CN104726398A - 固定化的全人源ecm包被基质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化的全人源包被基质的制备方法:先用人脐带间充质细胞,通过细胞裂解的方法,获得细胞外基质,最后再用甲醇固定。该基质是全人源的,即用型的,可以长期保存的,适合人胚胎干细胞长期培养生长的固定化细胞外基质,可用于临床级人胚胎干细胞的体外扩增。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化的人脐带来源的细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)的制备方法。
背景技术
人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)是具有自我更新能力的多能干细胞,它们从囊胚期的内细胞团分离得到,有分化为三胚层的能力,因此用于组织修复和药物筛选的前景广阔。适合hESC临床应用的培养体系必须具有无动物源性,成分确定,适合大规模生产等优点。而hESCs对生长条件苛刻。只有合适的培养基质与培养基相互配合,才能长期维持其未分化状态。在传统的培养体系中,人胚胎干细胞通常分为有饲养层和无饲养层培养。在有饲养层培养体系中,hESC通常是在CF-1小鼠饲养层上进行培养。为了降低培养体系中的动物成分,制备适合hESC临床应用的培养基质,一些人源细胞取代了小鼠的饲养层。尽管已经证实新生儿包皮成纤维细胞,成人皮肤成纤维细胞,人输卵管上皮细胞,人脐带来源细胞等可以支持hESC的生长,但是这种共培养体系的操作步骤繁琐。首先需要将饲养层细胞用丝裂霉素C或伽马射线处理,使其失去增殖能力。其次在hESCs每次传代前都需要预铺饲养层细胞,它们的状态和密度都直接影响着hESCs的生长。为了简化培养体系,很多人尝试用各种细胞外基质(ECM)代替饲养层细胞。目前基质胶(Matrigel)是无饲养层培养体系中最常用的包被材料,它是从小鼠EHS肉瘤提取的,含有层黏连蛋白,胶原IV,硫酸乙酰肝素,巢蛋白等多种成分。但是Matrigel来源于小鼠EHS肉瘤,含有鼠源成分,所以不适合hESCs的临床应用。为了减少培养体系中动物成分,使人胚胎干细胞更好地应用于临床,一些无异源成分的ECM包被基质被应用于人胚胎干细胞的培养,如玻连蛋白,多肽,人胎盘提取的ECM等。但是它们的生产工艺复杂,不适合大规模生产,且效果不及饲养层细胞和Matrigel。本发明涉及的无异源成分的培养基质来源于人脐带间充质细胞,制备方法简单,是一种全人源的,可以长期保存的,适合人胚胎干细胞长期培养生长的固定化细胞外基质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化的全人源细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)包被基质及其制备方法,以降低人胚胎干细胞培养体系中的异源成分,为最终临床级人胚胎干细胞的体外扩增探索出一个新的途径。
固定化的人源ECM包被基质的制备步骤是:1)从人脐带获得脐带间充质细胞;2)甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备。
其中,从人脐带获得脐带间充质细胞的方法为:
1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次;
2)把脐带剪成小段,剥离两动脉和一静脉;
3)血管去除后,分离华通氏胶;
4)将分离出的华通氏胶剪成小块,加入适量培养基,放入37℃的CO2培养箱中培养;
5)培养三天后隔4-5天换液一次,2-3周后可见组织块周围有细胞爬出;
6)当细胞80%汇合后,进行传代培养;
7)人脐带间充质细胞P1代后每2-3天传代一次。
其中,甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法为:
1)将P5-P15代的人脐带间充质细胞按正常传代密度传到培养板上;
2)待其生长4-5天达到100%汇合,以便积累足够的ECM;
3)开始裂解前,加入洗液1洗一次;
4)加入裂解液,室温放置5-10分钟;
5)裂解结束后,立即吸去裂解液,加入洗液2,洗4-5次;
6)最后一次洗涤结束后,加入60%~100%甲醇室温固定;
7)培养板真空干燥,4℃保存;
其中,上述甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法中,所用试剂的配方为:
1)洗液1:10mM Tris-HCl+10mM EDTA,pH=8.0,高压灭菌后室温保存;
