CN107281551A - 冰冻法制备肝脏生物支架的方法 - Google Patents

冰冻法制备肝脏生物支架的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种冰冻法制备肝脏生物支架的方法。本发明包括以下步骤：(1)经离体肝脏的门静脉灌注含12.5U/mL肝素的磷酸缓冲盐溶液，以5mL/min的速度灌注10min；(2)将离体肝脏在‑80℃的条件下放置24h；(3)将冰冻肝脏在室温条件下解冻，将磷酸缓冲盐溶液以1mL/min的速度经门静脉灌注1h；(4)将1％的十二烷基硫酸钠溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注1h；(5)将1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液与0.1％的胰蛋白酶以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；(6)将磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；(7)将含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注20min，即得肝脏生物支架。本发明能够使制备的肝脏生物支架最大程度的保留肝脏细胞外基质成分，并可完全去除肝脏细胞。

Description

冰冻法制备肝脏生物支架的方法
技术领域
本发明涉及肝脏组织工程领域，具体涉及一种冰冻法制备肝脏生物支架的方法。
背景技术
目前，器官移植是治疗器官衰竭唯一有效的方法，对于合适器官移植的迫切需求远远超过可利用的器官数量。大量器官衰竭的患者因等待供体的时间过长，在等待的过程中结束了生命。因此，供体器官缺乏严重制约了器官衰竭患者的临床治疗，降低了患者的总体生存期。为了寻求其他替代治疗方法，以组织工程和再生医学为基础的研究显得尤为重要，使得将来为广大患者提供可供移植的实质性器官成为可能。
在终末期肝病的治疗中，肝脏供体来源不足严重制约了肝脏移植的发展。在肝脏替代治疗的研究中，肝脏生物支架的制备与应用拓宽了肝脏替代治疗的研究领域。肝脏生物支架的成功制备为将来向支架中植入肝脏细胞，形成表达完备肝脏功能的再细胞化肝脏具有重要意义。
目前传统的支架制备过程是在一定的物理条件下，经化学试剂浸泡或注入肝脏，以达到去除细胞成分，保留支架内细胞外基质和超微脉管结构，获得保留脉管网络的完整生物支架。此方法的关键在于最大程度地去除细胞和核性物质，最大程度地保留细胞外基质成分和超微脉管结构，降低其生物种属特异性。然而，目前传统的去细胞化生物支架的构建方法，尚难以满足以上要求。通过多途径改进制备方法，优化肝脏生物支架的生物学特性，这也是目前构建肝脏生物支架亟待解决的问题之一。
发明内容
为了改善上述问题，本发明的目的在于提供一种冰冻法制备肝脏生物支架的方法。
本发明通过下述技术方案实现：
冰冻法制备肝脏生物支架的方法，包括以下步骤：
(1)经离体肝脏的门静脉灌注含12.5U/mL肝素的磷酸缓冲盐溶液，其中，以5mL/min的速度灌注10min；
(2)将离体肝脏在-80℃的条件下放置24h；
(3)将冰冻肝脏在室温条件下解冻，然后将磷酸缓冲盐溶液以1mL/min的速度经门静脉灌注1h；
(4)将1％的十二烷基硫酸钠溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注1h；
(5)将1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液与0.1％的胰蛋白酶以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；
(6)将磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；
(7)将含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注20min，即得肝脏生物支架。
进一步地，步骤(7)还包括用含青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗肝脏表面。
再进一步地，每次灌注均是以肝下下腔静脉作为液体的出口。
更进一步地，每次灌注均采用在离体肝脏门静脉中置管的方式进行灌注。
另外，每次灌注均是在操作皿中完成。
本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明采用含12.5U/mL肝素的磷酸缓冲盐溶液可保持离体肝脏生物支架内外渗透压的一致性。合适浓度的肝素的抗凝作用可避免残余血液凝固阻塞微脉管结构，影响后期灌注。
(2)本发明将肝脏支架置于-80℃低温条件下24h，通过冻融过程促进细胞成分解离，加速后期去细胞过程。
(3)本发明采用1％的十二烷基硫酸钠溶液可溶解细胞膜上的脂质与蛋白，进而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，进入细胞后解聚细胞中的核蛋白。
