CN106687152B - 人类肝脏支架 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于去细胞化人类肝脏组织以生产例如用于治疗或疾病建模中的人类肝脏细胞外基质(ECM)支架的方法。方法涉及，例如，通过冻融，然后，对肝脏组织施加多个循环的渗透应力，以机械方式破坏组织中的细胞，进行洗涤剂处理和蛋白酶和/或DNA酶处理，以生产去细胞化的人类ECM支架。

Description

人类肝脏支架

本发明涉及例如用于治疗、药物筛选、生物标志物识别或疾病建模中的人类肝脏细胞外基质(ECM)支架的制作。

组织工程是旨在通过恢复器官功能来改善全世界数百万人的生活质量的新兴领域。组织工程组合细胞和支架，以便发展3D结构，以便在体外重新生成器官并重现疾病。除恢复器官功能之外，组织工程还可以提供重要的生物医学应用，包括用于治疗药物和生物制剂的体外试验的平台、用于测试药物毒性的平台，用于对新设备和介入性技术的评估的平台，以及用于发现新生物标志物的平台。

人类肝脏是分成多个功能子单元，称为段(带有单个门静脉和动脉供应，肝脏静脉和胆汁引流的8个段)和区段(共享血管和胆道蒂的更多段)的单一器官。这些解剖特征使人类肝脏分为可以用于肝脏切除和分段肝脏移植实践中的多个功能子单元。传统上，来自门静脉和肝脏动脉系统的血以顺行的方式灌注人类肝脏；血被肝脏静脉系统排出，胆汁由肝脏通过胆管系统分泌。

肝脏具有各种各样的功能，包括解毒、蛋白质合成，消化所需的生物化学物质的产生，以及在碳水化合物和脂类代谢中起着关键作用。肝脏是存活所必需的；当前没有长期补偿肝功能不存在的办法。此独特功能是通过以构成3D支架的细胞外基质(ECM)-蛋白质的网络严格地组织的实质细胞和非实质细胞合作地形成。

由于病毒感染、酒精及其他情况导致的肝脏疾病越来越多，当前，在英国，每年导致10,000人死亡，在美国，导致32,000人死亡。肝脏移植是晚期急性或慢性肝病的唯一有效的治疗方案，并与极好的长期存活和生活质量相关联。然而，可供移植的肝源是有限的，需求却是越来越大。等待时间越来越长，15％至25％的适于肝脏移植的人在等待中死亡或身体变得太差。开发人工肝脏将会减少由于肝脏疾病而导致的死亡，并将为没有器官供移植的病人提供解决方案。

另外，用于研究肝脏纤维化(HF)以及肝细胞癌(HCC)发展的所有模型具有固有的问题。如此，对2D单层单细胞培养或混合细胞培养的研究形成了大多数体外研究的主轴，但是，大大地远离现实。另外，大多数动物模型，虽然与人类疾病共有许多特征，但是，不与人类共有相同的基因表达模式，它们作为体内模型的有效性是有限的。如此，有开发再现人类疾病的复杂性的模型的尚未满足的需求。

近年来，评估了使用例如猪和羊之类的大型动物的肝脏，获得用于利用人类细胞来再增殖的合适的支架的可能性。然而，除肝脏的新陈代谢能力的内在差别之外，细胞外ECM支架在不同的物种中具有不同的宏观特征和微观特征。具体而言，人类肝脏的分段和分叶不如其他物种那么明显。另外，人类肝脏的微观小叶解剖和结构是独特的，并且不同于例如猪之类的其他哺乳动物，因为肝脏小叶之间的纤维化边界在人类中不存在(并且，人类小叶结构没有正式的结构边界)。猪肝脏的典型的纤维化边界的存在代表了在利用人类细胞再增殖之后从猪肝脏中获取的支架用于人类的移植中的主要问题。实际上，猪的不同的结构可能会导致门静脉高压，因为搭桥会容易导致正常人类肝脏中的流动阻塞。

重现3D人类ECM蛋白质的成份和组织的3D人类肝脏组织的体外发展是组织工程领域的主要挑战之一。一种有前途的方法涉及通过组织去细胞化方法来制作生物支架。然而，由于人类所特有的并且不同于其他哺乳动物的宏观和微观结构的固有的差异，以前的其他作者的报告未能获得3D人类肝脏支架。尽管报告了小鼠、大鼠、白鼬、羊和猪肝脏的去细胞化，但是，没有出版物描述人类肝脏生物支架的成功产生。

发明人认识到，可以使用包括利用不同的细胞破坏试剂的组的一个或多个处理循环的方法来去细胞化人类肝脏组织，而不会破坏细胞外基质。这可以对维护人类肝脏的细胞外基质的结构和形态的非细胞的支架的可重复的生产有用。

本发明的一个方面提供生产人类肝脏支架的方法，包括

(i)提供人类肝脏组织，

(ii)以机械方式破坏组织中的细胞，

(iii)对组织中的细胞施加渗透应力，

(iv)可任选地使组织暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及

(v)使组织暴露于洗涤剂中，以及

(vi)重复步骤(iii)、步骤(iv)和步骤(v)，以及可任选地，步骤(ii)中的每一个步骤一次或多次，

由此，生产人类肝脏支架。

在一些实施例中，该方法可以包括步骤(iv)。在其他实施例中，可以省略步骤(iv)(即，方法不包括步骤(iv))。

通过要求保护的方法生产的人类肝脏支架包括非细胞的人类肝脏细胞外基质(ECM)(即，支架是去细胞化的)，并保留源肝脏组织的ECM的三维结构和生物活性。

在细胞被以机械方式破坏之后，按顺序使肝脏组织暴露于不同的去细胞化试剂(即，渗透应力试剂，蛋白酶/DNA酶和洗涤剂)中。步骤(iii)、(iv)和(v)，以及可任选地，步骤(ii)可以以任何顺序执行一次或多次，以去细胞化支架。在一些实施例中，可以以任何顺序，对肝脏组织执行包括步骤(iii)、(iv)和(v)，以及可任选地步骤(ii)中的任何一个、两个或全部三个步骤的多个循环。

在一些实施例中，步骤(ii)可以重复一次或多次。例如，可以对肝脏组织执行包括步骤(ii)的多个循环。这可以例如当使用例如超声波之类的非冻融技术来以机械方式破坏细胞时有用。

优选地，在步骤(iii)至(vi)中，对肝脏组织施加流体切应力。这会促进组织内去细胞化试剂的渗透，例如，渗透到肝窦状隙中，并将细胞和细胞碎片与细胞外基质(ECM)分离。

可以使用任何适当的技术在肝脏组织中生成流体切应力，包括灌注、搅动或负压。优选地，通过灌注或搅动，在人类肝脏组织中生成流体切应力。

对用于生成流体切应力的技术的选择可以取决于肝脏组织或应用。例如，可以利用去细胞化试剂灌注整个肝脏、单瓣扇段，段或其他肝脏结构单元以生成流体切应力。可以将例如肝脏组织块(LTC)之类的小肝脏样本浸入在去细胞化试剂中，并搅动以生成流体切应力。

