RU2662554C2 - Способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода - Google Patents
Способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662554C2 RU2662554C2 RU2016149685A RU2016149685A RU2662554C2 RU 2662554 C2 RU2662554 C2 RU 2662554C2 RU 2016149685 A RU2016149685 A RU 2016149685A RU 2016149685 A RU2016149685 A RU 2016149685A RU 2662554 C2 RU2662554 C2 RU 2662554C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- esophagus
- matrix
- perfusion
- decellularization
- cranial
- Prior art date
Links
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000463 material Substances 0.000 title description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims abstract description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 23
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 14
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 6
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 6
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 claims description 6
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 claims description 5
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 5
- 238000004435 EPR spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000035806 respiratory chain Effects 0.000 claims description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 abstract description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008811 mitochondrial respiratory chain Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002585 Contractile Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010068426 Contractile Proteins Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029767 Congenital, Hereditary, and Neonatal Diseases and Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000019505 Deglutition disease Diseases 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283283 Orcinus orca Species 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 208000035965 Postoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009864 tensile test Methods 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
- A61F2/02—Prostheses implantable into the body
- A61F2/20—Epiglottis; Larynxes; Tracheae combined with larynxes or for use therewith
- A61F2/203—Epiglottis; Larynxes; Tracheae combined with larynxes or for use therewith comprising an air passage from trachea to oesophagus or to pharynx; Artificial epiglottis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/10—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using electron paramagnetic resonance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области регенеративной медицины. Предложен способ подготовки матрикса для создания биоинженерной конструкции пищевода в эксперименте. Осуществляют выделение и очищение пищевода экспериментальных животных от окружающей соединительной ткани, канюлирование краниальной и каудальной частей пищевода, децеллюляризацию детергентами и энзимами и отмывание пищевода от децеллюляризирующих растворов. Качество децеллюляризации подтверждают путем иммуногистохимического анализа по наличию коллагенов I и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина и отсутствию гладкомышечного актина, тропомиозина, компонентов дыхательной цепи митохондрий, а также по отсутствию выраженной клеточной воспалительной реакции на пробу подкожной имплантации подготовленного матрикса in vivo. Изобретение обеспечивает повышение качества получаемого матрикса. 1 табл., 1 пр.
Description
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано в клеточной биологии, молекулярной биологии, торакальной хирургии для создания технологии получения и использования в практических целях биоинженерного органа в качестве трансплантата.
Во всем мире ежегодно более чем у 500000 человек диагностируют рак пищевода [Wheeler J.В. et al., 2012] и по современному прогнозу эта цифра увеличится до 850000 человек к 2030 году [Bloom D. et al., 2012]. Рак пищевода среди злокачественных заболеваний является одним из наиболее агрессивных по течению и неблагоприятных по прогнозу для жизни пациентов. В структуре всех злокачественных заболеваний рак пищевода составляет 3% и занимает 6-е место среди опухолей желудочно-кишечного тракта, 3-е место после рака желудка и прямой кишки. Пик заболеваемости приходится на возраст 50-60 лет [Янкин А.В., 2003]. Около 30% пациентов с раком пищевода, а также пациенты с травматическими и врожденными нарушениями (частота встречаемости от 1:2500 до 1:4500 новорожденных) нуждаются в резекции пищевода. Существуют разнообразные тактики по восстановлению пассажа пищи, в том числе с формированием неопищевода из участка желудка [Poghosyan Т. et al., 2011], толстого и тонкого отделов кишечника [Cowles R.A. et al., 2010]. Однако данные реконструктивные операции очень сложны, связаны со значительным количеством послеоперационных осложнений [Smithers В. et al., 2007], а также высокой летальностью [Stein Н.J. et al., 2005]. В течение двух лет после подобных операций многие пациенты страдают от дисфагии в результате образования стриктур и, как правило, нуждаются в повторных эндоскопических вмешательствах для бужирования пищевода [Teoh A.Y.В. et al., 2011].
