CN106256382A - 膀胱膜生物支架及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备膀胱膜生物支架的方法，包括(1)用NaOH处理膀胱组织；(2)用TritonX-100和SDS以任意顺序处理所得物，并重复一遍该步骤；(3)用NaOH处理所得物；(4)将所得物低温干燥。在该方法中，可以在步骤(1)之前使用蛋白酶抑制剂对膀胱组织进行处理，还可以在步骤(2)中在TritonX-100和SDS的一遍处理之后使用核酸酶对膀胱膜组织进行处理。由以上方法制得的膀胱膜生物支架，具有良好的生物相容性和机械强度，提供组织再生的框架，并且在细菌和病毒杀灭方面更彻底，排异反应更小，因此可良好应用于膀胱修复。

Description

膀胱膜生物支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种可引导组织再生的膀胱膜生物支架及其制备方法和用途。

背景技术

膀胱作为泌尿系统的一个重要器官，常常由于一些先天性的原因或炎症、感染、肿瘤、创伤等引起一定的损害或缺损，这些均可以导致膀胱变小和受损，这就最终需要进行膀胱扩大和修补替代。因此需要使用一定的替代材料进行修复。传统的替代材料主要有三种来源，有机合成材料、非泌尿系来源的天然替代材料、以及患者自体的泌尿系组织。但由于上述材料存在生物相容性问题或存在代谢异常、感染、尿路结石、挛缩甚至恶变的问题，或由于组织来源有限而导致术后膀胱容量过小等一系列的问题，均在不同程度上限制了这些材料在临床上的应用。

膀胱脱细胞基质属于一种天然的细胞外基质，是新开发的泌尿系统组织器官替代用生物材料，其仿生的机械性能和优良的组织相容性是多数生物和高分子材料所不能媲美的。这种材料作为细胞支架具有良好的生物相容性和结构相容性，有利于细胞生长、繁殖、分化和形成组织化，与以前应用的其他材料相比，具有生理再生重建膀胱组织、生物替代膀胱功能的显著优势。这类材料一般通过SDS和TritonX-100的处理而得到。

发明内容

一方面，本发明提供一种制备膀胱膜生物支架的方法，包括：

(1)用NaOH处理膀胱组织；

(2)用TritonX-100和SDS以任意顺序处理所得物，并重复一遍该步骤；

(3)用NaOH处理所得物；

(4)将所得物低温干燥。

具体而言，在步骤(2)中，相继用TritonX-100、SDS、TritonX-100和SDS进行处理；或者相继用SDS、TritonX-100、SDS和TritonX-100进行处理。

在实施方式中，处理中使用的NaOH、TritonX-100和SDS的浓度分别为约1～5N、约0.5～5％和约0.5～5％。例如，NaOH的浓度可以是约1N、2N、3N、4N或5N。TritonX-100的浓度可以是约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。SDS的浓度可以是约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％。NaOH可以溶于水溶液或缓冲液例如PBS、Tris等。TritonX-100和SDS可以分别溶于水或常用缓冲液例如PBS、Tris等。

在实施方式中，NaOH处理包括将膀胱组织浸泡在NaOH溶液中，例如约1～5N的NaOH溶液中。Triton X-100和SDS处理分别包括将膀胱组织浸泡在Triton X-100和SDS溶液中并搅拌。

在实施方式中，NaOH、TritonX-100和SDS的处理可以在约4～16℃下进行。

在实施方式中，在步骤(1)之前，使用蛋白酶抑制剂对膀胱组织进行处理。蛋白酶抑制剂可以是PMSF、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白肽酶等。

在实施方式中，在步骤(2)中，在TritonX-100和SDS的一遍处理之后，使用核酸酶对膀胱组织进行处理。核酸酶可以是脱氧核糖核酸酶、或脱氧核糖核酸酶加核糖核酸酶。

在实施方式中，可以在所得物的低温干燥之前，除去所得物上的核酸、脂肪和其他杂质(包括前面处理中残留的化学物质)。核酸、脂肪和其他杂质的去除可以通过例如在乙醇和异丙醇的混合水溶液、生理盐水中完成。