可以从不适合用于移植临床用途的人类肝脏中获取如此处所描述的用于去细胞化的人类肝脏组织。可以根据相应的国家法律和伦理原则，获取合适的肝脏。

在一些实施例中，肝脏组织可以是没有表现出与损坏或疾病相关联的病理的正常组织。

在其他实施例中，肝脏组织可以是表现出与损伤或疾病相关联的病理的病理组织。例如，肝脏组织可以是多脂的，纤维化的，发炎的或表现出与疾病或损伤相关联的一个或多个其他特征。在一些实施例中，病理肝脏组织可以表现出与急性或慢性肝病相关联的病理，包括病毒感染，例如甲肝、乙肝、丙肝、丁肝或戊肝、酒精或毒素损伤、肝脏纤维化(HF)、非酒精脂肪肝疾病(NAFLD)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、原发性胆汁性肝硬化(PBC)、酒精性肝病、缺血性肝炎、巨细胞性肝炎，以及例如肝细胞癌(HCC)之类的肝癌。可另选地，病理肝脏组织可以表现出与影响肝脏的其他疾病相关联的病理，例如淀粉样变性。

用病理肝脏组织产生的肝脏支架可能具有用健康肝脏组织产生的支架不同的结构和成份。例如，与健康的肝脏组织相比，在从病理肝脏组织产生的支架中，病理支架的形态或例如胶原、肌腱蛋白和层粘连蛋白之类的ECM成份的量或相对量可能会改变。这可能对获取用于疾病建模的特定疾病改变的肝脏支架有用。

可以从患有肝脏疾病或影响肝脏的疾病(例如，以肝脏损伤或肝功能改变为特征的疾病)的个体获取病理肝脏组织。

如此处所描述的获取和存储用于去细胞化的肝脏组织的方法当前是已知的。例如，可以使肝脏肝素化以防止凝聚，和/或利用防冻剂灌注，以在融化之后减少或防止组织破坏。

如此处所描述的适于去细胞化的人类肝脏组织可包括整个肝脏或肝脏的某些部分，包括肝脏功能单元，例如肝脏的叶瓣扇段、段或子段、或小样本或切片。

肝脏的一部分可以包括一个或多个肝脏功能单元，例如叶瓣扇段、段或子段。合适的功能单元可以是带血管的和/或包括血管-胆道蒂。例如，肝脏组织可以包括人类肝脏的S8的子段，人类肝脏的段S1至S8中的一段或多段，或多段部分，例如左外侧(S2+S3±S1)，左肝脏(S2+S3+S4+S1)、右肝脏(S5+S6+S7+S8)、右侧肝脏(S6+S7)、右扩展肝脏(S4+S5+S6+S7+S8+S1)。在某些优选实施例中，肝脏组织可以是人类肝脏的左侧(S2+S3±S1)或左肝脏(S2+S3+S4+S1)部分。

如此处所描述的去细胞化的肝脏组织的量和质量可以取决于支架的计划的用途。例如，用于移植的去细胞化的肝脏组织的质量可以取决于个体的体重和个体中的功能性肝脏组织的量。

在其他实施例中，该部分可以是宽度、长度和/或直径为0.2-2cm，优选地0.2-1.25cm，更优选地0.2-1.0cm的小非血管化肝脏切片或楔形物(例如，具有0.008cm³至2cm³，更优选地0.008cm³至1cm³，例如，大约0.125cm³体积的切片)。优选地，切片是用于在标准实验室容器，例如多孔板中操作的合适的大小，并可以是例如具有大约0.5cm的侧边的大致的立方体。

小的非血管化肝脏切片或楔形物可以用于小规模地再现3D人类微环境的复杂性，用于肝脏疾病建模、药物筛选、生物标志物识别和验证以及疾病诊断的发展。可以使用组织切块机、钻取活检、针吸活检或通过对实质的切片，例如方块的简单解剖刀切割，获取合适的切片。

可以从一个肝脏中获取如此处所描述的用于去细胞化的多个肝脏部分，如此，一个捐赠的人类肝脏可以用于一个以上的病人或可以同时用于临床和疾病建模应用。

方法可以包括提供丢弃的人类肝脏整体或其一部分。在如此处所描述的去细胞化之前，人类肝脏整体可以被分成一个或多个部分。

在一些实施例中，可以在步骤(i)之前利用防冻剂处理人类肝脏组织。例如，在被冻结之前，可以利用细胞内和/或细胞外的防冻剂处理组织。合适的防冻剂包括DMSO、乙二醇、丙二醇、甘油、2-甲基-2,4，戊二醇(MPD)，以及蔗糖。

在第一个去细胞化步骤中，对人类肝脏组织中的细胞进行机械破坏以促进它们的损坏和去除。可以通过破坏肝脏组织的细胞而不会影响细胞外基质的任何合适的技术，包括冻/融、超声处理，或高强度聚焦超声(HIFU)，以机械方式破坏细胞。

在一些实施例中，在初步处理之后，机械破坏技术可以不重复。例如，例如在暴露于其他去细胞化试剂之后的冻/融处理可能会导致ECM破坏。

在其他实施例中，在初步处理之后，可以对肝脏组织中的细胞进行机械破坏一次或多次(例如，在上文的步骤(vi)中)。例如，可以对组织进行HIFU或超声处理一次或多次。

优选地，通过对人类肝脏组织进行一个或多个冻/融循环处理，以机械方式破坏细胞。例如，可以在-20℃或更低，优选地，-50℃或更低，-60℃或更低，-70℃或更低，冻结组织，然后，解冻一次或多次。可以在4℃至37℃方便地解冻被冻结的组织。在某些优选实施例中，可以在大约4℃解冻组织，以最小化组织内的可能会破坏ECM的温度梯度。例如，可以在大约-80℃冻结组织达24小时或更长时间，然后，在大约4℃解冻。

优选地，经冻结/融化的人类肝脏组织是干燥的以防止ECM破坏。在一些实施例中，可以在冻结/融化步骤之前，干燥人类肝脏组织，例如，在室温下，暴露5至30分钟。

可以在等渗缓冲液中，例如盐水，如0.90％(w/v)NaCl或PBS，对肝脏组织进行冻结/融化处理。

在机械破坏之后，通过一系列的按顺序的暴露于渗透试剂、酶和洗涤剂(即，去细胞化试剂)中的处理，去细胞化人类肝脏组织。这些按顺序的对不同去细胞化试剂的暴露将细胞和细胞碎片与细胞外基质(ECM)分离，并从肝脏组织去除它们。

渗透应力会导致肝脏组织中的细胞的裂解，并放大机械破坏的效果。可以通过将组织暴露于对组织中的细胞具有不同的渗透压力(即，非等渗试剂)的一种或多种渗透试剂中，产生渗透应力。可以将组织暴露于具有比细胞更低的渗透压力的一种或多种低渗试剂，并使细胞处于低渗环境中和/或具有比细胞更高的渗透压力的一种或多种高渗试剂中，并使细胞处于高渗环境中。在一些实施例中，可以优选低渗试剂。

高渗试剂可以，例如，在将DNA与蛋白质分离时有用。合适的高渗试剂是本领域已知的，包括盐水(例如，>0.9％(w/v)NaCl，例如3％至7％(w/v)NaCl)，可任选地，可以例如利用磷酸盐、硼酸盐或三羟甲基氨基甲烷，以及聚乙二醇溶液，缓冲该盐水。