Тканевая инженерия позволяет создавать биологические конструкции в лабораторных условиях для замены поврежденного или удаленного органа. Она включает в себя разработку и модификацию биологических (природных) или искусственных каркасов (носителей), а также оценку и поддержание жизнеспособности клеток или тканей, взаимодействующих с ними и в связи с этим обладает огромным потенциалом для создания новых способов лечения и улучшения качества жизни таких больных, которым требуется пересадка пищевода. Кроме того, пациенты, которые сегодня считаются неоперабельными из-за плохого клинического статуса, могут получить шанс на выздоровление. С учетом высокой смертности от рака пищевода весьма актуальной является разработка способа подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода.
В частности, известен способ децеллюляризации сердца крысы [Патент РФ на изобретение №2550286/ 03.06.14. Бюл. №13. Маккиарини П., Губарева Е.А., Сотниченко А.С., Гилевич И.В., Юнгеблут Ф. Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе.]. Протокол включает в себя канюлирование сердца крысы выше места отхождения основных ветвей дуги аорты с последующей перфузией через аорту очищенной водой, фосфатно-буферным солевым раствором, детергентами и ферментами: растворами, содержащими 4% раствор дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА, свиную панкреатическую ДНКазу-I 2000 ЕД/200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием и отмывку каркаса фосфатным буфером с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина с общей продолжительностью 28 часов, причем жизнеспособность клеток на полученном каркасе определяют по наличию дифференциального окрашивания живых и мертвых клеток, по способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде.
Основным недостатком данного способа является то, что по данному протоколу децеллюляризацию проводят на модели сердца крысы, и это, в связи с физиологическими отличиями животных, не может транслироваться на модель пищевода низшего примата без изменений и дополнений.
За ближайший аналог принят способ проведения децеллюляризации пищевода низшего примата [Губарева Е.А., Сьоквист С., Сотниченко А.С. и др. Децеллюляризация пищевода низших приматов. Гены и клетки. 2014; 9 (4): 64-69], заключающийся в выделении пищевода низшего примата, очищении его от окружающей соединительной ткани, канюлировании краниальной и каудальной части пищевода пластиковыми катетерами, децеллюляризации пищевода детергент-энзиматическим методом в 2 цикла перфузии пищевода со скоростью 150 мл/мин детергентами и энзимами (деионизированная вода - 1 ч; дезоксихолат натрия 4% + 2 mM раствор ЭДТА 1 час; PBS -/- 10 мин; свиная панкреатическая ДНКаза-I 2000 ЕД/200 мл PBS+/+ - 1 ч), отмывании от децеллюляризирующих растворов фосфатным солевым буферным раствором -/- 200 мл - с общей продолжительностью процедур ~ 24 ч. Контроль качества децеллюляризации проводился путем гистологического исследования, анализа морфологической структуры, количественного определения уровня ДНК и механических свойств полученного каркаса.
Основными недостатками данного способа являются однонаправленная перфузия пищевода децеллюляризирующими растворами, приводящая к неравномерному обесклечиванию органа на протяжении, отсутствие обеззараживания матрикса, создающее угрозу бактериальной контаминации и, как следствие, нарушения его структуры, высокая скорость перфузии, приводящая к изменению механических характеристик, не полный контроль качества децеллюляризации.
Задачи: максимальное сохранение гистологической структуры внеклеточного матрикса пищевода, обеспечение щадящего режима обработки биологического материала, снижение вероятности бактериальной контаминации получаемого каркаса, полноценный морфологический и молекулярно-биологический анализ матрикса, т.е. повышение качества получаемого биоинженерного материала и обеспечение контроля его качества.