在实施方式中，可以对得到的膀胱膜生物支架进行灭菌。灭菌可以在所得物的低温干燥之前或之后进行。在所得物的低温干燥之后进行的灭菌可以例如通过辐照灭菌等进行。

在实施方式中，膀胱组织取自哺乳动物，尤其是大型哺乳动物，例如牛、羊、猪等。

一方面，本发明提供一种由上述方法制得的膀胱膜生物支架，由膀胱组织的脱细胞基质构成。其中，本发明的膀胱膜生物支架的特征在于，DNA含量小于0.5wt％，脂肪含量小于0.5wt％，抗拉强度大于4MPa，标准胶原含量大于85wt％，缝合线撕裂力大于10N，疏松层的孔径为约20～100μm。

另一方面，本发明提供上述膀胱膜作为膀胱修复材料的用途。

本发明通过优化脱细胞基质的制备方法，即以NaOH处理开始，并以NaOH处理结束，中间用SDS和TritonX-100进行处理，由哺乳动物的膀胱组织制备出组织相容性、生物降解性和力学强度良好，并且引导组织再生能力强的膀胱膜生物支架。在加以成本低廉的NaOH的处理后，可以有效杀灭膀胱膜生物支架上的细菌和病毒，并减少排异反应，得到的产品比传统方法得到的更优。这种膀胱膜生物支架既能防止尿液外渗，又能为细胞提供生长代谢等的场所，是组织再生的基础。由于可以取材自大型哺乳动物，所制得的膀胱膜生物支架的尺寸足以应用至人体的膀胱修复。在数个月的修复之后，新生膀胱与原膀胱具有相同结构和功能。

附图说明

图1示出根据本发明示例性实施方式的膀胱膜的外观图。

图2示出根据本发明示例性实施方式的膀胱膜的疏松层的显微照片。

图3示出根据本发明示例性实施方式的膀胱膜包埋于大鼠皮下2周，取材后切片的HE染色图，标尺为50μm。

图4示出使用本发明示例性实施方式的膀胱膜进行6个月膀胱修复的比格犬以及正常比格犬的膀胱造影图。

图5A、5B和5C示出使用本发明示例性实施方式的膀胱膜进行6个月膀胱修复的比格犬以及正常比格犬的膀胱尿动力学检测结果。

图6A和6B分别示出使用本发明示例性实施方式的膀胱膜修复6个月后比格犬的膀胱切片的HE染色图以及正常比格犬的膀胱切片的HE染色图，标尺为50μm。

图7A和7B分别示出使用本发明示例性实施方式的膀胱膜修复6个月后比格犬膀胱切片的α-平滑肌肌动蛋白的荧光染色图以及正常比格犬膀胱切片的α-平滑肌肌动蛋白的荧光染色图，标尺为50μm。

图8示出使用本发明示例性实施方式的膀胱膜修复6个月后比格犬膀胱切片的CD31荧光染色图，标尺为50μm。

具体实施方式

本发明提供的膀胱膜生物支架是膀胱组织的脱细胞基质，即除去细胞成分并保留细胞外基质的膀胱处理物。这种膀胱膜不仅抗原性低，而且可以很好地模拟组织器官的微环境。

脱细胞基质通常通过NaOH消蚀、SDS法或TritonX-100法来制备，各方法适用不同组织，且各有利弊。比如，TritonX-100较为柔和，一般不破坏细胞外基质的天然结构和成分，但是处理时间较长，且会损失一部分细胞外基质中的蛋白。SDS法可以保留较多细胞外基质，但是胶原纤维间可能有细胞碎片残留。NaOH由于比较容易洗去，因此没有在最终产品上的残留问题，对修复的组织和细胞没有毒性。

