CN107523539A

CN107523539A - 哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法和得到的孤雌类上胚层干细胞系

Info

Publication number: CN107523539A
Application number: CN201710820190.5A
Authority: CN
Inventors: 包斯琴; 吴宝江
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2017-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2017-12-29

Abstract

本发明公开了一种哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法和得到的孤雌类上胚层干细胞系，对ICR和129两种品系的雌性小鼠进行超数排卵，然后将卵母细胞进行孤雌激活。激活5h后，在KSOM中培养96h后出现囊胚，利用囊胚进行建系。本发明建系方法可以高效率的将小鼠孤雌胚胎诱导形成孤雌类上胚层干细胞pa‑EpiLSCs，并能保持孤雌二倍体特征且能稳定增长多达30代以上。本发明为隐性性状遗传模型的快速产生提供了一种新的工具，同时也为其它哺乳动物建立孤雌激活胚胎来源的pa‑EpiLSCs细胞提供了新的技术和理论基础。

Description

哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法和得到的孤雌类上胚层干细胞系

技术领域

本发明涉及哺乳动物生殖发育生物工程技术，尤其是一种哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法和得到的孤雌类上胚层干细胞系 (parthenogeneticepiblast like stem cell，pa-EpiLSCs)。

背景技术

胚胎干细胞(ESCs)可以无限期的保留在体内生成任何类型细胞的能力，可在体外无限增值并保持未分化的能力，因此不仅对组织修复和再生有很大的应用价值，而且也为人类疾病模型的建立和研究生命活动提供了强有力的工具。上世纪90年代，动物胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ES)的研究就已经开始，并且首次分离建系小鼠和人类胚胎干细胞系，因此科学家获得2009年度诺贝尔奖。近20多年来，生命科学界一直以胚胎干细胞的研究作为热点，尤其建立人类胚胎干细胞系之后，对ESCs的研究更是愈演愈烈。

ESCs的命运由细胞内的转录调控网络来控制，它对某些外在的信号刺激可以作出相应反应。了解这些重要的信号通路，有利于揭示干细胞自我更新的机制，同时也有助于维持多能，甚至全能特性维持开发新的培养条件。

近几年，随着生命科学动物研究领域的发展，哺乳动物干细胞的诱导方法层出不穷，干细胞种类也更加细分，但是还没有获得一种由哺乳动物孤雌胚胎获得的类上胚层干细胞(EpiSCs like细胞系)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法和得到的孤雌类上胚层干细胞系。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法，包括以下步骤：

步骤一：哺乳动物卵母细胞的体外成熟培养

将采集得到的无颗粒细胞包裹的卵母细胞移到M2液滴中清洗，放入 KSOM中平衡30-60min，移到含有氯化锶+细胞松弛素B的激活液中进行孤雌激活；激活5h后，再将卵母细胞置于M2液滴中清洗，37℃，5％CO₂下移到 KSOM中进行培养，6-8h后观察卵母细胞的原核，96h获得囊胚；

步骤二：孤雌类上胚层干细胞pa-EpiLSCs诱导建系

1)将囊胚收集到M2中，再移到台式酸中去除孤雌囊胚的透明带，在显微镜下观察透明带去除后，迅速移到M2中清洗，再移到AF培养液中清洗，将把单个孤雌激活囊胚逐个转入含有5％血清替代物的AF培养液的24孔板中进行培养；

2)5d后更换含有2％血清替代物的AF培养液，原代培养8天；P1代培养，8天后，应用挑克隆的方式进行传代，培养液为含有2％血清替代物的AF 培养液；P2代培养，12天后，传代方式不变，培养液为含有1％血清替代物的AF培养液；P3代培养，14天后，传代方式不变，培养液为含有1％血清替代物的AF培养液；P4代培养，16天后，传代方式不变，培养液为AF；P5代培养，18天后，用Accutase酶消化并进行传代，酶消化时间为1min，培养液为AF；此后，传代方式及培养条件均不变，逐渐纯化；