低渗试剂可以，例如在通过简单的渗透效应引起细胞裂解时有用，ECM的分子和结构的变化最小。合适的低渗试剂是本领域已知的，包括水、去离子水和<0.9％(w/v)NaCl的盐水。

在一些实施例中，使用酶来破坏肝脏组织中的细胞和亚细胞结构，并断开细胞与ECM的连接。例如，可以利用蛋白酶降解组织中的蛋白质。合适的蛋白酶是本领域已知的，并包括胰蛋白酶。可以将肝脏组织暴露于0.0025-0.25％(w/v)胰蛋白酶，例如，0.025％胰蛋白酶中。在一些实施例中，可以将肝脏组织暴露于含有例如EDTA之类的螯合剂的溶液中的蛋白酶，螯合剂螯合例如Ca²⁺之类的二价金属离子，并破坏细胞对ECM的粘附。

在一系列暴露于去细胞化试剂的处理中，可以在暴露于洗涤剂之前，将肝脏组织暴露于蛋白酶。这会使通过蛋白酶与ECM分离的细胞或细胞物质通过洗涤剂从组织中洗掉。

在其他实施例中，可以不使用蛋白酶来去细胞化肝脏组织。

在一些实施例中，可以利用脱氧核糖核酸酶(DNA酶)来降解组织中的基因组结构和脱氧核糖核酸。合适的DNA酶是本领域已知的，包括DNA酶I。可以将肝脏组织暴露于1000-10000 KU DNA酶1中，例如，大约2000 KU DNA酶1。脱氧核糖核酸酶处理可以特别适用于使用例如脱氧胆酸钠之类的温和的洗涤剂的方法中。在一些实施例中，DNA酶可以在盐平衡溶液中，例如，1M NaCl。在其他实施例中，可以不使用脱氧核糖核酸酶来去细胞化肝脏组织。

在一些实施例中，可以不使用脱氧核糖核酸酶或蛋白酶来去细胞化肝脏组织。

洗涤剂使组织中的脂质和脂肪溶解，并促进细胞碎片从ECM中的去除。

洗涤剂可包括阴离子洗涤剂，例如十二烷基磷酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠(SdC)，以及Triton^TM X-200。例如，可以将肝脏组织暴露于0.01至5％SDS，例如，0.01-1％SDS；0.01至5％脱氧胆酸钠(SdC)，例如，大约4％脱氧胆酸钠；和/或0.01至5％Triton^TM X-200，例如，3％Triton^TM X-200。

洗涤剂可包括非离子洗涤剂，例如聚乙二醇和Triton^TM X100，例如，聚乙二醇p-(1,1,3,3-四甲基丁基)-二苯醚。例如，可以将肝脏组织暴露于0.01至5％Triton^TM X-100，或1至3％Triton^TM X-100，例如，3％Triton^TM X-100。

洗涤剂可包括两性离子洗涤剂，例如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)、硫代甜菜碱-10(3-(癸基二甲基铵)丙磺酸内盐)、硫代甜菜碱-16(正十六烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸内盐)，以及三(正丁基)磷酸酯。例如，可以将肝脏组织暴露于0.01至5％的两性离子洗涤剂，例如，0.01-1％的两性离子洗涤剂。

本领域已知有很多其他合适的洗涤剂，可从商业源(例如，美国，密苏里州，SigmaAldrich公司)获得。

在某些优选实施例中，可以在单独的步骤中将肝脏组织暴露于第一洗涤剂和第二洗涤剂。例如，方法可以包括(a)将组织暴露于阴离子洗涤剂，例如SDS，以及(b)将组织暴露于非离子型洗涤剂，例如Triton^TM X-100。

在一些实施例中，用于每一处理步骤中的去细胞化试剂的浓度可以逐步增大到最大值。例如，使用的洗涤剂的浓度可以逐步增大到最大值。初始洗涤剂浓度可以充分低，以避免堵塞肝脏组织中的血管的细胞物质的聚集物或块的形成。在初始洗涤剂处理之后，将洗涤剂的浓度提高，以有效地去除所有细胞物质。

因此，步骤(iii)可以包括将肝脏组织暴露于浓度逐渐地提高的洗涤剂。优选地，当重复步骤(iii)时，使用最高浓度。例如，可以将肝脏组织暴露于0.005％-0.02％SDS，例如，大约0.01％SDS，接下来是暴露于0.05％SDS至0.2％SDS，例如，大约0.1％SDS，接下来是暴露于0.5％SDS至2％SDS，例如，大约1％SDS。

随后的洗涤剂处理步骤(即，步骤iii的重复)可以使用0.5％SDS至2％SDS，例如，大约1％SDS。

在某些优选实施例中，可以通过利用试剂灌注组织，将肝脏组织暴露于去细胞化试剂。优选地，在逆行的方向，而不是在顺行的方向，灌注肝脏组织。

用于在体外进行组织灌注的合适的技术是本领域已知的。例如，可以通过将插管插入到血管、管道或空腔中，例如，腔静脉或肝静脉中，准备肝脏组织以进行灌注。然后，可以通过插管术，利用去细胞化试剂，灌注被插管的组织。

在优选实施例中，利用去细胞化试剂对肝脏组织的灌注的速率不是恒定的。例如，对组织的灌注的初始速率可以低(例如，<0.99ml/min/g组织)，以避免对肝脏组织的结构破坏。在去细胞化的过程中，随着步骤(iii)至(v)的重复，肝脏组织变得不太能抵御灌注，提高灌注速率(例如，>1ml/min/g组织)。这会增大组织中的流体切应力。

优选地，在暴露于去细胞化试剂的两个或更多循环中，将灌注速率逐步地提高到最大值(补偿阶段)，然后，保持在此最大值或此最大值附近(稳定阶段)。在一些实施例中，可以首先以0.1-1.99ml/min/g组织的流速，例如，0.5至1.5ml/min/g，利用去细胞化试剂灌注组织，并逐步地提高到2-20ml/min/g组织，例如，2-8ml/min/g。在其他实施例中，可以首先以0.01-0.99ml/min/g组织的流速，例如，0.5至1.5ml/min/g，利用去细胞化试剂灌注组织，并在5至10天内，优选地，大约9天，逐步地提高到1-10ml/min/g组织，例如，2-8ml/min/g。

可利用每一去细胞化试剂灌注肝脏组织，每克实体组织大约0.004小时至大约5小时(对于>40克的组织样本)，或每克实体组织大约2小时至大约12小时(对于<40克的组织样本)。

例如，如此处所描述的去细胞化可用1-60天，例如，7-60天，取决于肝脏组织的初始质量。

利用不同的去细胞化试剂灌注组织的顺序可以变化，取决于在去细胞化的过程中，利用每一试剂灌注肝脏组织至少一次，至少两次或至少三次。

暴露于不同的洗涤剂的顺序基于它们的不同的作用机理。机械破坏(第一步骤)促进强烈的细胞破碎。暴露于低渗溶液(第二步骤)在冲洗细胞物质时，增强细胞裂解。然后，可任选地将肝脏组织暴露于蛋白水解酶(第三步骤)以去除附着于ECM的细胞物质。最后，将肝脏暴露于不同的洗涤剂中(第四步骤)，以有效地冲洗掉细胞物质。可以以流速的函数重复该四个步骤。