本发明的膀胱膜生物支架制备方法，通过结合上述三种方法，优化各方法的处理顺序，使得制备出组织相容性好、生物降解性好、机械强度好并能引导组织再生的膀胱脱细胞基质。具体而言，在本发明中，有两种处理顺序。第一种是相继用NaOH、TritonX-100、SDS、TritonX-100、SDS和NaOH进行处理。第二种是相继用NaOH、SDS、TritonX-100、SDS、TritonX-100和NaOH进行处理。本发明的发明人注意到，当以NaOH处理开始，并以NaOH处理结束，可以有效杀灭细菌和病毒，并减少膀胱膜生物支架的排异反应。其中，本发明的膀胱膜生物支架以0.1g/ml比例浸提，内毒素含量小于0.5EU/ml。由于NaOH成本低廉，且有上述效果，使得本发明的产品优于传统方法得到的产品。NaOH通常以约1～5N的浓度溶于水溶液或缓冲液例如Tris、磷酸盐缓冲液等，优选为约2N的浓度。TritonX-100和SDS通常以0.5～5％的浓度分别溶于水或常用缓冲液例如PBS、Tris等，优选为约1％的浓度。NaOH每次处理的时间优选为约30分钟，而TritonX-100和SDS每次处理的时间优选为约24小时。NaOH、TritonX-100和SDS 的处理可以在约4～16℃下进行。在各溶液的各个处理步骤中，为使处理效果更佳，可以数次更换新溶液。

在方法的步骤(1)之前，在处理溶液中添加蛋白酶抑制剂，比如PMSF等。在使用NaOH、SDS或TritonX-100对膀胱组织进行处理时，组织中的细胞破裂，细胞中的蛋白酶会释放出来。如果不事先使用蛋白酶抑制剂进行处理，这些释放出来的蛋白酶会降解细胞外基质中的蛋白，从而破坏胶原蛋白和弹性纤维等形成的支架结构。而这种支架结构正是膀胱修复中起重要作用的部分，一来可以为尿液容纳提供足够的机械和力学强度，二来可以作为引导组织再生的框架和基础。

在步骤(2)中，在用TritonX-100和SDS以任意顺序处理一遍之后，通过添加核酸酶来降解细胞中的DNA和RNA。此处，核酸酶指脱氧核糖核酸酶和/或核糖核酸酶。RNA一般自身并不稳定，在没有添加核糖核酸酶的情况下，经过一段时间，也会自然降解。而DNA在细胞外的存在较为稳定，因此添加一定量的脱氧核糖核酸酶，可以保证DNA的降解，从而保证最后制得的膀胱膜的低抗原性。

在步骤(4)之前，一般要除去膀胱膜上残留的核酸、脂肪和其他杂质(包括前面处理残留的化学物质)。一般采用乙醇和异丙醇的混合水溶液。乙醇和异丙醇均能沉淀核酸和脂肪，并在蒸发时带走其他一些杂质。也可以进一步用生理盐水进行清洗，可以去除化学物质残留。

在去除核酸和脂肪等之后，将所得的膀胱处理物低温干燥。低温干燥可以除去所得物中的水分和溶液残留，完好保持膀胱组织剩余部分的结构。低温干燥可以通过例如冷冻干燥的方法，在冷冻干燥仪中进行。

如果膀胱膜要用于医疗用途，例如用于临床的膀胱修复，则需要对其进行灭菌。灭菌可以在所得物的低温干燥之前或之后进行。在低温干燥之后的灭菌可以通过辐照进行，例如钴源照射等。

按照本发明方法得到的膀胱膜无毒性，抗原性极低，生物组织相容性好，具有生物可降解性(体内降解速度为约3个月)及降解可调节性，并具有可塑性和一定的机械强度。具体而言，本发明制得的膀胱膜包括致密层和疏松层，其中致密层为膀胱的粘膜层，而疏松层则主要是膀胱的肌肉层。致密层具有储尿以及防止尿液外渗等功能特征。 疏松层富含胶原、弹性蛋白等，构成的三维空间可以引导细胞的生长和延伸，并为这些细胞提供真实原始的细胞外微环境，这些细胞可以在此获取营养，进行气体交换、排泄废物以及生长代谢。疏松层在降解的同时，细胞分泌的基质逐渐替代本发明的膀胱膜，从而完成组织修复。

由于本发明的膀胱膜可以由哺乳动物，特别是大型哺乳动物制得，因此膀胱膜的尺寸可以足够大，以在膀胱修复中提供足够的储尿空间。进行原材料采集时，要选取处死半小时以内的动物新鲜膀胱，迅速置于冰盒内保存。在使用之前，要去除多余的周围组织。