步骤三：pa-EpiLSCs细胞的冻存

当克隆形态稳定的呈现隆起的近似于椭圆的形状，克隆较厚，边缘清晰时，将24孔板中建系传代的pa-EpiLSCs细胞用Accutase消化1min，再用 10％血清替代物的终止液进行终止消化；1300r/min离心3min，弃上清，在细胞沉淀中加入冻存液，细胞状态为小块状；把加了冻存液的细胞样品放到 4℃冰箱静止半小时，再移到-80℃低温冰箱静置12小时，然后移入液氮中长期保存。

所述AF培养液成分如下：

所述冻存液组成如下：

细胞基础培养液 0.8ml

血清替代物 0.1ml

二甲基亚砜 0.1ml

上述的哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法得到的孤雌类上胚层干细胞系。

本发明的有益效果是：本发明建系方法可以高效率的将小鼠孤雌胚胎诱导形成孤雌类上胚层干细胞(parthenogenetic epiblast like stem cell， pa-EpiLSCs)，并能保持孤雌二倍体特征且能稳定增长多达30代以上，并稳定表达多能性基因。为隐性性状遗传模型的快速产生提供了一种新的工具，为辅助生殖做出了新的阐述，同时也为其它哺乳动物建立孤雌激活 (parthenogenetic activation)胚胎来源的pa-EpiLSCs细胞提供了新的技术和理论基础。

附图说明

图1是本发明的小鼠卵母细胞孤雌激活过程图。

图2是本发明的小鼠pa-EpiLSCs细胞建系流程图。

图3是本发明的小鼠pa-EpiLSCs细胞碱性磷酸酶染色结果图。

图4是本发明的pa-EpiLSCs多能性干细胞3天，6天，9天碱性磷酸酶染色图。

图5是本发明的pa-EpiLSCs多能性相关蛋白免疫染荧光色图。

图6是本发明的pa-EpiLSCs多能性干细胞多能性基因表达检测图。

图7是本发明的pa-EpiLSCs多能性干细胞核型分析图。

具体实施方式

本发明哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法，包括以下步骤：

步骤一：哺乳动物卵母细胞的体外成熟培养

将采集得到的无颗粒细胞包裹的卵母细胞移到M2液滴中清洗，放入 KSOM中平衡30-60min，移到含有氯化锶+细胞松弛素B的激活液中进行孤雌激活；激活5h后，再将卵母细胞置于M2液滴中清洗，37℃，5％CO₂下移到 KSOM中进行培养，6-8h后观察卵母细胞的原核，96h获得囊胚，经实验测定，囊胚率最高可以达到89％(见表1)；

表1是孤雌激活囊胚率部分统计结果图

步骤二：孤雌类上胚层干细胞pa-EpiLSCs诱导建系

2)5d后更换含有2％血清替代物的AF培养液，原代培养8天；P1代培养，8天后，应用挑克隆的方式进行传代，培养液为含有2％血清替代物的AF 培养液；P2代培养，12天后，传代方式不变，培养液为含有1％血清替代物的AF培养液；P3代培养，14天后，传代方式不变，培养液为含有1％血清替代物的AF培养液；P4代培养，16天后，传代方式不变，培养液为AF；P5代培养，18天后，改为Accutase酶传的方式进行传代，酶消化时间为1min，培养液为AF；此后，传代方式及培养条件均不变，逐渐纯化(见表2)；(当克隆形态稳定的呈现隆起的近似于椭圆的形状，克隆较厚，边缘清晰，便可以进行冷冻保存。

表2是pa-EpiLSCs多能性干细胞建系具体操作图。

步骤三：pa-EpiLSCs细胞的冻存

将24孔板中建系传代的pa-EpiLSCs细胞用Accutase消化1min，再用 10％血清替代物的终止液进行终止消化；1300r/min离心3min，弃上清，在细胞沉淀中加入冻存液，细胞状态为小块状；把加了冻存液的细胞样品放到4℃冰箱静止半小时，再移到-80℃低温冰箱静置12小时，然后移入液氮中长期保存。