Сущностью предлагаемого способа подготовки матрикса для создания биоинженерной конструкции пищевода в эксперименте является то, что после выделения пищевода низшего примата и очищения его от окружающей соединительной ткани канюлируют краниальную и каудальную части органа, перфузию для децеллюляризации осуществляют в течение 28 часов со скоростью потока реагентов 100 мл/минуту, при этом перфузию осуществляют в 2 этапа: после перфузии через краниальный конец пищевода в направлении к каудальному направление перфузии изменяют на противоположное - от каудального к краниальному, каждый из двух этапов перфузии включает обработку деионизированной водой в течение 1,5 часов, затем используют 4% раствор дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА в течение 70 минут, фосфатный буфер - в течение 15 минут, свиную панкреатическую ДНКазу-I 2000 ЕД/200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 70 минут, завершают децеллюляризацию промывкой от децеллюляризирующих растворов и дезинфекцией матрикса в 10% растворе хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере со сменой раствора и направления перфузии каждые 5 часов, причем качество децеллюляризации подтверждают путем гистологического окрашивания, определения количественного содержания ДНК, механического тестирования иммуногистохимического анализа по наличию коллагенов I и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина и отсутствию гладкомышечного актина, тропомиозина, компонентов дыхательной цепи митохондрий - с помощью ЭПР-спектроскопии; а также по отсутствию выраженной клеточной воспалительной реакции на пробу подкожной имплантации подготовленного матрикса in vivo.
Техническим результатом способа является повышение качества получаемого матрикса. Ранее использовавшиеся протоколы и способы повреждали матрикс пищевода и несли высокий риск развития бактериальной контаминации, что крайне неблагоприятно сказывалось на качестве полученного матрикса пищевода и возможности последующего создания биоинженерного органа. Чередование направления перфузии, снижение ее скорости, применение хлоргексидина биглюконата для дезинфекции матрикса полностью нивелирует негативные эффекты известных способов того же назначения. Кроме того, способ предусматривает качественную оценку состава матрикса, контроль количества остаточных компонентов дыхательной цепи митохондрий и биосовместимости матрикса.
Способ подготовки матрикса для создания биоинженерной конструкции пищевода в эксперименте осуществляют следующим образом: для децеллюляризации используют пищевод низших приматов. Орган очищают от окружающей соединительной ткани. Канюлируют краниальную и каудальную части пищевода пластиковыми катетерами соответствующего диаметра. Для проведения децеллюляризации пищевод помещают в специализированный биореактор ORCA (Harvard Apparatus, США) и начинают ретроградную перфузию жидкости через орган в течение 28 часов при скорости потока реагентов 100 мл/мин. Децеллюляризацию проводят в 2 этапа: на первом растворы перфузируют через краниальный конец пищевода в направлении каудального, на втором этапе направление перфузии меняют на противоположное. Каждый из этапов включает перфузию деионизированной водой - 1,5 часа, дезоксихолатом натрия 4% в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА - 70 минут, фосфатным буфером - 15 минут, свиной панкреатической ДНКазой-I 2000 ЕД/200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 70 минут, затем завершают децеллюляризацию отмывкой от децеллюляризирующих растворов и дезинфекцией матрикса в 10% растворе хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере со сменой раствора и направления перфузии каждые 5 часов.
Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществляют методами гистологического исследования (окрашивание гематоксилином и эозином, флуорофором DAPI) для подтверждения сохранности архитектоники внеклеточного матрикса пищевода и отсутствия клеточных элементов на сердечном каркасе, количественного определения уровня оставшейся ДНК [Badylak S.F. et al., 2011], а также путем определения предельных биомеханических параметров на растяжение каркаса на универсальных испытательных машинах фирмы Инстрон модель 5965 (датчик 50 Н) и на Lloyd LRX (100 N load cell) [Witzenburg С. et al., 2012]. Сохранность белков внеклеточного матрикса - коллагенов I и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина и отсутствие внутриклеточных сократительных белков - гладкомышечного актина, тропомиозина определяют при помощи иммуногистохимического исследования [Ott Н.С. et al., 2008]. Проводят ЭПР-спектроскопию образцов матрикса пищевода для содержания определения компонентов дыхательной цепи митохондрий [Е.А. Губарева и др., 2016]. Для определения уровня клеточной воспалительной реакции организма лабораторного животного на получаемый матрикс пищевода ацеллюлярные образцы размером до 5 мм в диаметре имплантируют подкожно лабораторным крысам на срок до 14 дней с последующей гистологической оценкой воспалительного ответа.
Способ апробирован в течение 1,5 лет на биологическом материале (пищевод) экспериментальных животных (низшие примата - Масаса Mulatta). Результаты полностью подтвердили решаемые задачи. Получены естественные каркасы органов, с сохранным внеклеточным матриксом и отсутствием клеточных структур.