步骤(i)的机械破坏促进人类组织内的强烈的细胞破碎。通常，步骤(i)在去细胞化开始时执行一次，但是，在一些实施例中，可以在去细胞化过程中，引入HIFU或超声介导的机械破坏多于一次。由机械破坏所引起的细胞裂解通过步骤(ii)中的渗透应力增强。暴露于渗透溶液还将细胞碎片从组织中洗掉。然后，可任选地，在步骤(iii)中，将肝脏组织暴露于DNA酶，或优选地，蛋白水解酶，以去除附着于ECM的细胞物质。最后，在步骤(iv)中，将肝脏暴露于一种或多种洗涤剂，以从组织中冲洗掉细胞物质。可以利用增大的流体切应力，重复步骤(iii)至(iv)一次或多次。

在一些实施例中，方法可以包括通过向肝脏组织灌注，按以下顺序，重复步骤(iii)至(v)：(iii)、(iv)、(iii)、(iv)(v)、[(iii)、(v)]_n、(iii)、(iv)、[(iii)、(v)]_n，其中，n是1至25。在表1中示出了合适的灌注去细胞化方案。可任选地，在该方法中，步骤(ii)还可以重复一次或多次。

可以向肝脏整体或其功能单元灌注去细胞化试剂，以生成匹配源组织大小和结构的ECM支架。在一些实施例中，随后可以利用细胞重新增殖此支架，以获得例如适于直接移植到人类体中的功能正常的肝组织。

在一些实施例中，肝脏组织可以是病理的。利用去细胞化试剂向病理的肝脏组织的灌注，可以用于，例如，生成可以利用细胞重新增殖以进行3D疾病建模的ECM支架。

在其他优选实施例中，可以通过将组织浸入试剂中，并，例如，在旋转式搅拌机上对它进行搅动，将人类肝脏组织暴露于去细胞化试剂。

可以在去细胞化试剂中搅动肝脏组织的切片或样本，以生成小规模地再现3D人类微环境的复杂性的支架，用于肝脏疾病的建模。样本可以是正常的或病理的肝脏组织。合适的样本宽度/长度或直径范围可以在0.2-2cm或0.2-1.0cm之间。例如，样本可以是大致5mm宽的切片或方块，在本文中称为“肝脏组织方块”(LTC)。

可以根据标准技术，使用组织切块机、针吸活检，打孔活检或通过对人类肝实质的切片或方块的简单解剖刀切割，获取用于通过搅动方案来去细胞化的肝脏组织样本。

搅动浸于去细胞化试剂中的肝脏组织可以对它施加流体切应力。合适的搅动可包括旋转摇动，例如，在旋转式搅拌机或磁力搅拌器中，以100-1000rpm，优选地，大约900rpm的速度。

在一些实施例中，可以对被搅动的组织进行下列各项的一个或多个循环的处理：

(a)使组织暴露于渗透应力试剂中，例如，低渗或高渗试剂中，

(b)使组织暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及

(c)使组织暴露于洗涤剂中，

其中，在每一循环中，(a)、(b)和(c)可以以任何顺序发生。

例如，可以对组织进行下列各项的一个或多个循环的处理：

(a)使组织暴露于低渗试剂中，

(b)使组织暴露于洗涤剂中，以及

(c)使所述组织暴露于DNA酶中，

例如，可以执行1至25个循环。

可以将组织暴露于例如水之类的低渗试剂中，达12至36小时，优选地，大约24小时。可以在4℃将组织暴露于低渗试剂中。

可以将组织暴露于例如SdC，例如4％SdC之类的洗涤剂中，达4至12小时，优选地，大约6小时。可以在环境温度下将组织暴露于洗涤剂中。

可以将组织暴露于DNA酶中，达大约3小时。可以在环境温度下将组织暴露于DNA酶中。例如，可以在1M NaCl中，将组织暴露于2000KU DNA酶1中。

方法还可以进一步包括在暴露于上文提出的去细胞化试剂中的任何一种之后，将组织暴露于清洗液中。可以在上述步骤中的一个或多个之间和/或在循环之间，例如，在步骤(a)和(b)之间，在步骤(b)和(c)之间和/或在步骤(c)之后和在任何循环重复之前，洗涤组织。例如，可以在环境温度下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或补充有抗生素-抗真菌剂的PBS冲洗组织达5至30分钟，优选地，大约5分钟。合适的抗生素-抗真菌剂是本领域已知的。

在其他实施例中，可以对组织进行下列各项的一个或多个循环的处理：

(a)使组织暴露于例如水之类的低渗试剂中，

(b)使组织暴露于例如胰蛋白酶之类的蛋白酶中，优选地，在dH2O(去离子水)中。

(c)使组织暴露于第一洗涤剂中，例如，如SDS之类的阴离子洗涤剂，

(d)使组织暴露于第二洗涤剂中，例如，如Triton^TM X-100之类的离子型洗涤剂。

可以在环境温度下将组织暴露于例如水之类的低渗试剂中，达15至30分钟。

可以在环境温度下，将组织暴露于蛋白酶中，例如，dH₂O(去离子水)或EDTA中的0.025％胰蛋白酶，达12至36小时。

可以在环境温度下将组织暴露于第一洗涤剂中，例如，0.01-1％SDS，达12至96小时。

可以在环境温度下将组织暴露于第二洗涤剂中，例如，0.01-3％Triton^TM X100，达12至72小时。

在上述步骤中的一个或多个步骤之间和/或在多个循环之间，可以洗涤组织。可以在上述步骤中的一个或多个步骤之间和/或在多个循环之间，例如，在步骤(a)和(b)之间，在步骤(b)和(c)之间，在步骤(c)和(d)之间，和/或在步骤(d)之后和在任何循环重复之前，洗涤组织。例如，可以在环境温度下用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或补充有抗生素-抗真菌剂的PBS冲洗组织达5分钟至3小时，例如，30分钟至1小时。

例如，方法可以包括对被搅动的组织进行下列各项的一个或多个循环的处理：

(a)使组织暴露于去离子水中，

(b)在PBS中洗涤组织，

(c)使组织暴露于SdC中，

(d)在PBS中洗涤组织，

(e)使组织暴露于DNA酶中，以及

(f)在PBS中洗涤组织。

可以重复步骤(a)至(f)4-8次，优选地，大约4次。

可以通过定轨振荡器以600-1200rpm，例如，大约900rpm；或通过磁力搅拌器以150-600rpm，例如，300-400rpm，提供合适的搅动。

在一些实施例中，可以在步骤(a)之前交替地将组织暴露于水和葡萄糖溶液中，达4-12小时，例如，8小时。

在其他实施例中，上文所描述的方法还可以进一步包括：

(f)将组织暴露于例如9％盐水之类的高渗试剂中。

暴露于去细胞化试剂的每一循环的持续时间可以是2-3天。使用搅动方案来去细胞化支架的总时间可以是2.5-25天，例如，大约8天。

在去细胞化之后，可以，例如，通过暴露于消毒试剂中，对支架进行消毒。合适的消毒试剂包括γ辐射、电解水和化学试剂，例如过氧乙酸。可以将支架暴露于0.01％过氧乙酸和4％乙醇中，例如，达30分钟至2小时。