2)裂解液:0.3%脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA,pH=8.0,0.22μm滤膜过滤,室温保存;
3)洗液2:1mM EDTA,pH=8.0,高压灭菌后室温保存。
优选地,步骤6)中加入80%~90%甲醇室温固定,固定时间5-10min。
本发明披露的固定化的全人源ECM包被基质及其制备方法主要有以下有益效果:
1)解决了hESCs培养中操作繁琐的问题,制备了一种即用型的hESCs培养基质;
2)用人脐带间充质细胞作为基质来源,解决了hESCs培养基质的异源性问题;
3)改进了裂解方法,裂解液和洗液配方,制备方法更加简单;
4)将裂解细胞获得的细胞外基质用甲醇进行固定,使培养基质更加稳定,这种固定化基质可以支持hESCs的长期生长并维持其未分化状态。
综上,上述的固定化的全人源ECM包被基质及其制备方法,可以大大降低人胚胎干细胞培养体系中的异源成分,为最终临床级人胚胎干细胞的体外扩增探索出新的途径。
附图说明
图1hESC在固定化人源ECM上连续传25代后的克隆形态
图2hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI/Oct-4染色结果
图3hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI/Sox2染色结果
图4hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI/SSEA-4染色结果
图5hESC在固定化人源ECM上连续传25代后畸胎瘤HE染色结果
图6hESC在固定化人源ECM上连续传25代后核型检测结果
图5中,A:内胚层(腺体),B:中胚层(脂肪),C:外胚层(神经上皮)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明:
实施例1:将固定化全人源ECM应用于人胚胎干细胞培养与结果检测
实验中所用的主要仪器及型号:超纯水仪(SIMSV0000,Millipore);CO2细胞培养箱(Thermo,3111,美国);超净台(YJ-VS型,无锡一净净化设备有限公司);荧光倒置相差显微镜(OLYMPUS,IX71,日本);石蜡切片机(YD202A,金华市益迪医疗设备厂)。
1.制备固定化的人源ECM包被基质
1.1从人脐带获得脐带间充质细胞
1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次;
2)把脐带剪成小段,剥离两动脉和一静脉;
3)血管去除后,分离华通氏胶;
4)将分离出的华通氏胶剪成小块,加入适量培养基,放入37℃的CO2培养箱中培养;
5)培养三天后隔4-5天换液一次,2-3周后可见组织块周围有细胞爬出;
6)当细胞80%汇合后,进行传代培养;
7)人脐带间充质细胞P1代后每2-3天传代一次。
1.2甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备
1.2.1试剂配方:
1)洗液1:10mM Tris-HCl+10mM EDTA,pH=8.0,高压灭菌后室温保存;
2)裂解液:0.3%脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA,pH=8.0,0.22μm过滤后室温保存;
3)洗液2:1mM EDTA,pH=8.0,高压灭菌后室温保存。
1.2.2制备步骤:
1)将P5-P15代的人脐带间充质细胞按正常传代密度传到培养板上;
2)待其生长4-5天达到100%汇合,以便积累足够的ECM;
3)开始裂解前,加入洗液1洗一次;
4)加入裂解液,室温放置5-10分钟;
5)裂解结束后,立即吸去裂解液,加入洗液2,洗4-5次;
6)最后一次洗涤结束后,加入60%~100%甲醇室温固定5-10分钟;
7)培养板真空干燥,4℃保存。
2.人胚胎干细胞在固定化人源ECM培养板上的传代培养
2.1人胚胎干细胞的复苏
1)从液氮中取出冻存的人胚胎干细胞冻存管,立即投入37℃水浴中快速的振动以迅速解冻(控制在1分钟之内);
2)当只有少许冰晶存在时,从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍;
3)将细胞转移到15毫升离心管中,缓慢滴加预热的人胚胎干细胞培养基,前1毫升要慢些,后面可加快,混匀。以200g的速度离心5分钟;
4)吸弃上清液。人胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀;
5)转移细胞悬浮液到一个包被了固定化人源ECM的培养板中;