通过本发明的方法，可以以便利和廉价的方式得到可引导组织再生的膀胱膜生物支架，该膀胱膜生物支架在不引起机体免疫排斥反应的情况下，一边替代原损伤组织发挥膀胱功能，例如储尿等，一边引导细胞的生长和延伸，逐渐生成新的膀胱组织。经动物体内实验验证，新生膀胱与原膀胱具有同样的结构和功能。

以下提供本发明的具体实施例，实施例仅为示例说明本发明，而并不限制本发明的范围。

实施例

制备例 1

分别取处死半小时以内的牛、猪、羊的新鲜膀胱，迅速置于冰盒内PBS缓冲液(pH 7.4)中保存。修剪去除膀胱周围的肌肉、脂肪等多余组织，自膀胱颈部以下剪除，然后正中剪开膀胱直至圆顶部，整个膀胱成片状摊开。PBS漂洗三遍后待用。

之后，按照以下步骤制备膀胱膜生物支架：

(1)将膀胱浸于Tris(pH 8.0，Amresco，code：0497)缓冲液中，缓冲液内含有蛋白酶抑制剂PMSF(sigma货号78830)(浓度0.35ml/L)，室温下持续浸泡搅拌24小时，间隔8小时更换一次缓冲液；

(2)将膀胱置于PBS(pH 7.4，Nissui，货号ZZR05913)中，在15℃下置于摇床上60～80rpm漂洗1小时；

(3)在4℃下，在2N的NaOH水溶液中浸泡30分钟；

(4)置于PBS中，在15℃下漂洗1小时；

(5)置于含有1％TrionX-100(Amresco，code:0694)的PBS缓冲液(即TBS)中，于15℃持续浸泡搅拌24小时，间隔8小时更换一次TBS缓冲液；

(6)置于PBS中，在15℃下漂洗1小时；

(7)置于含有1％SDS(Amresco code:0227)的Tris(pH 8.0)缓冲液中，在15℃下持续浸泡搅拌24小时，间隔8小时更换一次缓冲液；

(8)置于PBS中，在15℃下漂洗24小时，间隔8小时更换一次缓冲液；

(9)置于含有核糖核酸酶(sigma，货号：6513，40u/ml)和脱氧核糖核酸酶(sigma，货号：DN25，40u/ml)的1mol/L NaCl溶液中，室温持续浸泡搅拌12小时；