如此处所描述的，可以利用消毒试剂灌注支架，或将其浸于消毒试剂中并进行搅动。

在去细胞化和消毒之后，可以测试肝脏支架，例如，是否不存在细胞和/或存在ECM成份，例如胶原质、层粘连蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖、透明质酸、粘连蛋白、生长因子和细胞外蛋白酶。

包括宏观可视化、显微术和免疫组织化学技术的合适的技术是本领域已知的。

去细胞化的人类肝脏支架可能在组织切片中缺少使用标准组织染色方法可检测的肌丝、内皮细胞、平滑肌细胞，以及细胞碎片和核。

如此处所描述的生产的去细胞化的人类肝脏支架保留了源肝脏组织的3D器官形态和结构以及ECM生物活性。

在一些实施例中，通过上文所描述的方法生产的去细胞化的肝脏支架的结构和形态可以通过电子显微技术确认。

取决于源组织，肝脏支架可以包括正常的ECM或可以是疾病改变的ECM。例如，肝脏支架可以包括一个或多个肝脏疾病或病理特有的一种或多种结构变化。

人类肝脏支架允许在支架中培养的细胞的有效附着、迁移、增殖和三维组织。去细胞化的人类肝脏支架还可以提供生物活性分子和生物感应属性，这些属性维持细胞表现型和功能属性，并促进组织特异性基质的产生。

在如此处所描述的去细胞化的人类肝脏支架的产生之后，方法可以包括利用细胞重新增殖支架以产生人工肝脏组织。

合适的细胞包括人类原代和细胞系肝细胞(例如，肝脏星形细胞、枯否细胞、肝窦细胞)、原代肝细胞、内皮细胞、iPSC(诱导性多能干细胞)或源自病人特定iPSC的细胞，胚胎干细胞(hESC)、间充质干细胞(hMSC)、源自肝细胞的间充质干细胞(HDMSC)胎儿干细胞(例如，羊水干细胞和胎儿肝细胞)、癌细胞和内皮祖细胞(EPC)。

在一些实施例中，可以利用从病人获取的自体人类细胞重新增殖去细胞化的人类肝脏支架，例如，以产生人工肝脏组织，用于植入到病人体中。在其他实施例中，可以利用异源的人类细胞，即，源自不同的人类个体的细胞，重新增殖去细胞化的人类肝脏支架，例如，以产生人工肝脏组织，用于植入到病人体中。在一些实施例中，在植入之前，可以筛选异源的人类细胞，以检查与病人的免疫相容性。

可以通过利用在支架之内接种细胞，并在适合的条件下培养，重新增殖去细胞化的支架。例如，可以将细胞直接注入到去细胞化的支架的实质中；通过主要血管通路，灌注；和/或滴落到去细胞化的支架的表面上。

本发明的其他方面使用上文所描述的方法，加以必要的变更，提供来自例如非人类灵长类动物、猪、羊、马或奶牛之类的非人类动物的肝脏组织的去细胞化，以产生非人类肝脏支架。如上文所描述的，可以利用人类细胞再增殖非人类支架，以产生在非人类ECM支架内包括人类细胞的人工肝脏组织。这可以用于产生人工肝脏组织，用于植入到病人体中。

在一些实施例中，可以分割如此处所描述的产生的去细胞化的人类肝脏支架或人工肝脏组织，以去除例如管道和血管之类的一种或多种肝脏组织结构。可以可任选地利用如上文所描述的细胞重新增殖从去细胞化的人类肝脏支架去除的结构。从肝脏支架或组织去除的结构可以用于移植，例如，治疗如下面所描述的疾病，或疾病建模。

本发明的其他方面提供上文所描述的方法产生的人类肝脏支架或人工肝脏组织。

如此处所描述的产生的人类肝脏支架是非细胞的，并显示源肝脏组织的细胞外基质孔隙结构和形态。从多脂源肝脏组织产生的人类肝脏支架表现出源组织特有的增大的脂质含量。从纤维化的源肝脏组织产生的人类肝脏支架表现出源组织特有的增大的ECM成份。

支架或组织可以用于疾病建模。如上文所描述的，合适的支架可以来源于正常的肝脏组织或病理的肝脏组织。

一种疾病建模的方法，可以包括：

提供如上文所描述的产生的人类肝脏支架或人工人类肝脏组织，

确定化合物、药物、生物制剂、设备或治疗干预对支架或组织或其中的细胞的影响。

此处所描述的方法可以用于建模肝脏疾病或影响肝脏的疾病，例如肝脏纤维化、肝癌和转移、肝脏药物毒性、移植后免疫响应，以及自身免疫肝炎。

生物制剂可包括例如HBV和HCV之类的病毒。

去细胞化的肝脏支架可以用于对肝脏疾病的诊断。合适的支架可以来源于来自被怀疑患有肝脏疾病的个体的肝脏组织。

一种诊断人类个体的肝脏疾病的方法可以包括：

从个体提供如上文所描述的产生的肝脏支架的样本

确定样本中的一种或更多种肝脏支架蛋白质的存在和量。

样本中的肝脏支架蛋白质的存在和量可以指示个体中肝脏疾病的存在。

支架或组织可以用于治疗，例如，用于个体的肝脏组织的替换或补充。

治疗肝脏疾病的方法可以包括：

将如上文所描述的产生的人类肝脏支架或人工人类肝脏组织植入到有需要的个体中。

植入的支架或组织可以替换或补充个体的现有的肝脏。

本发明的另一方面提供如上文所描述的产生的人类肝脏支架或人工人类肝脏组织，用于对个体的肝脏疾病或机能障碍的治疗中。

例如，人类肝脏支架或人工人类肝脏组织可以被植入个体的身体中，以再生完整的新肝脏或改善损伤的肝脏的修复，或可以从身体外面支持个体的肝功能。

本发明的其他方面，使用上文所描述的方法，加以必要的变更，提供人类胰腺组织的去细胞化，以产生人类胰腺支架。如上文所描述的，可以利用人类细胞再增殖人类胰腺支架，以产生在人类ECM支架内包括人类细胞的人工胰腺组织。这可以用于产生人工胰腺组织，用于植入到病人体中。

例如，本发明的另一方面提供生产人类胰腺支架的方法，包括

(i)提供人类胰腺组织，

(ii)以机械方式破坏组织中的细胞，

(iii)对组织中的所述细胞施加渗透应力，

(iv)使组织暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及

(v)使组织暴露于洗涤剂中，以及

(vi)重复步骤(iii)、步骤(iv)和步骤(v)，以及可任选地，步骤(ii)中的每一个步骤一次或多次，

由此，生产人类胰腺支架。

可以根据上文对于肝脏支架所描述的方法中的任何一种，产生人类胰腺支架，只是术语“肝脏”和“肝脏的”替换为“胰腺”和“胰腺的”。

通过上文所描述的方法产生的去细胞化的人类胰腺支架可以利用细胞重新增殖，以产生人工胰腺组织。

本发明的各方面提供通过此处所描述的方法产生的去细胞化的人类胰腺支架和人工胰腺组织。

人类胰腺支架和人工胰腺组织可以用于疾病建模，如上文对于肝脏支架和组织所描述的诊断和治疗的方法，加以必要的变更。

本发明的另一方面提供生物反应器，包括：

如上文所描述的产生的人类肝脏支架；

用于将培养基引入到支架中的输入管道；以及

用于将培养基从支架中引出的输出管道。

优选地，利用人类细胞接种肝脏支架，用于支架的重新增殖。这可以用于产生人工肝脏组织。

上文描述了用于接种支架的合适的细胞。

生物反应器还可以进一步包括培养基贮器。输入管道可以是可连接或适用于连接到贮器，以便利用来自贮器的培养基灌注生物反应器中的支架，以便允许通过被接种到支架中的细胞，重新细胞化支架。

