WO2010139209A1

WO2010139209A1 - 用于获取全肝支架的试剂盒及全肝支架获取方法

Info

Publication number: WO2010139209A1
Application number: PCT/CN2010/071833
Authority: WO
Inventors: 高毅; 汪艳; 康玉占; 周焕城
Original assignee: 南方医科大学珠江医院
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2010-04-16
Publication date: 2010-12-09
Also published as: CN101564554A

Description

用于获取全肝支架的试剂盒及全肝支架获取方法

技术领域本发明涉及一种获取生物支架时使用的试剂盒，具体涉及用于获取全肝支架的试剂盒。本发明还涉及使用所述试剂盒获得全肝支架的方法。背景技术

当前，对终末期肝病（肝硬化，肝性脑病、肝癌）唯一有效的治疗方法只有肝脏移植。其他的方法如透析等虽然能延长人的生命，但是不能替代肝脏的所有功能，很难防止病情恶化。肝移植目前虽然在手术方面已相当成熟，但是存在供肝短缺及术后需要长期应用免疫抑制剂等问题，严重限制了肝移植在临床上的应用。因此，通过肝组织工程来緩解供体短缺的现状具有重要的现实意义。

肝脏组织工程中理想的支架材料应具有以下性质：连通的三维多孔结构和足够的孔隙率，有利于细胞生长、养分传输和代谢产物的排放；生物相容性好，降解性能合适，使得器官能够生长并逐渐代替支架；化学表面适合细胞的粘附、增殖和分化；机械性能与所植入的组织的要求相匹配；适合细胞附着的表面式样和结构；加载促进生长和功能形成的表面因子，以及合适的支架表面涂层。目前肝脏组织工程支架材料主要选自可降解高分子材料和天然基质材料，例如聚（乳酸 -羟基乙酸）共聚物（PLGA)、海藻酸钠、壳聚糖、胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸等以及其经过修饰后的材料。但是，现有的支架材料在机械强度、生物降解、模拟组织三维结构及血管化方面都存在缺陷。

Ata l a Anthony等在美国专利申请第 US2005/ 0249816号中公开了一种肝脏去细胞化的方法。去细胞化是将组织或器官上的细胞利用不同的方法洗脱下来，仅保留细胞外基质的技术。器官通过去细胞化后所得细胞外基质保留了原器官的内部三维支架结构，且具有较好的生物相容性，可作为组织工程支架材料。该方法通过机械手段和化学手段来实现，主要的步驟包括：机械搅动或震荡离体肝脏使其内的细胞膜破裂，然后用细胞裂解液浸泡或灌注肝脏使细胞分离脱落，最后用灌洗液沖洗肝脏中脱离的细胞，其中细胞裂解液可以是含有去污剂的碱性溶液，如含 0.5%Triton X-100的氨溶液，所述的灌洗液可以是蒸馏水、生理盐水或培养基。该方法过程较复杂，且单用一种去污剂去细胞的作用不够完全。发明内容为克服现有技术的缺陷，提供一种具有良好的机械强度、生物降解性、模拟组织三维结构及血管化的全肝支架，本发明一方面提供一种用于获取全肝支架的试剂盒，其包括灌注液 I： 0.1%_10% (体积 /体积）非离子型去污剂的 Tris-HCl 溶液；和灌注液 II： 0.1%-10% (质量 /体积）离子型去污剂的 Tris-HCl溶液。

在本发明的一个实施方式中，所述非离子型去污剂选自 Triton X-100, Tween 20、 Tween 40和 Tween 80。优选地，所述非离子型去污剂为 Tr i t on X-l 00。

在本发明的另一个实施方式中，所述离子型去污剂为十二烷基硫酸钠 (SDS)或熊去氧胆酸。

在本发明的另一个实施方式中，所述灌注液 I是通过将非离子型去污剂溶于 pH7-8、 50-100mM的 Tris-HCl中制成的。

在本发明的另一实施方式中，所述灌注液 II是通过将离子型去污剂溶于 pH7-8、 50-100mM的 Tris-HCl中制成的。

本发明的另一方面提供一种获取全肝生物支架的方法，其包括以下步驟： ( a )以权利要求 1所述的灌注液 I灌注离体肝脏，使得肝脏由土黄色变成乳白色；

(b) 以蒸馏水灌注以充分洗脱灌注液 I中的非离子型去污剂； ( c ) 以权利要求 1所述的灌注液 I I灌注，使得肝脏变为透明；

( d ) 以蒸馏水灌注以充分洗脱灌注液 I I中的离子型去污剂。

在本发明的一个实施方式中，优选的灌注速度为 4 ~ 1000ml/min, 并且步驟（a )和步驟（c )可同时进行，或连续进行。灌注速度的选择与具体的动物有关，以灌注速度不实质性地损伤支架（例如血管部分）为宜，本领域适灌注速度，或者采取的灌注速度与不同动物的肝脏血流量相当，以减少对保留成分的损伤，特别是血管的损伤，例如人的门静脉血流量为 750 ml/min, 肝动脉血流量为 350 ml/min, 灌注时可以采用相似的速度。