(10)置于含有1％TrionX-100的PBS缓冲液(即TBS)中，15℃下持续浸泡搅拌24小时，间隔8小时更换一次TBS缓冲液；

(11)置于PBS中，在15℃下漂洗1小时；

(12)置于含有1％SDS的Tris(pH 8.0)缓冲液中，于15℃持续浸泡搅拌24小时，间隔8小时更换一次缓冲液；

(13)置于PBS中，在15℃漂洗2小时；

(14)在4℃下，于2N的NaOH水溶液中浸泡30分钟；

(15)置于PBS中，在15℃漂洗2小时；

(16)置于乙醇(95％)水溶液与异丙醇(100％)的(体积比1:1)混合液中，15℃持续浸泡搅拌24小时，间隔8小时更换一次缓冲液；

(17)置于生理盐水中漂洗，每隔2小时更换一次生理盐水，共更换3～5次；

(18)将所得物放置在LABCONCO 6L Freeze Dry System冻干机中，-40℃冷冻4小时，-10℃冻干20小时；

(19)钴源照射(15KGY)，密封保存。

由此，得到样品1(牛)、样品2(猪)和样品3(羊)。

制备例 2

使用牛的膀胱，如同制备例1进行膀胱膜的制备，除其中步骤(5)与步骤(7)交换顺序并且步骤(10)与步骤(12)交换顺序外。得到 样品4。

制备比较例

使用牛的膀胱，如同制备例1进行膀胱膜的制备，除不进行其中的步骤(3)和步骤(14)外。得到比较样品1。

实施例 1 ：膀胱膜的理化特性

样品1～4和比较样品1的外观和理化性质均相似，但是产品1～4在细菌和病毒杀灭方面更彻底，且排异反应更小。其中，样品1的外观如图1所示。

(1)DNA含量：根据《中华人民共和国药典》第三部附录IX B规定方法检测。

结果表明，样品1～4和比较样品1的DNA含量小于0.5wt％。

(2)脂肪含量：按GB/T 5009.3-2010第一法的规定方法进行。

结果表明，样品1～4和比较样品1的脂肪含量小于0.5wt％。

(3)抗拉强度：使用上海倾技产的QJ212型抗拉强度试验机进行测定。

结果表明，样品1～4和比较样品1的抗拉强度为大于4MPa。

(4)标准胶原含量：按照羟脯氨酸含量测定法进行

A.1采用 Bergman Ⅰ和 Loxley R 方法检测

A.2试剂

2.1羟脯氨酸标准品(中科院上海生化所)1.6mmol/L：称取20.98mg(0.02098g)羟脯氨酸，溶于0.001mol/L盐酸溶液中，使总体积为100ml，4℃可保存数月。

2.2羟脯氨酸标准溶液(0.08mmol/L)：移取上述储备液5.00ml，用水稀释至100ml。

2.3氧化剂溶液：

a.氯氨T水溶液：称取7.0g氯氨T(SIGMA产，货号SIAL-23270-50G)溶于100ml水中，贮存在棕色瓶中置于暗处，可保存1～2周。

b.醋酸－柠檬酸缓冲溶液(pH 6.0)：称取醋酸钠(3H₂O)57.0g，柠檬酸三钠(2H₂O)37.5g，柠檬酸(H₂O)5.5g，加少量水溶解，再加入385ml异丙醇，用水稀释至1000ml，此溶液可长期保存使用。

临用前将(a)和(b)液按1：4体积混合，即得到氧化剂溶液，置于 棕色瓶中。

2.4艾氏试剂(显色剂)：对二甲氨基苯甲醛(国药产，货号10008792)1.18mol/L,高氯酸(国药产，货号10015161)2.44mol/L,异丙醇0.74(体积分数)，临用前配制，置于棕色瓶中。

2.56mol/l盐酸溶液：取54ml盐酸，用水稀释至100ml。

2.66mol/l氢氧化钠溶液：称取24g氢氧化钠，用水稀释至100ml。

2.7甲基红指示剂：取甲基红(国药产，货号71025214)0.1g，加0.05mol/L氢氧化钠溶液7.4ml使之溶解，再加水稀释至200ml。变色范围pH 4.2～6.3(红→黄)。

2.80.001mol/l盐酸：9ml盐酸稀释至100ml得1mol/l盐酸溶液。取1ml的1mol/l盐酸溶液稀释至1000ml。

A.3检测方法

3.1样品处理

取供试品0.1g，放入具塞试管(或安瓿)中，加入6mol/l盐酸溶液10ml，封口后置135℃烤箱中水解4小时，冷却后打开封口加入2滴甲基红指示剂使之呈红色，用6mol/l氢氧化钠溶液中和该液至中性呈微黄色，然后用纯化水稀释至1000ml，过滤，作为样品供试液。

3.2样品测定

于带塞的比色管中，加入0.5ml样品供试液，加入0.5ml纯化水，作为样品溶液，再加入2ml异丙醇和1ml氧化剂溶液，摇匀，室温放置4分钟使其氧化。再加入2ml艾氏试剂，加塞摇匀，放入60℃水浴中加热显色，20分钟后室温放置1小时。用1cm比色皿，以纯化水做参比液，在560nm处测定吸光度，并以试剂空白进行校正。

A.4标准曲线

分别取0.00；0.20；0.40；0.60；0.80；1.00ml羟脯氨酸标准溶液加入到6个比色管中，(羟脯氨酸浓度分别为0μmol/l；16μmol/l；32μmol/l；48μmol/l；64μmol/l；80μmol/l)不足1ml的用蒸馏水补至1ml，按上述步骤，测定其吸光度，绘制标准曲线。当标准溶液或待测溶液中羟脯氨酸的含量在0～80μmol/L范围内时符合朗伯－比尔定律。羟脯氨酸最佳测定范围为16～56μmol/L，吸光度相应为0.2～0.7Abs，每微克羟脯氨酸可产生0.097的吸光度。(由于显色剂、氧化剂是用前配制，每一次试验都需做标准曲线。)