6)将培养板放入37℃的CO2培养箱中;
7)复苏的第二天无需更换培养液,从第三天起每天更换新鲜的人胚胎干细胞完全培养基。
2.2人胚胎干细胞的的传代
1)4℃取出固定化人源ECM培养板,恢复至室温;
2)如果上一代的人胚胎干细胞是在有饲养层条件下培养,按饲养层条件下的传代步骤进行,换成无饲养层条件下的培养基即可。
3)如果上一代的人胚胎干细胞是在无饲养层条件下培养,按以下步骤传代;
a)吸弃旧的培养液,加入中性酶1mg/ml,37℃消化5分钟;
b)观察到克隆开始卷边时,立即吸弃消化液;
c)加入DMEM/F12,轻轻吹下克隆,将细胞悬液转移至15ml离心管;
d)用移液管吹打克隆至4倍镜下米粒大小,待细胞沉降下来后,吸弃上清;
e)加入无饲养层条件下的培养基(如成分确定培养基mTeSR1或者TeSR-E8,或是加入了条件培养基的人胚胎干细胞完全培养基),根据需要按比例传代;
f)传代后的第一天不需换液,从第二天起,每天换液;
g)在固定化人源ECM培养板上,人胚胎干细胞的传代周期4-5天。
3.人胚胎干细胞特异性抗原的免疫染色检测
1)将hESCs在固定化人源ECM基质上培养25代后,取适量细胞接种于包被了固定化人源ECM基质的24孔板内;
2)培养2-3天后,吸弃培养液,PBS洗涤一次,加入4%多聚甲醛室温固定30分钟;
3)PBS洗3次,每次5分钟。在无水乙醇中浸泡两次,每次20分钟(仅限于核蛋白,如Oct4,Sox2等,不能用于膜蛋白如SSEA4等);
4)加入含5%BSA和0.4%Triton-X100的PBS37℃封闭1小时;
5)PBS洗3次,每次5分钟。分别加入兔抗人一抗Oct4、Sox2;小鼠抗人一抗SSEA4,4℃过夜或37℃两小时;
6)PBS洗3次,每次5分钟,分别加入荧光标记的羊抗兔二抗,羊抗小鼠二抗。37℃孵育1小时;
7)PBS洗3次,每次5分钟;
8)加入细胞核染料DAPI,室温5分钟,PBS洗涤后荧光显微镜下观察拍照。
4.人胚胎干细胞体内分化能力检测
4.1畸胎瘤形成实验
1)将hESCs在固定化人源ECM基质上培养25代后,按2.2的传代方法消化下来;
2)将细胞悬浮在小于400ul的培养液中,无菌注射入NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中,每个注射点的细胞量约为2-3×106;
3)注射3只NOD-SCID小鼠,6周后可用手触摸到畸胎瘤,12周后可取出畸胎瘤进行HE染色,观察是否分化为三个胚层。
4.2畸胎瘤石蜡切片HE染色
1)将NOD-SCID小鼠后肢的畸胎瘤分离出,放入Bouin固定液中24小时;
2)乙醇脱水:70%乙醇1小时,80%乙醇1小时,90%乙醇1小时,95%乙醇1小时,100%乙醇1小时,新鲜100%乙醇1小时,新鲜100%乙醇过夜;
3)透明:氯仿1小时,新鲜氯仿1小时,新鲜氯仿过夜;
4)石蜡放入60℃烘箱熔解;
5)组织浸蜡:浸蜡的温度(56℃-58℃)稍低于石蜡的熔点60℃,浸蜡1-3小时;
6)包埋:样品迅速放到石蜡包埋底内,至石蜡全部凝结,修整蜡块,样品位于蜡块正中央,样品边缘与石蜡边缘距离约3毫米,切片厚度4μm;
7)烤片:载玻片置于37℃-42℃烘片台上,切片借助水的表面张力展开至平整,吸除多余水分,37℃烤片过夜;
8)脱蜡亲水:二甲苯浸泡4次,每次5分钟。100%乙醇两次,每次10分钟。95%乙醇5分钟,90%乙醇5分钟,80%乙醇5分钟,70%乙醇5分钟。蒸馏水洗三次,每次5分钟;
9)HE染色:切片在苏木精溶液中浸泡10分钟,自来水涮洗2-3次至水接近无色,蒸馏水中涮洗1次,在盐酸酒精溶液内浸一下至变成接近红色,一般1-2秒。切片在自来水龙头下流水冲洗15-20分钟,至切片呈理想的紫蓝色,此步骤称蓝化(颜色适宜度取决于经验)。蒸馏水中涮洗一下,切片在伊红溶液中染5分钟,自来水涮洗至水接近无色,蒸馏水中涮洗一下。依次在70%乙醇,80%乙醇,90%乙醇中稍微浸一下;
10)脱水:100%乙醇浸泡2次,每次10分钟。二甲苯中浸泡4次,每次5分钟;
11)树脂封片:至封片前,切片不能干掉。在盖玻片末端蘸少量二甲苯,样品中间滴一滴中性树脂。封片时注意不能有气泡。
5.人胚胎干细胞的核型检测
1)取固定化人源ECM6孔板中一孔生长旺盛的人胚胎干细胞,加入0.1μg/ml秋水仙素处理3小时;
2)加入Tryple消化成单细胞,120g离心5分钟,弃上清;
3)缓缓加入37℃预热的75mM KCl3ml,轻轻混匀;
4)37℃水浴下低渗15分钟;
5)预固定:加入3滴固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1),轻轻混匀;
6)以100g离心5分钟(离心机去刹车!),弃上清;