(4)本发明采用1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液与0.1％的胰蛋白酶可有效地离断DNA与蛋白质之间的联系。
(5)本发明采用含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液可以有效抑制灌注过程中可能发生的微生物感染。
(6)本发明采用5mL/min的灌注速度可最大限度地去除细胞并减少对微脉管和细胞外基质的破坏，为反复研究后的结果。
综上所述，本发明采用上述特定的试剂以及灌注速度，不仅确保了整个制备过程的稳定性，而且能够使制备的肝脏生物支架最大程度的保留肝脏细胞外基质成分，并可完全去除肝脏细胞。
附图说明
图1为正常肝脏细胞与本发明的肝脏生物支架经H&E染色后的示意图。
图2为正常肝脏细胞与本发明的肝脏生物支架经Masson染色后的示意图。
图3为正常肝脏细胞与本发明的肝脏生物支架中DNA含量的对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
冰冻法制备肝脏生物支架的方法，包括以下步骤：
(1)经离体肝脏的门静脉灌注含12.5U/mL肝素的磷酸缓冲盐溶液，其中，以5mL/min的速度灌注10min；
(2)将离体肝脏在-80℃的条件下放置24h；
(3)将冰冻肝脏在室温条件下解冻，然后将磷酸缓冲盐溶液以1mL/min的速度经门静脉灌注1h；
(4)将1％的十二烷基硫酸钠溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注1h；
(5)将1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液与0.1％的胰蛋白酶以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；
(6)将磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；
(7)将含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注20min，并用含青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗肝脏表面，即得肝脏生物支架。
其中，上述每次灌注均是以肝下下腔静脉作为液体的出口；每次灌注均通过在离体肝脏门静脉中置管的方式进行灌注。另外，每次灌注均是在操作皿中完成。
值得说明的是，本实施例的离体肝脏是采用常规方法从大鼠体内取出的肝脏。虽然本实施例采用的是大鼠肝脏，但是本发明的方法还可以用于制备其他动物的肝脏生物支架，如：猪肝、猴肝等肝脏生物支架。
通过本发明的方法制得的肝脏生物支架与正常的肝脏细胞进行对比如图1～3所示，由图1可知，H&E染色后发现肝脏生物支架内部观察不到细胞核成分，完整保留了生物骨架结构；由图2可知，Masson染色后发现肝脏生物支架保留了细胞外基质(纤维蛋白、弹性蛋白等)成分；由图3可知，肝脏生物支架与正常肝脏内DNA含量具有显著性差异。
本发明的方法中所采用的物理条件和化学试剂能够完整洗脱肝脏内细胞及核性成分，且试剂灌注速度和灌注浓度可最大化地降低其与肝脏生物支架的作用时间，降低对生物支架结构蛋白和细胞外基质成分的破坏，最有效地保留了其生物完整性。因此，本发明制备的肝脏生物支架，在完全去除细胞的同时，可充分保留肝脏的细胞外基质。
按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种冰冻法制备肝脏生物支架的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)经离体肝脏的门静脉灌注含12.5U/mL肝素的磷酸缓冲盐溶液，其中，以5mL/min的速度灌注10min；
(2)将离体肝脏在-80℃的条件下放置24h；
(3)将冰冻肝脏在室温条件下解冻，然后将磷酸缓冲盐溶液以1mL/min的速度经门静脉灌注1h；
(4)将1％的十二烷基硫酸钠溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注1h；
(5)将1％的聚乙二醇辛基苯基醚溶液与0.1％的胰蛋白酶以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；
(6)将磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注2h；
(7)将含有青链霉素的磷酸缓冲盐溶液以5mL/min的速度经门静脉灌注20min，即得肝脏生物支架。
2.根据权利要求1所述的冰冻法制备肝脏生物支架的方法，其特征在于，步骤(7)还包括用含青链霉素的磷酸缓冲盐溶液冲洗肝脏表面。
3.根据权利要求1所述的冰冻法制备肝脏生物支架的方法，其特征在于，每次灌注均是以肝下下腔静脉作为液体的出口。
4.根据权利要求1所述的冰冻法制备肝脏生物支架的方法，其特征在于，每次灌注均采用在离体肝脏门静脉中置管的方式进行灌注。
5.根据权利要求1所述的冰冻法制备肝脏生物支架的方法，其特征在于，每次灌注均是在操作皿中完成。
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