CN104726398A - 固定化的全人源ecm包被基质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种固定化的全人源包被基质的制备方法：先用人脐带间充质细胞，通过细胞裂解的方法，获得细胞外基质，最后再用甲醇固定。该基质是全人源的，即用型的，可以长期保存的，适合人胚胎干细胞长期培养生长的固定化细胞外基质，可用于临床级人胚胎干细胞的体外扩增。

Description

固定化的全人源ECM包被基质的制备方法

技术领域

本发明涉及一种固定化的人脐带来源的细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)的制备方法。

背景技术

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)是具有自我更新能力的多能干细胞，它们从囊胚期的内细胞团分离得到，有分化为三胚层的能力，因此用于组织修复和药物筛选的前景广阔。适合hESC临床应用的培养体系必须具有无动物源性，成分确定，适合大规模生产等优点。而hESCs对生长条件苛刻。只有合适的培养基质与培养基相互配合，才能长期维持其未分化状态。在传统的培养体系中，人胚胎干细胞通常分为有饲养层和无饲养层培养。在有饲养层培养体系中，hESC通常是在CF-1小鼠饲养层上进行培养。为了降低培养体系中的动物成分，制备适合hESC临床应用的培养基质，一些人源细胞取代了小鼠的饲养层。尽管已经证实新生儿包皮成纤维细胞，成人皮肤成纤维细胞，人输卵管上皮细胞，人脐带来源细胞等可以支持hESC的生长，但是这种共培养体系的操作步骤繁琐。首先需要将饲养层细胞用丝裂霉素C或伽马射线处理，使其失去增殖能力。其次在hESCs每次传代前都需要预铺饲养层细胞，它们的状态和密度都直接影响着hESCs的生长。为了简化培养体系，很多人尝试用各种细胞外基质(ECM)代替饲养层细胞。目前基质胶(Matrigel)是无饲养层培养体系中最常用的包被材料，它是从小鼠EHS肉瘤提取的，含有层黏连蛋白，胶原IV，硫酸乙酰肝素，巢蛋白等多种成分。但是Matrigel来源于小鼠EHS肉瘤，含有鼠源成分，所以不适合hESCs的临床应用。为了减少培养体系中动物成分，使人胚胎干细胞更好地应用于临床，一些无异源成分的ECM包被基质被应用于人胚胎干细胞的培养，如玻连蛋白，多肽，人胎盘提取的ECM等。但是它们的生产工艺复杂，不适合大规模生产，且效果不及饲养层细胞和Matrigel。本发明涉及的无异源成分的培养基质来源于人脐带间充质细胞，制备方法简单，是一种全人源的，可以长期保存的，适合人胚胎干细胞长期培养生长的固定化细胞外基质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种固定化的全人源细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)包被基质及其制备方法，以降低人胚胎干细胞培养体系中的异源成分，为最终临床级人胚胎干细胞的体外扩增探索出一个新的途径。

固定化的人源ECM包被基质的制备步骤是：1)从人脐带获得脐带间充质细胞；2)甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备。

其中，从人脐带获得脐带间充质细胞的方法为：

1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次；

2)把脐带剪成小段，剥离两动脉和一静脉；

3)血管去除后，分离华通氏胶；

4)将分离出的华通氏胶剪成小块，加入适量培养基，放入37℃的CO₂培养箱中培养；

5)培养三天后隔4-5天换液一次，2-3周后可见组织块周围有细胞爬出；

6)当细胞80％汇合后，进行传代培养；

7)人脐带间充质细胞P1代后每2-3天传代一次。

其中，甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法为：

1)将P5-P15代的人脐带间充质细胞按正常传代密度传到培养板上；

2)待其生长4-5天达到100％汇合，以便积累足够的ECM；

3)开始裂解前，加入洗液1洗一次；

4)加入裂解液，室温放置5-10分钟；

5)裂解结束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；

6)最后一次洗涤结束后，加入60％～100％甲醇室温固定；

7)培养板真空干燥，4℃保存；

其中，上述甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法中，所用试剂的配方为：

1)洗液1：10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH＝8.0，高压灭菌后室温保存；

2)裂解液：0.3％脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，0.22μm滤膜过滤，室温保存；