在本发明的另一个实施方式中，在灌注之前或之中，对离体肝脏进行机械搅拌和 /或超声波处理。

在本发明的另一个实施方式中，在灌注之前对离体肝脏施用螯合剂。优选地，所述螯合剂为乙二胺四乙酸（ EDTA )或乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ EGTA )。螯合剂结合 Ca²⁺, 松解了细胞之间的桥粒连接，使得洗脱相对容易。

在本发明的又一实施方式中，在灌注之中或之后，对离体肝脏施用胰蛋白酶和 /或核酸酶。其可以降解细胞破坏后的蛋白质与核酸，并使其分解而更易洗脱出来。

在本发明的其他实施方式中，所述灌注的方法采用直接灌注法或循环灌注法。

本发明提供的试剂盒及使用该试剂盒获取全肝支架的方法使实质性器官肝脏去细胞化更完全，同时保留细胞外基质的结构及大部分成分，从而用作生物支架材料，而应用于生物人工肝的研究。其中非离子型去污剂（例如 Tr i ton X-100 )破坏脂质与脂质及蛋白与脂质之间的相互作用，但是蛋白质与蛋白质之间的相互作用仍被完整的保留；离子型去污剂（例如 SDS )可以有效地溶解细胞质和细胞的核膜，还可以破坏蛋白蛋白之间的相互作用。两者的作用机制互补，联合应用后具有非常理想的效果。而且，本发明使用了

Tris-HCl緩沖液，其緩沖能力强，可以提供更稳定的 pH环境。附图说明

图 la和图 lb显示了通过实施例 1方法处理后的肝脏的病理切片（HE染色），其中未见细胞，说明本发明的方法具有非常完全的去细胞化作用；

图 2a和图 2b显示了 Masson染色与地衣红染色后的肝脏病理切片，以分别显示胶原纤维和弹力纤维，弹力纤维的保留显示小动脉结构的存在；

图 3a和图 3b是扫描电镜的结果，图中显示灌注后的肝脏支架保留了纤维网格样结构与血管；

图 4a、 4b、 4c和 4d分别显示细胞在肝脏支架上的粘附生长。具体实施方式为了更好地理解本发明的方法，下面将通过实施例和实险证据进一步阐述本发明及其优势。实施例 1. 大鼠肝脏去细胞

1. 配制灌注液 I和灌注液 11：

灌注液 I: Triton X-100 10ml, 溶于 pH7.5、 50mM的 Tris-HCl 800 ml 中，定容至 1000 ml, 得到 1% Triton X-100;

灌注液 II: 取 SDS lOg溶于 pH7.5、 50mM的 Tris-HCl中 800 ml, 定容至 1000 ml, 得到 1% SDS。

2. 灌注以实现去细胞化：

从离体肝脏的门静脉插管，以 lOml/min的速度往离体肝脏灌注 1 %Triton X-100灌注液 1小时，此时肝脏中心区变成乳白色，流出的灌注液呈混浊的棕黄色；然后用双蒸水灌注 1小时充分洗脱 Triton X-100, 接着用 1% SDS灌注液以 10ml/min的速度灌注 3小时，此时肝脏变为透明，可见其内的脉管结构, 最后用双蒸水灌注 7小时以充分洗脱 SDS。实施例 2. 猪肝脏灌注去细胞

1. 配制灌注液 I和灌注液 11：

灌注液 I：取 Triton X-100100ml溶于 pH8、 50mM的 Tris-HCl 800ml中，定容至 1000 ml, 得到 10 % Triton X-100;

灌注液 II: 取 SDS 100g溶于 pH8、 50 mM的 Tris-HCl 800ml中，定容至 1000 ml, 得到 10% SDS。

2. 灌注以实现去细胞化：

经门静脉与肝动脉分别插管后，同时灌注上述灌注液 I和灌注液 II, 至肝脏变透明。使用的灌注速度为 50ml/min。灌注后，使用双蒸水灌注以充分洗脱去污剂。实施例 3. 小鼠肝脏去细胞

1. 配制灌注液 I和灌注液 11：

灌注液 I：取 Triton X-100 1ml溶于 ρΗ7· 5、 50 mM的 Tris-HCl 800 ml 中，定容至 1000 ml, 得到 0.1 % Triton X-100;

灌注液 II: 取熊去氧胆酸 lg溶于 pH7.5、 50 mM的 Tris-HCl 800 ml中，定容至 1000 ml, 得到 0.1 % 熊去氧胆酸。

2. 灌注以实现去细胞化：

经肝上下腔静脉后，结扎肝下下腔静脉，剪破门静脉进行灌注，灌注速度 4 ml/min₀ 按实施例 1中的方法灌注。实施例 4. 小鼠肝脏去细胞 1. 配制灌注液 I和灌注液 11：