所述激活液成分如下：

其中溶液A-F的成分如下：

溶液A

溶液B

碳酸氢钠 2.11g

酚红 0.010g

胚胎水定容到100ml

溶液C

丙酮酸钠 0.0297g

胚胎水定容到10ml

溶液D

氯化锶 2.66g

胚胎水定容到10ml

溶液E

谷氨酰胺 0.146g

胚胎水定容到10ml

溶液F

乙二胺四乙酸 0.04g

胚胎水定容到10ml

所述AF培养液成分如下：

所述冻存液组成如下：

细胞基础培养液 0.8ml

血清替代物 0.1ml

二甲基亚砜 0.1ml

所述10％血清替代物的终止液成分如下：

血清替代物 5ml

青霉素/链霉素 0.5ml

基础培养液DMEM/F12 44.5ml

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法如下(以小鼠为例)：

1、小鼠早期胚胎的准备

8周龄的小鼠进行超数排卵，16h后开始捡卵，从小鼠输卵管壶腹部回收未受精卵母细胞，用于以下的新型干细胞诱导与培养建系。移到含有氯化锶+细胞松弛素B的激活液中进行孤雌激活。

2、小鼠卵母细胞孤雌激活

激活5h后，再将卵母细胞放入M2的液滴中清洗3次，移到KSOM中进行培养(37℃，5％CO₂)，6-8h可观察卵母细胞的原核。

3、观察：

24h:2细胞期胚胎 48h:4细胞期胚胎 72h:桑葚胚 96h:囊胚(见图 1)。

4、小鼠pa-EpiLSCs多能性干细胞诱导建系及培养液组成

将囊胚收集到M2液滴中，再移到台式酸中去除孤雌卵子的透明带(不超过2min)，在显微镜下观察透明带去除后迅速移到M2中清洗三次，在移到 AF液滴中清洗三次，之后逐个加入放有AF(激活素A和成纤维细胞生长因子 2)+5％血清替代物培养液的24孔板中，放培养箱中进行培养。5d后更换培养液：AF+2％血清替代物，原代培养8天。8天后(P1)，应用挑克隆的方式进行传代，培养液为AF+2％血清替代物。12天后(P2)，传代方式不变，培养液为AF+1％血清替代物。14天后(P3)，传代方式不变，培养液为AF+1％血清替代物。16天后(P4)，传代方式不变，培养液为AF。18天后(P5)，改为 Acc酶传的方式进行传代，(酶消化时间为1min)培养液为AF。此后，传代方式及培养条件均不变，逐渐纯化(见图2)。

显微镜下观察其形态特征，纯化后的克隆形态为扁平椭圆状，将克隆大量扩增，用于生物特性检测。

5、小鼠pa-EpiLSCs多能性干细胞生物学特性检测

5.1AP(碱性磷酸酶)染色，用来测定pa-EpiLSCs是否呈碱性磷酸酶阳性(见图3,4)。

5.2免疫荧光染色，用来测定pa-EpiLSCs中相关蛋白的定位情况，抗体分别为：anti-Oct4、anti-Nanog、anti-Gata4、anti-Zscan4,对于核蛋白，需要进行PBT(PBS+0.1％Triton-100)处理，以使相应的抗体进入细胞核中与相应抗原结合(见图5)。

5.3多能性基因表达检测,RT-qPCR用来检测pa-EpiLSCs中多能基因的表达情况，如Oct4、Nanog、Gata4、Gata6等(见图6)。

5.4核型分析，用来检测pa-EpiLSCs细胞核中染色体数量及形态是否正常(见图7)。

具体说明如下：

实施例1、小鼠早期胚胎的准备

1.对8周龄的小鼠进行超数排卵，选用ICR和129俩种品系的雌性小鼠腹腔注射PMSG，48h后，腹腔注射HCG，(注射量：7.5IU(国际单位)/只；注射时间为17：00-19:00)，16h后开始捡卵，从小鼠输卵管壶腹部回收未受精卵母细胞，用于以下的干细胞诱导与培养建系。将无颗粒细胞包裹的卵母细胞移到M2液滴中清洗三遍，放入KSOM中平衡30-60min，移到含有氯化锶 +细胞松弛素B的激活液中进行孤雌激活。