3)洗液2：1mM EDTA，pH=8.0，高压灭菌后室温保存。

优选地，步骤6)中加入80％～90％甲醇室温固定，固定时间5-10min。

本发明披露的固定化的全人源ECM包被基质及其制备方法主要有以下有益效果：

1)解决了hESCs培养中操作繁琐的问题，制备了一种即用型的hESCs培养基质；

2)用人脐带间充质细胞作为基质来源，解决了hESCs培养基质的异源性问题；

3)改进了裂解方法，裂解液和洗液配方，制备方法更加简单；

4)将裂解细胞获得的细胞外基质用甲醇进行固定，使培养基质更加稳定，这种固定化基质可以支持hESCs的长期生长并维持其未分化状态。

综上，上述的固定化的全人源ECM包被基质及其制备方法，可以大大降低人胚胎干细胞培养体系中的异源成分，为最终临床级人胚胎干细胞的体外扩增探索出新的途径。

附图说明

图1hESC在固定化人源ECM上连续传25代后的克隆形态

图2hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI／Oct-4染色结果

图3hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI／Sox2染色结果

图4hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI／SSEA-4染色结果

图5hESC在固定化人源ECM上连续传25代后畸胎瘤HE染色结果

图6hESC在固定化人源ECM上连续传25代后核型检测结果

图5中，A：内胚层(腺体)，B：中胚层(脂肪)，C：外胚层(神经上皮)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：将固定化全人源ECM应用于人胚胎干细胞培养与结果检测

实验中所用的主要仪器及型号：超纯水仪(SIMSV0000，Millipore)；CO2细胞培养箱(Thermo，3111，美国)；超净台(YJ-VS型，无锡一净净化设备有限公司)；荧光倒置相差显微镜(OLYMPUS，IX71，日本)；石蜡切片机(YD202A，金华市益迪医疗设备厂)。

1.制备固定化的人源ECM包被基质

1.1从人脐带获得脐带间充质细胞

1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次；

2)把脐带剪成小段，剥离两动脉和一静脉；

3)血管去除后，分离华通氏胶；

4)将分离出的华通氏胶剪成小块，加入适量培养基，放入37℃的CO₂培养箱中培养；

5)培养三天后隔4-5天换液一次，2-3周后可见组织块周围有细胞爬出；

6)当细胞80％汇合后，进行传代培养；

7)人脐带间充质细胞P1代后每2-3天传代一次。

1.2甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备

1.2.1试剂配方：

1)洗液1：10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，高压灭菌后室温保存；

2)裂解液：0.3％脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，0.22μm过滤后室温保存；

3)洗液2：1mM EDTA，pH=8.0，高压灭菌后室温保存。

1.2.2制备步骤：

1)将P5-P15代的人脐带间充质细胞按正常传代密度传到培养板上；

2)待其生长4-5天达到100％汇合，以便积累足够的ECM；

3)开始裂解前，加入洗液1洗一次；

4)加入裂解液，室温放置5-10分钟；

5)裂解结束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；

6)最后一次洗涤结束后，加入60％～100％甲醇室温固定5-10分钟；

7)培养板真空干燥，4℃保存。

2.人胚胎干细胞在固定化人源ECM培养板上的传代培养

2.1人胚胎干细胞的复苏

1)从液氮中取出冻存的人胚胎干细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的振动以迅速解冻(控制在1分钟之内)；