7)第一次固定:先加入3ml固定液混匀,再加入2ml固定液,室温固定20分钟;
8)以100g离心5分钟(离心机去刹车!),弃上清;
9)第二次固定:先加入3ml固定液混匀,再加入2ml固定液,4℃过夜(可放置数月);
10)制片:滴少许新鲜固定液于离心管内,制成细胞悬液,滴于冰水浴玻片上,酒精灯上微烤,放于37℃干燥过夜;
11)常规G显带
a)将玻片放入经37℃水浴预温的0.02%胰酶染缸内,不断抖动20秒,取出;
b)清水漂洗;
c)用0.01mol/L PBS与Giemsa混合液(9∶1)染色5分钟,清水漂洗,晾干;
d)镜检。
12)在每一张玻片上分别计数5-10个克隆中的5-10个核型,选择3-5个分散好,带型清晰于计算机中,分析并配对保存。如果在镜下发现两个相同的异常核型,则需计数20-30个核型,并增加计算机分析核型。
6.结果分析
1)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后,仍然保持典型的hESC克隆形态,克隆边缘清晰,无分化迹象;
2)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后,对其特异性抗原进行免疫染色,结果显示Oct-4,Sox2和SSEA-4染色均呈阳性,说明人胚胎干细胞未分化;
3)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后,对其体外分化能力进行检测。结果显示人胚胎干细胞在NOD-SCID小鼠体内形成畸胎瘤,HE染色观察到畸胎瘤分化为三个胚层;
4)人胚胎干细胞在固定化人源ECM上连续传25代后,对其核型进行检测,经分析后得出,核型正常。
应当说明的是,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用于限制本发明的范围,凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法,其特征在于,该方法为:
1)从人脐带获得脐带间充质细胞;
2)用裂解液裂解脐带间充质细胞,获得全人源细胞外基质;
3)用甲醇固定细胞外基质,获得固定化的全人源细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法,其特征在于,所述的从人脐带获得脐带间充质细胞的方法为:
1)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次;
2)把脐带剪成小段,剥离两动脉和一静脉;
3)血管去除后,分离华通氏胶;
4)将分离出的华通氏胶剪成小块,加入适量培养基,放入37℃的CO2培养箱中培养;
5)培养三天后,每隔4-5天换液一次,2-3周后可见组织块周围有细胞爬出;
6)当细胞80%汇合后,进行传代培养。
3.根据权利要求1所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法,其特征在于,所述的固定化全人源细胞外基质的步骤为:
1)将P5-P15代人脐带间充质细胞传到培养板上;
2)待其生长4-5天达到100%汇合,以便积累足够的ECM;
3)开始裂解前,加入洗液1洗一次;
4)加入裂解液,室温放置5-10分钟;
5)裂解结束后,立即吸去裂解液,加入洗液2,洗4-5次;
6)最后一次洗涤结束后,加入60%~100%甲醇室温固定;
7)培养板真空干燥,4℃保存。
4.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法,其特征在于,所述的裂解液为:0.3%脱氧胆酸钠+10mM Tris-HCl+10mM EDTA,pH=8.0,0.22μm滤膜过滤,室温保存。
5.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法,其特征在于,所述的洗液1的组成为:10mM Tris-HCl+10mM EDTA,pH=8.0,灭菌后室温保存。
6.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法,其特征在于,所述的洗液2的组成为:1mM EDTA,pH=8.0,灭菌后室温保存。
7.根据权利要求3所述的无异源成分的人胚胎干细胞包被基质的制备方法,其特征在于,步骤6)中加入80%~90%的甲醇室温固定。
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PB01 | Publication | ||
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