Данный способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода использован в эксперименте на низших приматах - Масаса Mulatta. Выполнен забор и фиксация в биореакторе пищевода с последующей децеллюляризацией по предлагаемому способу.
Пример: произвели забор пищевода с соблюдением правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (протокол локального этического комитета №30/1). Орган очистили от окружающей соединительной ткани, канулировали краниальный и каудальный концы пищевода и фиксировали в биореакторе. Начали децеллюляризацию пищевода путем перфузии со скоростью 100 мл/мин через краниальный конец децеллюляризирующими растворами: деионизированной водой - 1,5 часа, дезоксихолатом натрия 4% в комбинации с 0,002М Na2-ЭДТА - 70 минут, фосфатным буфером - 15 минут, свиной панкреатической ДНКазой-I 2000 ЕД/200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 70 минут, затем сменили направление перфузии жидкости на обратное - от каудального конца к краниальному и повторили цикл перфузии децеллюляризирующими растворами. Децеллюляризацию пищевода завершили отмывкой от децеллюляризирующих растворов и дезинфекцией матрикса в 10% растворе хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере со сменой раствора и направления перфузии каждые 5 часов.
Контроль качества полученного биоинженерного каркаса осуществили методами гистологического исследования (окрашиванием гематоксилином и эозином, флуорофором DAPI) для подтверждения сохранности архитектоники внеклеточного матрикса пищевода и отсутствия клеточных элементов на сердечном каркасе, количественного определения уровня оставшейся ДНК, установили предельные биомеханические параметры на растяжение каркаса на универсальных испытательных машинах фирмы Инстрон модель 5965 (датчик 50 Н) и на Lloyd LRX (100 N load cell).
Сохранность белков внеклеточного матрикса (коллагена I и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина) и отсутствие внутриклеточных сократительных белков (гладкомышечного актина, тропомиозина) определили при помощи иммуногистохимического исследования, по наличию либо отсутствию специфичной реакции с антителами против данных белков. Провели ЭПР-спектроскопию образцов матрикса пищевода, определив содержание компонентов дыхательной цепи митохондрий. Выполнили подкожную имплантацию образцов размером до 5 мм в диаметре лабораторным крысам на срок до 14 дней, после чего гистологически оценили выраженность воспалительного ответа.
В результате экспериментов по децеллюляризации получен каркас пищевода с сохранением гистологической архитектоники и белков внеклеточного матрикса. Проведено всестороннее изучение свойств ацеллюлярного матрикса.
Claims (1)
- Способ подготовки матрикса для создания биоинженерной конструкции пищевода в эксперименте, включающий выделение и очищение пищевода экспериментальных животных от окружающей соединительной ткани, канюлирование краниальной и каудальной частей пищевода, децеллюляризацию детергентами и энзимами и отмывание пищевода от децеллюляризирующих растворов, контроль качества матрикса: гистологическое окрашивание, определение количественного содержания ДНК, механическое тестирование, отличающийся тем, что перфузию в течение 28 ч со скоростью 100 мл/мин при канюлировании осуществляют в 2 этапа: после перфузии через краниальный конец пищевода в направлении к каудальному направление перфузии изменяют на противоположное - от каудального к краниальному, каждый из двух этапов перфузии включает обработку деионизированной водой в течение 1,5 ч, затем используют 4% раствор дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na2-ЭДТА в течение 70 мин, фосфатный буфер - в течение 15 мин, свиную панкреатическую ДНКазу-I 2000 ЕД/200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием - 70 мин, завершают децеллюляризацию промывкой от децеллюляризирующих растворов и дезинфекцией матрикса в 10% растворе хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере со сменой раствора и направления перфузии каждые 5 ч, дополнительно качество децеллюляризации подтверждают путем иммуногистохимического анализа по наличию коллагенов I и IV типов, ламинина, эластина, фибронектина и отсутствию гладкомышечного актина, тропомиозина, компонентов дыхательной цепи митохондрий - с помощью ЭПР-спектроскопии, а также по отсутствию выраженной клеточной воспалительной реакции на пробу подкожной имплантации подготовленного матрикса in vivo.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149685A RU2662554C2 (ru) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2016149685A RU2662554C2 (ru) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2016149685A RU2016149685A (ru) | 2018-06-19 |