生物反应器还可以进一步包括用于容纳肝脏支架的组织腔。

支架可以被包含在生物反应器中的合适的培养基中。

组织腔中的肝脏支架和贮器中的培养基可以在含氧量正常的条件下保持在37℃，以允许再增殖。

生物反应器还可以进一步包括一个或多个传感器，用于确定或监测当支架在利用接种的细胞重新增殖时支架中的肝功能的存在或量。

本发明的另一方面提供生物反应器，包括：

如上文所描述的产生的人工人类肝脏组织；

用于将血引入到人工人类肝脏组织中的输入管道；以及

用于将血从人工人类肝脏组织中引出的输出管道。

优选地，生物反应器是身体外的。

输入和输出管道可以是可连接的或适用于连接到个体的血管系统，以便利用个体的血灌注生物反应器中的人工人类肝脏组织，以便向个体提供肝功能，例如，以减少由内生的肝功能的丢失所引起的毒素的积聚。

生物反应器还可以进一步包括用于容纳人工人类肝脏组织的组织腔。

人工人类肝脏组织可以被包含在生物反应器中的合适的培养基中。

本发明的另一方面提供适用于使用上文所描述的方法来产生人类肝脏支架的去细胞化系统和装置。

去细胞化系统可以包括：

去细胞化设备，包括

用于容纳用于去细胞化的人类肝脏组织的组织腔，以及

三个或更多试剂贮器，用于容纳用于引入到组织腔中的去细胞化试剂。

试剂贮器可以可操作地连接到组织腔，以便来自贮器的试剂可以被引入到腔中。

试剂贮器可以包含低渗试剂、蛋白酶和/或DNA酶以及洗涤剂。

组织腔可以包含肝脏组织。

在一些实施例中，系统还可以进一步包括适用于从人类肝脏样本产生肝脏组织切片并将它们装入去细胞化器的组织腔中的采样机。

去细胞化设备还可以进一步包括一个或多个泵，用于将去细胞化试剂从试剂贮器中驱动到组织腔中，并可任选地从组织腔中去除去细胞化试剂。

腔可以包括用于引入去细胞化试剂的入口和用于去除试剂的出口。

在一些实施例中，可以将组织腔中的人类肝脏组织浸于通过入口从贮器被引入到腔的去细胞化试剂或生理溶液中。在暴露于去细胞化试剂之后，根据此处所描述的去细胞化方案，可以通过出口去除试剂，并进一步将去细胞化试剂引入到腔中。系统还可以进一步包括搅拌器，用于搅动浸于组织腔中的去细胞化试剂中的人类肝脏组织。

在其他实施例中，可以利用来自试剂贮器的去细胞化试剂在逆行的方向灌注组织腔中的人类肝脏组织。可以根据此处所描述的去细胞化方案，连续地向组织中灌注多种去细胞化试剂。在灌注过程中，可以将肝脏组织浸于生理溶液或培养基中。

去细胞化设备可以包括至少一个插管设备，用于向组织腔中的肝脏组织插管，以允许在逆行的方向进行灌注。合适的插管设备可以包括大小合适的空心管，用于引入到人类肝脏组织的血管、管道，和/或空腔中。通常，一个或多个血管、管道，和/或空腔被插入在组织腔中的组织中。在一些实施例中，设备可以包括入口插管设备，用于将去细胞化试剂引入到肝脏组织中，以及出口插管设备，用于从肝脏组织引出去细胞化试剂。

去细胞化设备还可以进一步包括用于通过导管向肝脏组织灌注的灌注器。灌注器可包括用于通过一个或多个导管，以及管子，通过人类肝脏组织从贮器中移动去细胞化试剂的机构(例如，泵、气压、重力)，适配器和/或用于利用来自试剂贮器的去细胞化试剂，灌注组织腔中的被插管的肝脏组织的连接器。

插管和灌注是本领域已知的技术。

去细胞化设备可以适用于为组织腔中的肝脏组织维持无菌的环境。在去细胞化过程中，可以使用本领域已知的各种技术，维持无菌，例如控制和过滤气流和/或利用，例如，抗生素、抗真菌剂或其他抗微生物剂来灌注，以防止不希望有的微生物的生长。合适的抗微生物的化合物是本领域已知的。

去细胞化设备可以适用于监测某些灌注特征(例如，压力、容积、流动模式、温度、气体、pH)、机械力(例如，心室壁运动和应力)。例如，系统可以包括监测系统(例如，生物反应器)和/或肝脏组织的传感器。可以使用传感器来监测在插管的肝脏组织中流动的液体的压力；系统中的环境温度和/或肝脏组织的温度；在插管的肝脏组织中流动的液体的pH和/或流速；和/或重新细胞化肝脏组织的生物活性。除具有用于监测这样的特征的传感器之外，用于去细胞化和/或重新细胞化肝脏组织的系统可以包括用于维持或调整这样的特征的控件。

控件可包括组件，例如温度计、恒温器、电极、压力传感器、溢流阀、用于打开和关闭至去细胞化试剂的液体连接并改变流体速率和流向的阀门。

为帮助确保稳定条件(例如，温度)，腔、贮器和管子可以是水套的。

用于生成人类肝脏支架的系统可以通过可编程处理器来控制。例如，处理器可以接收和处理来自传感器中的一个或多个传感器的信息。处理器可以将信息以及指令传输回生物反应器和/或肝脏组织。

可以将处理器修改或编程为根据如此处所描述的去细胞化方法，基于肝脏组织的重量和内电阻，对于该特定肝脏组织，计算每一种去细胞化试剂的暴露时间和灌注压力。处理器可以通过系统中的一个或多个泵和/或阀门控制，改变去细胞化试剂和改变灌注压力。处理器可以记录对于每一个去细胞化步骤的预负荷和后负荷(分别是灌注之前和之后的压力)以及流速。

系统可以适用于监测正在接受去细胞化的肝脏组织的生物活性。例如，可以监测肝脏组织的机械活动、机械压力，和/或壁应力。

考虑到本公开，本发明的各种进一步的方面和实施例对本领域技术人员是显而易见的。

本发明的其他方面和实施例提供上文所描述的方面和实施例，术语“包括”替换为术语“由......组成”，以及上文所描述的方面和实施例，术语“包括”替换为术语“基本上由......组成”。

应当理解，本申请公开了上文所描述的上述方面和实施例中的任何一种的所有组合，除非上下文要求别的。类似地，本申请公开了优选的和/或可选的特征的所有组合，无论是单独地还是与其他方面的任何一个方面一起，除非上下文要求别的。

对上述实施例的修改，进一步的实施例以及对其修改对本领域技术人员在阅读本发明之后是显而易见的，如此，这些都在本发明的范围内。

在本说明书中所提及的所有文件和序列数据库条目都为各种目的，以引用的方式并入本文中。

此处所使用的“和/或”被理解为两个指定的特征或组件中的每一个的特定的公开，有或者没有另一个。例如，“A和/或B”理解为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一项的特定的公开，就如同每一项都是在本文中分别地陈述一样。