结果表明，样品1～4和比较样品1的标准胶原含量为大于85wt％。(5)缝合线撕裂力：参照QB/T 4198-2011撕裂力的测定。

结果表明，样品1～4和比较样品1的缝合线撕裂力大于10N。

(6)疏松层的孔径大小：

在冷冻扫描电子显微镜(HITACHI S-3000N&Quorum PP3000T)下观察样品1～4和比较样品1的疏松层，可看到其孔径大小为约20～100μm，其中样品1的显微图如图2所示。该孔径范围可以使得细胞附着在其中，均匀生长。

(7) 内毒素含量：

内毒素检测方法：

浸提液的制备：使用注射水按0.1g/ml比例浸提样品24小时，测试浸提液的内毒素含量。

1、选择所需规格(0.1ml)及灵敏度(0.25EU/ml)的鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司)、细菌内毒素标准品(中国食品药品检定研究所，批号：250601-201174)及细菌内毒素检查用水(2ml/支，内毒素含量低于0.003EU/m，湛江安度斯生物有限公司)。

2、取内毒素标准品(冻干品)1支，用注射水溶解后稀释至所需浓度备用。

3、取鲎试剂8支，2支作供试品检查管，2支作阴性对照管，2支作阳性对照管，2支作供试品阳性对照管。

4、阴性对照管加入0.2ml检查用水，其余各管加入0.1ml检查用水；每支供试品检查管另加入0.1ml样品；阳性对照管加入0.1ml浓 度为2λ的内毒素标准品溶液；供试品阳性对照管加入0.1ml浓度为2λ内毒素的样品。

5、封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37±1℃恒温器中孵育60±2分钟，然后观察结果。试管孵育期间应避免任何震动。

6、将试管从恒温器中轻轻取出，缓慢倒转180°时，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为(+)；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为(-)。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

7、阴性对照管必须是阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须是阳性，否则实验结果无效。

结果表明，在各制备例样品的浸提液中，内毒素含量<0.5EU/ml，而在将制备比较例样品同样处理得到的浸提液中，内毒素含量>2.5EU/ml。

实施例 2 ：膀胱膜的细胞相容性

将样品1包埋于大鼠皮下，2周后，取出包埋的膀胱膜材料，采用苏木精(SIGMA-701)和伊红(BioRY-DH0047)进行HE染色。

图3示出染色结果，未见炎症反应，即没有见到类似免疫细胞形态的细胞出现。

实施例 3 ：膀胱膜的修复功能

取5只比格犬，1周岁，雄性，对其膀胱做半切模型。然后，将样品1的膀胱膜缝合在剩余的原膀胱上，其中膀胱膜比切除部分稍大一些，留出缝合空间，使得修复面积和切除面积基本一致。

6个月后，采用膀胱造影及膀胱尿动力学检测膀胱膜修复后的再生膀胱组织的功能。

对实验比格犬和未做实验的正常组比格犬(3只)静脉注射造影剂，然后进行造影。具体操作描述如下，静脉推注碘油造影剂(2ml/kg)，马上进行X线连续拍片，观察双侧肾脏及输尿管显影情况。膀胱开始显影后，逆行插入8F尿管，向膀胱内注射造影剂，同时观察膀胱显影情况。

图4示出实验结果，0min显示两组均未看到阳性结石影像；3min可见造影剂排出，说明输尿管排泄通畅，未见明显梗阻；7min可见造影剂顺利进入膀胱。膀胱造影显示，相比于正常组，实验组比格犬的膀胱形态基本正常，无明显结石、憩室、占位。

此外，按照如下步骤，对两组比格犬进行膀胱尿动力学检测：

1.尿道外口插入尿动力检测管；

2.排空比格犬膀胱内尿液，同时往肛门内插入腹压检测管；

3.压力调零后与Nidoc 970A⁺尿动力学分析仪相连接；

4.启动检测，灌注速度20ml/min，当尿道外口刚有生理盐水溢出时，标记为膀胱的最大容量；

6.仪器自动记录压力/容积曲线；

7.分析曲线，记录膀胱最大容量、逼尿肌最大压力、顺应性等指标。

图5的图表示出结果，使用样品1膀胱膜对比格犬的大面积损伤的膀胱进行修复后，修复后的膀胱形态接近正常水平，恢复效果明显。其中，图5A示出两组比格犬的膀胱最大体积，图5B示出膀胱的最大压力，图5C示出膀胱的顺应性，顺应性反映出膀胱的弹性，是体积和压力的比值。