| RU2016149685A3 RU2016149685A3 (ru) | 2018-06-19 |
| RU2662554C2 true RU2662554C2 (ru) | 2018-07-26 |
Family
ID=62619374
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2016149685A RU2662554C2 (ru) | 2016-12-16 | 2016-12-16 | Способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2662554C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2694543C1 (ru) * | 2018-11-09 | 2019-07-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Артбио" | Способ получения дермального матрикса |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013040087A2 (en) * | 2011-09-12 | 2013-03-21 | Organovo, Inc. | Platform for engineered implantable tissues and organs and methods of making the same |
-
2016
- 2016-12-16 RU RU2016149685A patent/RU2662554C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013040087A2 (en) * | 2011-09-12 | 2013-03-21 | Organovo, Inc. | Platform for engineered implantable tissues and organs and methods of making the same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ACKBAR R. et al. Decellularized ovine esophageal mucosa for esophageal tissue engineering. Technol Health Care. 2012; 20(3): 215-223. * |
| ГУБАРЕВА Е.А. и др. Децеллюляризация пищевода низших приматов. Гены & Клетки. 2014; IX(4): 64-69. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2694543C1 (ru) * | 2018-11-09 | 2019-07-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Артбио" | Способ получения дермального матрикса |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2016149685A (ru) | 2018-06-19 |
| RU2016149685A3 (ru) | 2018-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7286708B2 (ja) | 臓器および組織の脱細胞化および再細胞化 | |
| Baiguera et al. | Dynamic decellularization and cross-linking of rat tracheal matrix | |
| Urciuolo et al. | Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration | |
| CN106687152B (zh) | 人类肝脏支架 | |
| US8445278B2 (en) | Process for producing decellularized biological tissues | |
| Haag et al. | Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue | |
| Bjork et al. | Ruthenium-catalyzed photo cross-linking of fibrin-based engineered tissue | |
| JP6215387B2 (ja) | バイオエンジニアリングによって作製された同種異系血管 | |
| Sjöqvist et al. | Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats | |
| CA2757457C (en) | Decellularization and recellularization of organs and tissues | |
| CN108699522A (zh) | 血管细胞外基质水凝胶 | |
| Hashemi et al. | Decellularized pancreas matrix scaffolds for tissue engineering using ductal or arterial catheterization | |
| Ansari et al. | Development and characterization of a porcine liver scaffold | |
| Yu et al. | Nonglutaraldehyde treated porcine pericardium with good biocompatibility, reduced calcification and improved Anti-coagulation for bioprosthetic heart valve applications | |
| Salameh et al. | Calcification or not. This is the question. A 1-year study of bovine pericardial vascular patches (CardioCel) in minipigs | |
| CN107427535A (zh) | 经修饰的血凝块 | |
| RU2662554C2 (ru) | Способ подготовки материала для создания биоинженерной конструкции пищевода | |
| RU2550286C1 (ru) | Способ моделирования биоинженерного каркаса сердца в эксперименте на крысе | |
| Tardalkar et al. | Novel approach toward the generation of tissue engineered heart valve by using combination of antioxidant and detergent: a potential therapy in cardiovascular tissue engineering | |
| Ahearne | Corneal extracellular matrix decellularization | |
| JP2010221012A (ja) | 高張電解質溶液による生体組織の脱細胞化処理方法 | |
| RU2714327C1 (ru) | Способ ускоренной децеллюляризации биологической ткани или органа | |
| RU2821237C1 (ru) | Способ восстановления дефекта тонкой кишки посредством применения аллогенного децеллюляризированного биоматериала | |
| Zolbin et al. | Fetal lung tissue engineering | |
| EP4230725A1 (en) | Esophagus extracellular matrix-derived scaffold for culturing and transplanting esophageal organoid, and method for producing same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20181217 |