5cm大小的无菌的BAM；浸入BAM和未浸入BAM的培养基同时置于4℃孵育7天，孵育期间每日手摇人工振荡2次，每次持续0.5分钟；最后得到BAM条件基础培养基、BAM条件全培养基，对照基础培养基、对照全培养基，备用。
6.4观察种子细胞在BAM条件培养基中的生长速率、增殖、迁移活性和促进刮伤愈合的潜能
分别绘制HBSMC和HUVEC在BAM条件全培养基和对照全培养基中的生长曲线，比较HBSMC和HUVEC的生长速率；进行细胞增殖实验和迁移实验，比较HBSMC和HUVEC在BAM条件基础培养基和对照基础培养基中的增殖、迁移活性；通过刮伤愈合实验，比较BAM条件基础培养基和对照基础培养基促进HBSMC和HUVEC刮伤愈合的潜能(用Independent SamplesStudent’s t-test进行统计学分析，p＜0.05即认为有统计学差异)。
本实验旨在验证BAM是否能释放促进HBSMC和HUVEC生长、增殖、迁移和刮伤愈合的生物活性因子至培养基中。实验结果表明：与对照全培养基相比，HBSMC和HUVEC在BAM条件全培养基中的生长速率更快；HBSMC和HUVEC在BAM条件基础培养基中的增殖活性和迁移活性明显高于对照基础培养基(p＜0.05)。刮伤实验表明，BAM条件基础培养基更能促进HBSMC和HUVEC的刮伤愈合。刮伤的HBSMC在BAM条件基础培养基中培养48小时，愈合了42.6±5.0％，而对照基础培养基仅愈合了22±1.9％(p＜0.05)；刮伤的HUVEC在BAM条件基础培养基中培养36小时，愈合了38.6±3.1％，而对照基础培养基仅愈合了7±2.2％(p＜0.05)。
上述结果表明，本发明所制备的猪BAM条件培养基含有能够明显地促进HBSMC和HUVEC增殖的生长因子、促进HBSMC和HUVEC迁移的趋化因子，这些生物活性因子是由猪BAM释放到培养基中的。这表明，本发明所制备的猪BAM中保留有促进细胞增殖的生长因子和促进细胞迁移的趋化因子。
综上所述，本发明所制备的BAM中，保留有生物活性因子，包括促进细胞黏附的黏附因子，促进细胞增殖的生长因子和促进细胞迁移的趋化因子。
Claims (12)
1.一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质，其特征在于：
a)所述的膀胱无细胞基质不含细胞、无尿路上皮层、无粘膜下层、无血管系统；
b)上述的膀胱无细胞基质具有良好的生物相容性；
c)上述的膀胱无细胞基质中保留有生物活性因子，为促进细胞黏附的黏附因子、促进细胞增殖的生长因子和促进细胞迁移的趋化因子；
d)上述的膀胱无细胞基质的超微结构特征：厚度为0.5-3.0mm，孔径大小60-250μm，孔隙率80-90％。
2.根据权利要求1所述的膀胱无细胞基质，其特征在于所述的膀胱无细胞基质来自下列动物的膀胱：猪、兔、狗或牛。
3.一种制备权利要求1所述的膀胱无细胞基质的方法，其特征在于制备步骤如下：
a)将动物的正常膀胱和部分尿道置于缓冲液中，迅速带到实验室后仔细去除外表面的脂肪和浆膜组织，经尿道插入输液皮条导管并将其用丝线固定在尿道上，然后经此输液皮条导管用缓冲液冲洗膀胱，将膀胱腔内的尿液冲洗干净；
b)经输液皮条导管向膀胱腔内灌入含0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四钠的消化液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此消化液中，室温中振荡消化，然后倒出此消化液；
c)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
d)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入低渗缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此低渗缓冲液中，静置过夜，然后倒出此低渗缓冲液；
e)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
f)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入含表面活性剂曲拉通X-100的高渗缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含表面活性剂曲拉通X-100的高渗缓冲液中，室温中振荡洗涤，然后倒出此含表面活性剂曲拉通X-100的高渗缓冲液；
g)再经输液皮条导管用缓冲液冲洗，然后倒出此缓冲液；
h)再经输液皮条导管向膀胱腔内灌入含核酸酶的缓冲液，夹闭输液皮条导管，再将整个膀胱完全浸入此含核酸酶的缓冲液中，室温中振荡洗涤，然后倒出此含核酸酶的缓冲液，得到膀胱无细胞基质；
i)将上述的膀胱无细胞基质用缓冲液冲洗；
j)将上述的膀胱无细胞基质用去离子水冲洗；
k)将上述的膀胱无细胞基质置于深低温冰箱中冷冻，再在冷冻干燥机中冻干，得到冻干的膀胱无细胞基质；
l)将上述的冻干的膀胱无细胞基质进行灭菌，得到无菌的膀胱无细胞基质；
m)将上述的无菌的膀胱无细胞基质低温密封保存，备用。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤a，c，e，g和i中所述的缓冲液为4℃预冷的10mM磷酸盐缓冲液，PH7.2-7.4，冲洗次数为3次。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤b中所述的含0.25％/0.038％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸四钠的消化液的PH为7.2-7.4灌入膀胱内的消化液的体积为30ml-500ml溶液，室温中振荡消化时间为0.5-4小时。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤d中所述的低渗缓冲液为10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含5mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶；向膀胱腔内灌入的低渗缓冲液体积为60-1200ml，静置过夜的温度为4℃。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤f中所述的含表面活性剂曲拉通X-100的高渗缓冲液，其中的表面活性剂曲拉通X-100的浓度为0.5-1.5％；其中的高渗缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 8.0，内含0.5M氯化钠，10mM乙二胺四乙酸四钠和10KIU/ml抑肽酶；向膀胱腔内灌入的含表面活性剂曲拉通X-100的高渗缓冲液体积为60-1200ml，室温中振荡洗涤时间为12-48小时。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤h中所述的含核酸酶的缓冲液，其中的核酸酶为I型脱氧核糖核酸酶和A型核糖核酸酶，二者浓度分别为25-100U/ml和1-2U/ml；缓冲液为10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH 7.6，内含2mM氯化镁，2mM氯化钙和150mM氯化钠；向膀胱腔内灌入的含核酸酶的缓冲液的体积为60-1200ml，室温中振荡洗涤时间为12-36小时。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤j中所述的去离子水为4℃预冷的无菌去离子水，冲洗次数为3次。
10.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤k中所述的膀胱细胞无细胞基质置于深低温冰箱中的冷冻温度为-20℃至-70℃，冷冻时间为2-6小时；冷冻干燥机中冻干的时间为24-96小时。
11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤1中所述的膀胱无细胞基质灭菌的方法为环氧乙烷灭菌。
12.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于在步骤m中所述的低温保存的温度为-20℃至4℃。
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