2)当只有少许冰晶存在时，从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍；

3)将细胞转移到15毫升离心管中，缓慢滴加预热的人胚胎干细胞培养基，前1毫升要慢些，后面可加快，混匀。以200g的速度离心5分钟；

4)吸弃上清液。人胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀；

5)转移细胞悬浮液到一个包被了固定化人源ECM的培养板中；

6)将培养板放入37℃的CO2培养箱中；

7)复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人胚胎干细胞完全培养基。

2.2人胚胎干细胞的的传代

1)4℃取出固定化人源ECM培养板，恢复至室温；

2)如果上一代的人胚胎干细胞是在有饲养层条件下培养，按饲养层条件下的传代步骤进行，换成无饲养层条件下的培养基即可。

3)如果上一代的人胚胎干细胞是在无饲养层条件下培养，按以下步骤传代；

a)吸弃旧的培养液，加入中性酶1mg／ml，37℃消化5分钟；

b)观察到克隆开始卷边时，立即吸弃消化液；

c)加入DMEM／F12，轻轻吹下克隆，将细胞悬液转移至15ml离心管；

d)用移液管吹打克隆至4倍镜下米粒大小，待细胞沉降下来后，吸弃上清；

e)加入无饲养层条件下的培养基(如成分确定培养基mTeSR1或者TeSR-E8，或是加入了条件培养基的人胚胎干细胞完全培养基)，根据需要按比例传代；

f)传代后的第一天不需换液，从第二天起，每天换液；

g)在固定化人源ECM培养板上，人胚胎干细胞的传代周期4-5天。

3.人胚胎干细胞特异性抗原的免疫染色检测

1)将hESCs在固定化人源ECM基质上培养25代后，取适量细胞接种于包被了固定化人源ECM基质的24孔板内；

2)培养2-3天后，吸弃培养液，PBS洗涤一次，加入4％多聚甲醛室温固定30分钟；

3)PBS洗3次，每次5分钟。在无水乙醇中浸泡两次，每次20分钟(仅限于核蛋白，如Oct4，Sox2等，不能用于膜蛋白如SSEA4等)；

4)加入含5％BSA和0.4％Triton-X100的PBS37℃封闭1小时；

5)PBS洗3次，每次5分钟。分别加入兔抗人一抗Oct4、Sox2；小鼠抗人一抗SSEA4，4℃过夜或37℃两小时；

6)PBS洗3次，每次5分钟，分别加入荧光标记的羊抗兔二抗，羊抗小鼠二抗。37℃孵育1小时；

7)PBS洗3次，每次5分钟；

8)加入细胞核染料DAPI，室温5分钟，PBS洗涤后荧光显微镜下观察拍照。

4.人胚胎干细胞体内分化能力检测

4.1畸胎瘤形成实验

1)将hESCs在固定化人源ECM基质上培养25代后，按2.2的传代方法消化下来；

2)将细胞悬浮在小于400ul的培养液中，无菌注射入NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中，每个注射点的细胞量约为2-3×10⁶；

3)注射3只NOD-SCID小鼠，6周后可用手触摸到畸胎瘤，12周后可取出畸胎瘤进行HE染色，观察是否分化为三个胚层。

4.2畸胎瘤石蜡切片HE染色

1)将NOD-SCID小鼠后肢的畸胎瘤分离出，放入Bouin固定液中24小时；

2)乙醇脱水：70％乙醇1小时，80％乙醇1小时，90％乙醇1小时，95％乙醇1小时，100％乙醇1小时，新鲜100％乙醇1小时，新鲜100％乙醇过夜；

3)透明：氯仿1小时，新鲜氯仿1小时，新鲜氯仿过夜；

4)石蜡放入60℃烘箱熔解；

5)组织浸蜡：浸蜡的温度(56℃-58℃)稍低于石蜡的熔点60℃，浸蜡1-3小时；

6)包埋：样品迅速放到石蜡包埋底内，至石蜡全部凝结，修整蜡块，样品位于蜡块正中央，样品边缘与石蜡边缘距离约3毫米，切片厚度4μm；

7)烤片：载玻片置于37℃-42℃烘片台上，切片借助水的表面张力展开至平整，吸除多余水分，37℃烤片过夜；

8)脱蜡亲水：二甲苯浸泡4次，每次5分钟。100％乙醇两次，每次10分钟。95％乙醇5分钟，90％乙醇5分钟，80％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟。蒸馏水洗三次，每次5分钟；

9)HE染色：切片在苏木精溶液中浸泡10分钟，自来水涮洗2-3次至水接近无色，蒸馏水中涮洗1次，在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色，一般1-2秒。切片在自来水龙头下流水冲洗15-20分钟，至切片呈理想的紫蓝色，此步骤称蓝化(颜色适宜度取决于经验)。蒸馏水中涮洗一下，切片在伊红溶液中染5分钟，自来水涮洗至水接近无色，蒸馏水中涮洗一下。依次在70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇中稍微浸一下；