现在将通过示例并参考下面所描述的图形，说明本发明的某些方面和实施例。

图1示出了相对于去细胞化过程的14天内灌注的不同阶段的流速(以ml/min为单位)。

图2示出了在去细胞化之前的125mm³肝脏组织方块(LTC)。

图3示出了自然组织和在4个去细胞化循环之后去细胞化的LTC(dLTC)的组织学比较。H&E(苏木精和曙红)染色示出了在LTC去细胞化之后细胞的去除，SR(天狼星红)染色示出了胶原质的保留(红色)和细胞材料(黄色)的去除。

图4示出了在去细胞化之后胶原质(顶部)和DNA(底部)的定量测量。在不同的搅动速度(900C1-900C4)之后的胶原质的量化表现出了当与新鲜组织相比时胶原质的量的保留。去细胞化是有效率的，在1个处理循环之后(底部)DNA含量已明显地下降(p<0.01)。

图5示出了具有人类肝脏星状细胞系LX2的人类肝脏支架的再增殖。H&E染色示出了当比较在重新细胞化之后第1天与第21天时渐进的LX2细胞迁移到LTC支架中(上方组)。再增殖的过程的特征在于：利用增殖标记物Ki67的免疫染色检测到的显著的细胞增殖(下方组)。

图6示出了在利用LX2再增殖14天之后总的细胞计数的增大。重要的是，人类肝脏支架中的总的细胞计数在14天和21天之间显著增大(LH组)。KI67免疫组织化学示出了85％以上的细胞在所有不同的时间点增殖(RH组)。

图7示出了利用人类肝细胞癌细胞系SK-Hep的去细胞化的人类肝脏支架的再增殖。H&E和HVG(苏木精范吉森)染色示出了在生物工程1天之后细胞的附着以及当比较在重新细胞化之后第1天与14天时渐进的细胞迁移到人类肝脏支架中。

图8示出了带有抗人Nanog(右)和同种型对照(左)SK-Hep的FACS染色。

图9示出了在1和7天之后利用人类肝细胞癌细胞系SK-Hep对去细胞化的人类肝脏支架的再增殖。通过免疫组织化学来分析Nanog表达。显然，在第一天附着于ECM的细胞和在第7天在支架内迁移的细胞是Nanog阳性细胞。

图10示出了在14天之后利用人类肝细胞癌细胞系SK-Hep对去细胞化的人类肝脏支架的再增殖。通过免疫组织化学来分析Nanog表达(棕色)，细胞用苏木精(蓝色)复染色。在14天之后再增殖的过程是通过Nanog阳性和Nanog阴性细胞来表征的(底部)。值得注意的是，在此阶段，Nanog阳性细胞环绕重新增殖的支架(顶部)，特征类似于人类肝细胞癌的发展。

图11使用两个不同的光背景，示出了去细胞化的人类肝脏左叶的宏观外观，以突出显示血管树的保留。

图12示出了去细胞化的血管的(门静脉、肝动脉和肝门板)和胆道树的组织切片。H&E示出了在去细胞化的组织中不存在细胞。SR和EVG染色分别示出了胶原质(红色)和弹性蛋白(蓝色)的保留。

图13示出了新鲜的肝脏组织和去细胞化的人类肝脏左叶段(S1、S2、S3和S4)的组织学比较。H&E染色示出了在去细胞化之后细胞的去除，SR和EVG(弹性范吉森)染色分别示出了胶原质(红色)和弹性蛋白(蓝色)的保留。

图14示出了利用人类肝脏星状细胞系LX2的人类肝脏支架的再增殖。H&E和HVG染色示出了在生物工程1天之后的细胞附着以及当比较在重新细胞化之后第1天与14天时渐进的细胞迁移到人类肝脏支架中。

图15示出了包括由典型的小叶结构包围的肝门束的低放大倍数(90x)SEM图像。

图16示出了确认支架非细胞性并清楚地定义了曾经被肝细胞占据的空间(即，无肝细胞的空间)的300x SEM图像。

图17示出了高放大倍数(2500x)SEM图像，示出了构建出无肝细胞的空间的保留得极好的结缔组织纤维的三维网络。

缩略语：SdC脱氧胆酸钠；PBS/AA PBS+抗生素抗真菌素；T/E 0.025％胰蛋白酶/EDTA 0.025％；SDS十二烷基硫酸钠；TX100 Triton X 100；RT室温；PAA过氧乙酸；EtOH乙醇。

1.方法

1.1人类肝脏采集和插管

根据对于移植的标准方法，肝素化不适合用于肝脏移植的丢弃的人类肝脏器官(DHLO)。通过0.2-1.0cm的小非血管化肝脏单元(肝脏组织方块，LTC)的多个块细分，和/或通过血管胆道蒂的单元的分段的或子分段的准备，充分地准备DHLO。人类肝脏整体或者，可另选地，左叶(段2-3-4±1)、右叶(段5-8)或左侧肝脏(段2-3±1)以及肝脏组织方块(LTC)在-80℃冻结，达至少24小时，以促进细胞裂解。

1.2人类肝脏左叶整体的灌注去细胞化

首先，在4℃，在PBS中将整个人类肝脏叶瓣解冻一夜。其次，腔静脉或肝静脉被插入了导管，以启动逆行的灌注系统。

最后，应用5CDF，以实现完全的器官去细胞化，如表1、2和图1所示。采用两个灌注阶段：a)急剧地增大流速以补偿阻力b)随着去细胞化的进行，稳定流速。在图1中示出了流速的两个阶段。

1.3人类LTC的搅动去细胞化

在37℃，解冻LTC达1-1.5h。在表3至5中示出了LTC的去细胞化的方案。

2.结果

在4个去细胞化循环之后，在组织学上比较自然肝脏组织和去细胞化的LTC(dLTC)。发现去细胞化循环从LTC中去除了细胞和细胞物质，同时保留了胶原质(图3)。

在去细胞化之后，在dLTC中量化胶原质和DNA。当与新鲜的组织(900C1-900C4)相比时(图4顶部)，发现dLTC中的胶原质的量在不同的搅动速度时被保留。去细胞化是有效率的，在仅仅1个处理循环之后(图4底部)DNA含量明显地下降(p<0.01)。

利用人类肝脏星状细胞系LX2重新增殖去细胞化的人类LTC。发现LX2细胞在重新细胞化之后在21天内逐步地迁移到LTC支架(图5上方组)。发现人类肝脏支架中的总的细胞计数在利用LX2再增殖的14天之后增大，并在14和21天之间显著增大(图6LH组)。对于增殖标记物Ki67的免疫染色示出了，再增殖的过程由显著的细胞增殖来表征(图5下方组)，在所有不同的时间点，85％以上的细胞增殖(图6RH组)。

利用人类肝细胞癌细胞系SK-Hep重新增殖去细胞化的人类肝脏支架。观察到在生物工程1天之后细胞的附着，在重新细胞化之后的14天内，SK-Hep细胞逐步地迁移到人类肝脏支架(图7)。在第一天附着于ECM的细胞和在第7天在支架内迁移的细胞被示为Nanog阳性细胞(图8和9)。在14天之后再增殖的过程由Nanog阳性和Nanog阴性细胞来表征(图10)。值得注意的是，在14天之后，发现Nanog阳性细胞环绕重新增殖的支架，特征类似于人类肝细胞癌的发展(图10；上方组)。