灌注液 I：取 Tween20 10ml溶于 H7.0、 50 mM的 Tris-HCl 800 ml † 定容至 1000 ml, 得到 1 % Tween20;

灌注液 II: 取 SDS lg溶于 pH7.5、 50 mM的 Tris-HCl 800 ml 中，定容至 1000 ml, 得到 0.1 % SDS。

2. 灌注以实现去细胞化：

经肝上下腔静脉后，结扎肝下下腔静脉，剪破门静脉进行灌注，灌注速度 4 ml/min₀ 按实施例 1中的方法灌注。实施例 5. 手术切除肝脏去细胞

将手术切除的病肝分别处理出门静脉与肝动脉后，经门静脉与肝动脉分别插管后，同时灌注实施例 2的灌注液 I和灌注液 II, 至肝脏变透明。使用的灌注速度为门静脉 750 ml/min, 肝动脉 250ml/min。灌注后，使用双蒸水灌注以充分洗脱去污剂。实施例 6. 超声波处理与灌注处理的联合使用

1. 超声波处理：

将取得的肝脏放于盛满 PBS緩沖液的密闭容器内（该容器经过高压消毒），将该容器放于标准的超声池内超声约 30min。

2. 灌注处理：

超声波处理后进行灌注，以 5ml/min 的速度往离体肝脏灌注 1% Triton X-100 (制备方法同实施例 1 ) 1 小时，然后用双蒸水灌注 1 小时充分洗脱 Triton X-100, 接着用 1% SDS (制备方法同实施例 1 ) 以 5 ml/min的速度灌注 3小时，最后用双蒸水灌注 2小时充分洗脱 SDS。实施例 7. 酶处理与灌注处理的联合使用

1. 核酸酶 (DNAase)灌注液的配制：

取 1% Triton X-100的 Tris-HCl溶液约 100ml, 加入 20900 U的核酸酶，充分溶解后，以 1% Triton X-100 的 Tris-HCl 溶液定容至 500 ml, 得到 41.8u/ml核酸酶（ DNAase ) 灌注液。过滤除菌后放于 -20°C冰箱保存。

2. 灌注处理：

以 5ml/min的速度往离体肝脏灌注核酸酶灌注液 1小时，然后用双蒸水灌注 1小时充分洗脱 Triton X-100, 接着用 1%SDS (制备方法同实施例 1 ) 以 5 ml/min的速度灌注 3小时，最后用双蒸水灌注 2小时充分洗脱 SDS。

灌注方法可采用直接灌注与循环灌注两种方法，其中循环灌注适用于体积较大的肝脏，可以节省灌洗液，循环灌注中需加入滤网防止较大的细胞碎片堵塞灌注管道。

虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背本发明的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。

Claims

权利要求书

1. 一种用于获取全肝支架的试剂盒，其包括灌注液 I： 0.1%-10% (体积 /体积比）非离子型去污剂的 Tris-HCl溶液; 和灌注液 II： 0.1%-10% (质量 / 体积比）离子型去污剂的 Tris-HCl溶液。

2. 如权利要求 1所述的试剂盒，其特征在于，所述非离子型去污剂选自 Triton X-100, Tween 20、 Tween 40和 Tween 80。

3. 如权利要求 2 所述的试剂盒，其特征在于，所述非离子型去污剂为 Triton X-100。

4. 如权利要求 1所述的试剂盒，其特征在于，所述离子型去污剂为十二烷基硫酸钠或熊去氧胆酸。

5. 如权利要求 1所述的试剂盒，其特征在于，所述灌注液 I是通过将非离子型去污剂溶于 pH7-8、 50-100mM的 Tris-HCl中制成的。

6. 如权利要求 1所述的试剂盒，其特征在于，所述灌注液 II是通过将离子型去污剂溶于 pH7-8、 50-100mM的 Tris-HCl中制成的。

7.—种获取全肝生物支架的方法，其包括以下步驟：

( a )以权利要求 1所述的灌注液 I灌注离体肝脏，使得肝脏由土黄色变成乳白色；

( b ) 以蒸馏水灌注，以充分洗脱灌注液 I中的非离子型去污剂；

( c ) 以权利要求 1所述的灌注液 II灌注，使得肝脏变为透明；

(d) 以蒸馏水灌注，以充分洗脱灌注液 II中的离子型去污剂。

8. 如权利要求 7所述的方法，其特征在于，在灌注之前或之中，对离体肝脏进行机械搅拌和 /或超声波处理。

9. 如权利要求 7所述的方法，其特征在于，在灌注之前对离体肝脏施用螯合剂。

10. 如权利要求 9所述的方法, 其特征在于，所述螯合剂为乙二胺四乙酸或乙二醇二乙醚二胺四乙酸。

11. 如权利要求 7所述的方法, 其特征在于，在灌注之中或之后，对离体肝脏施用胰蛋白酶和 /或核酸酶。

12. 如权利要求 7所述的方法, 其特征在于，所述灌注的方法为直接灌注法或循环灌注法。