10)脱水：100％乙醇浸泡2次，每次10分钟。二甲苯中浸泡4次，每次5分钟；

11)树脂封片：至封片前，切片不能干掉。在盖玻片末端蘸少量二甲苯，样品中间滴一滴中性树脂。封片时注意不能有气泡。

5.人胚胎干细胞的核型检测

1)取固定化人源ECM6孔板中一孔生长旺盛的人胚胎干细胞，加入0.1μg／ml秋水仙素处理3小时；

2)加入Tryple消化成单细胞，120g离心5分钟，弃上清；

3)缓缓加入37℃预热的75mM KCl3ml，轻轻混匀；

4)37℃水浴下低渗15分钟；

5)预固定：加入3滴固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)，轻轻混匀；

6)以100g离心5分钟(离心机去刹车!)，弃上清；

7)第一次固定：先加入3ml固定液混匀，再加入2ml固定液，室温固定20分钟；

8)以100g离心5分钟(离心机去刹车!)，弃上清；

9)第二次固定：先加入3ml固定液混匀，再加入2ml固定液，4℃过夜(可放置数月)；

10)制片：滴少许新鲜固定液于离心管内，制成细胞悬液，滴于冰水浴玻片上，酒精灯上微烤，放于37℃干燥过夜；

11)常规G显带

a)将玻片放入经37℃水浴预温的0.02％胰酶染缸内，不断抖动20秒，取出；

b)清水漂洗；

c)用0.01mol／L PBS与Giemsa混合液(9∶1)染色5分钟，清水漂洗，晾干；

d)镜检。

12)在每一张玻片上分别计数5-10个克隆中的5-10个核型，选择3-5个分散好，带型清晰于计算机中，分析并配对保存。如果在镜下发现两个相同的异常核型，则需计数20-30个核型，并增加计算机分析核型。

6.结果分析

1)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后，仍然保持典型的hESC克隆形态，克隆边缘清晰，无分化迹象；

2)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后，对其特异性抗原进行免疫染色，结果显示Oct-4，Sox2和SSEA-4染色均呈阳性，说明人胚胎干细胞未分化；

3)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后，对其体外分化能力进行检测。结果显示人胚胎干细胞在NOD-SCID小鼠体内形成畸胎瘤，HE染色观察到畸胎瘤分化为三个胚层；

4)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后，对其核型进行检测，经分析后得出，核型正常。

应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，该方法为：

1)从人脐带获得脐带间充质细胞；

2)用裂解液裂解脐带间充质细胞，获得全人源细胞外基质；

3)用甲醇固定细胞外基质，获得固定化的全人源细胞外基质。

2.根据权利要求1所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的从人脐带获得脐带间充质细胞的方法为：

1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次；

2)把脐带剪成小段，剥离两动脉和一静脉；

3)血管去除后，分离华通氏胶；

4)将分离出的华通氏胶剪成小块，加入适量培养基，放入37℃的CO₂培养箱中培养；

5)培养三天后，每隔4-5天换液一次，2-3周后可见组织块周围有细胞爬出；

6)当细胞80％汇合后，进行传代培养。

3.根据权利要求1所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的固定化全人源细胞外基质的步骤为：

1)将P5-P15代人脐带间充质细胞传到培养板上；

2)待其生长4-5天达到100％汇合，以便积累足够的ECM；

3)开始裂解前，加入洗液1洗一次；

4)加入裂解液，室温放置5-10分钟；

5)裂解结束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；

6)最后一次洗涤结束后，加入60％～100％甲醇室温固定；

7)培养板真空干燥，4℃保存。

4.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的裂解液为：0.3％脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，0.22μm滤膜过滤，室温保存。

5.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的洗液1的组成为：10mM Tris-HCl+10mM EDTA，pH=8.0，灭菌后室温保存。

6.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，所述的洗液2的组成为：1mM EDTA，pH=8.0，灭菌后室温保存。

7.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法，其特征在于，步骤6)中加入80％～90％的甲醇室温固定。