发现人类肝脏左叶的血管树在去细胞化之后保留(图11)。发现去细胞化的组织中没有细胞，同时胶原质和弹性蛋白被保留(图12)。

新鲜的肝脏组织和去细胞化的人类肝脏左叶段(S1、S2、S3和S4)的比较确认了在去细胞化之后的细胞的去除和胶原质和弹性蛋白的保留(图13)。

利用人类肝脏星状细胞系LX2重新增殖去细胞化的人类肝脏左叶段。发现在1天之后LX1细胞附着于去细胞化的支架，并在14天内逐步地迁移到支架中(图14)。

通过扫描电子显微术来分析去细胞化的人类肝脏支架。SEM图像确认了支架非细胞性，并示出了清楚地定义的曾经被肝细胞占据的空间(即，无肝细胞的空间)的存在。发现构建无肝细胞的空间的结缔组织纤维的三维网络，以及肝门束和小叶结构被极好地保留(图15-17)。

表1

表2

时间	试剂	温度	rpm
				24h	dH20	4℃	900
4-6h	SdC 4％	RT	900
				5min	PBS	RT	900
3h	Dnase	RT	900
				5min	PBS/AA	RT	900

表3

时间	试剂	温度	rpm
				12-36h	dH2O	4℃	100-1000
4-12h	SdC4％	RT	100-1000
				5-30min	PBS	RT	100-1000
3h	Dnase	RT	100-1000
				5-30min	PBS/AA	RT	100-1000

表4

时间	试剂	温度	rpm
				15-30min	dH20	RT	100-1000
12-36h	T/E 0.025％	RT	100-1000
				12-72h	SDS 0.01-1％	RT	100-1000
12-72h	TX100 3％	RT	100-1000
				5-30min	PBS/AA	RT	100-1000

表5

表6

Claims (39)

1.一种生产人类肝脏支架的方法，包括：

(i)提供人类肝脏组织，

(ii)以机械方式破坏所述组织中的细胞，

(iii)对所述组织中的所述细胞施加渗透应力，

(iv)使所述组织暴露于蛋白酶和/或DNA酶中，以及

(v)使所述组织暴露于洗涤剂中，以及

(vi)通过灌注所述肝脏组织，按以下顺序重复步骤(iii)至(v)：(iii),(iv),(iii),(iv),(v),[(iii),(v)]_n,[(iii),(v)]_n，其中，n单独为1至25，

由此生产人类肝脏支架，

其中，在步骤(iii)至(vi)中，对所述人类肝脏组织施加通过对所述人类肝脏组织在逆行方向上进行灌注生成的流体切应力，其灌注速率从初始值0.1-0.99ml/min/g组织逐渐提高到最大值2-20ml/min/g组织，然后保持。

2.根据权利要求1所述的方法，其中通过灌注所述肝脏组织，按以下顺序重复步骤(iii)至(v)：(iii),(iv),(iii),(iv),(v),[(iii),(v)]_n,[(iii),(iv)],[(iii),(v)]_n，其中，n单独为1至25。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(ii)被重复一次或多次。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述肝脏执行包括步骤(iii)、(iv)和(v)中的一个步骤，两个步骤或所有三个步骤的多个循环的处理。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述肝脏执行包括步骤(ii)的多个循环的处理。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝脏组织是正常的肝脏组织。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝脏组织是病理肝脏组织。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述病理肝脏组织表现出与急性肝病或慢性肝病相关联的病理。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过对所述组织进行一轮或多轮冻融，以机械方式破坏所述细胞。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，通过对所述组织进行HIFU或超声处理，以机械方式破坏所述细胞。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述组织暴露于低渗试剂中，对所述肝脏组织施加渗透应力。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述低渗试剂是去离子水。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使所述组织暴露于高渗试剂中，对所述肝脏组织施加渗透应力。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述高渗试剂是水或盐水。

15.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(iv)中，使所述组织暴露于蛋白酶中。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述蛋白酶是胰蛋白酶或链霉蛋白酶。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(iv)中，使所述组织暴露于DNA酶中。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法不包括步骤(iv)。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述洗涤剂是阴离子洗涤剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述阴离子洗涤剂是十二烷基硫酸钠(SDS)或脱氧胆酸钠(SdC)。

21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述洗涤剂是非离子型洗涤剂。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述非离子型洗涤剂是聚乙二醇p-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚。

23.根据权利要求1所述的方法，其中，使所述人类肝脏组织暴露于非离子型洗涤剂和阴离子洗涤剂两者中。

24.根据权利要求1所述的方法，其中，利用每一去细胞化试剂，对所述肝脏组织进行灌注，每克实体组织0.004至4小时。

25.根据权利要求1所述的方法，其中，对所述肝脏组织执行如下表中提出的灌注方案。

26.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肝脏组织是整个肝脏或其功能单元。

27.根据权利要求1所述的方法，包括在去细胞化之后对所述支架进行消毒处理。

28.根据权利要求1所述的方法，包括利用细胞重新增殖所述支架以生产人工肝脏组织。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述细胞选自由人类原代和细胞系肝细胞、内皮细胞、人类iPSC、人类胚胎干细胞(hESC)、人类间充质干细胞(hMSC)、人类胎儿干细胞、人类癌细胞和人类内皮祖细胞(EPC)组成的组。

30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述细胞为人类原代肝细胞。

31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述细胞为源自病人特定iPSC的细胞。

32.通过根据权利要求1至27中的任何一项所述的方法生产的人类肝脏支架。

33.根据权利要求1至27中的任何一项所述的方法生产的人类肝脏支架在制备用于治疗肝脏疾病或机能障碍的药物中的应用，包括：

将所述人类肝脏支架植入到有需要的个体中。

34.用于对个体的肝脏疾病或机能障碍的治疗的根据权利要求1至27中的任何一项所述的方法生产的人类肝脏支架。

35.根据权利要求1至27中的任何一项所述的方法生产的人类肝脏支架在制备用于治疗肝脏疾病或机能障碍的药物中的应用，包括：

将通过根据权利要求28至31中任一项所述的方法生产的体外人类人工人类肝脏组织连接到有需要的个体的血管系统，以便所述个体的循环血流过所述组织并返回到所述个体。

36.通过根据权利要求28至31中任一项所述的方法生产的人工肝脏组织。

37.根据权利要求28至31中任一项所述的方法生产的人工肝脏组织在制备用于治疗肝脏疾病或机能障碍的药物中的应用，包括：

将人工人类肝脏组织植入到有需要的个体中。

38.用于对个体的肝脏疾病或机能障碍的治疗的根据权利要求28至31中任一项所述的方法生产的人工肝脏组织。

39.根据权利要求28至31中任一项所述的方法生产的人工肝脏组织在制备用于治疗肝脏疾病或机能障碍的药物中的应用，包括：

将通过根据权利要求28至31中任一项所述的方法生产的体外人类人工人类肝脏组织连接到有需要的个体的血管系统，以便所述个体的循环血流过所述组织并返回到所述个体。

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