在以上两个实验之后，处死比格犬，暴露其膀胱组织。观察膀胱外部结构，可发现，在膀胱膜缝合6个月后，再生的膀胱组织结构完整，无明显疤痕组织，形状与正常膀胱组织相似，且无尿液渗漏，手感有弹性，具有储尿功能。

将再生的膀胱组织取下，用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，制备厚5μm的病理学切片。经HE染色后，观察再生组织的微观结构。图6示出染色结果，在再生组织中，大部分膀胱膜材料已降解，可见膀胱组织各层的再生，包括粘膜层、肌层和浆膜层。膀胱组织的收缩能力源于其肌层具有丰富的平滑肌组织，经膀胱膜修复后的再生膀胱组织具有明显的束状平滑肌组织的再生，与正常膀胱组织的形态结构十分类似。这些结果表明，本发明的膀胱膜具有明显促进膀胱组织再生的修复效果。

为进一步鉴定膀胱平滑肌组织的再生，对10μm的冰冻切片进行膀胱平滑肌特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的免疫荧光染色， 具体步骤如下：

1.冰冻切片室温晾15min；

2.PBS(pH7.4)浸泡10min；

3.血清(中杉金桥产羊血清工作液，货号ZLI-9022)室温封闭30min；4.加入一抗(ABCAM产，货号ab119952，1:500稀释)4℃过夜；

5.第二天，切片PBS清洗5min×3次；

6.血清室温封闭15min；

7.加入荧光二抗(invitrogen产货号A-21202，1:500稀释)，室温60min

8.PBS清洗5min×3次

9.封片

10.观察

图7示出染色结果，膀胱膜在修复6个月后，膀胱平滑肌组织再生明显，且其结构与正常膀胱平滑肌组织类似。图中较亮的点为α-SMA特异性阳性纤维，稍暗的点为细胞核。

之后，对10μm的冰冻切片进行血管内皮细胞特异性标志物CD31的荧光染色，具体步骤同上，其中一抗为ABCAM产，货号ab26975，1:500稀释，二抗为invitrogen产，货号A-21202，1:500稀释。

图8示出染色结果，在新生的膀胱组织中，有明显的血管生成(图中圆圈为血管)。

从以上结果看来，本发明的膀胱膜可以作为膀胱修复膜使用，由于膀胱与尿道、输尿管细胞外基质的超微结构相似，因此本发明的膀胱膜还可以用于其他组织的再生引导，如尿道、输尿管等。

Claims (11)

1.一种制备膀胱膜生物支架的方法，包括：

(1)用NaOH处理膀胱组织；

(2)用TritonX-100和SDS以任意顺序处理所得物，并重复一遍该步骤；

(3)用NaOH处理所得物；

(4)将所得物低温干燥。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所使用的NaOH、TritonX-100和SDS的浓度分别为1～5N、0.5～5％和0.5～5％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括，在步骤(1)之前，使用蛋白酶抑制剂对所述膀胱组织进行处理。

4.根据权利要求1或2所述的方法，还包括，在步骤(2)中，在TritonX-100和SDS的一遍处理之后，使用核酸酶对所述膀胱组织进行处理。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述核酸酶是脱氧核糖核酸酶、或脱氧核糖核酸酶加核糖核酸酶。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在所述低温干燥之前，除去核酸、脂肪和其他杂质。

7.根据权利要求1或2所述的方法，还包括，在步骤(4)后，对所述膀胱膜生物支架进行灭菌。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述膀胱组织取自哺乳动物。

9.一种膀胱膜生物支架，由权利要求1～8所述的方法制得，由脱细胞基质构成。

10.根据权利要求9所述的膀胱膜生物支架，其中，DNA含量小于0.5wt％，脂肪含量小于0.5wt％，抗拉强度大于4MPa，标准胶原含量大于85wt％，缝合线撕裂力大于10N，疏松层的孔径为约20～100μm。

11.权利要求9或10所述的膀胱膜生物支架作为膀胱修复材料的用途。