2.孤雌激活

激活5h后，再将卵母细胞置于M2液滴中清洗3次，移到KSOM中进行培养(37℃，5％CO₂)，6-8h后可观察卵母细胞的原核。

3.观察：

24h:2细胞期胚胎 48h:4细胞期胚胎 72h:桑葚胚 96h:囊胚(见图1)

实施例2、小鼠pa-EpiLSCs多能性干细胞诱导建系及培养液组成

通过上述方法回收的超数排卵16h的小鼠卵母细胞在含有氯化锶+细胞松弛素B的激活液中激活5h后，再在KSOM中培养96h至囊胚，通过使用台氏酸(Tyrode,Acidic)去掉小鼠胚胎的透明带(zona pellucida)，然后把裸露的胚胎在不使用饲养层细胞的条件下，在N2B27基础培养液中添加成纤维细胞生长因子2、激活素A、5％成分明确的血清替代物的特定培养液(AF培养液)进行多能性干细胞诱导建系处理。5d后更换培养液：AF+2％血清替代物，原代培养8天。8天后(P1)，应用挑克隆的方式进行传代，培养液为 AF+2％血清替代物。12天后(P2)，传代方式不变，培养液为AF+1％血清替代物。14天后(P3)，传代方式不变，培养液为AF+1％血清替代物。16天后 (P4)，传代方式不变，培养液为AF。18天后(P5)，改为Acc酶传的方式进行传代，(酶消化时间为1min)培养液为AF。此后，传代方式及培养条件均不变，逐渐纯化(见图2)。

小鼠pa-EpiLSCs干细胞诱导建系培养液(AF培养液)组成(总体积为 500ml)如下：

这个阶段获得的干细胞称为小鼠pa-EpiLSCs。具体操作方法是把在KSOM 培养液体外培养4天后的囊胚用台氏酸去去掉透明带，再将单个囊胚或外胚层(Epiblast)逐个接种到纤黏连蛋白(Fibronectin,用磷酸盐缓冲液稀释成1:60的工作液)处理30min的24孔板中进行培养，培养处理5-6天后观察确认部分胚胎的内细胞团有明显向外增殖细胞的现象(约为处理胚胎的 20％)，且克隆较厚，边缘清晰，用极细的玻璃针将克隆分成若干小块进行传代，到第5代时，用Acctase消化后能稳定传代30代以上。按照上述培养方法，从24个小鼠囊胚中可建系获得pa-EpiLSCs干细胞系9个。形态特点：与EpiSCs相似；AP(碱性磷酸酶)染色：均为阳性(见图3,4)；基因表达特点：表达干细胞特异性基因Oct4表达水平与EpiSCs相比无明显差异； Nanog基因表达水平随着代数的增加而逐渐降低；而内胚层特异性基因Gata4 和Gata6的表达水平显著高于EpiSCs；Elf5的表达较高；Eomes表达水平与 EpiSCs相比无明显差异(见图6)。

实施例3、小鼠pa-EpiLSCs干细胞特性及发育潜能分析

1.AP(碱性磷酸酶)染色

AP染液配制方法：①染液1号Sodium nitrite solution(1:50)与染液2号FRV-alkaline solution(1:50)按1:1混匀，室温避光2-3min；②染液3naphthol-AS-BIalkaline solution(1:50)，加入到超纯水中。将配好的染液②加入到染液①中充分混匀。避光放置备用，现用现配。

利用4孔板培养pa-EpiLSCs至第2天时，弃培养液，加入500μL的4％多聚甲醛室温固定30min。弃多聚甲醛后用磷酸缓冲液洗1遍，弃掉磷酸缓冲液后加入提前配制好的AP染液500μL，室温避光放置过夜。显微镜下观察拍照。

2.免疫荧光染色

消化pa-EpiLSCs细胞，接种适量的细胞于八孔板中，放入培养箱中培养2天，然后进行免疫荧光染色。弃掉原培养液，加DPBS洗2遍，加入4％ PFA(多聚甲醛)室温固定30min；PBS洗3遍，每次5min；加入IF buffer (含1％BSA和0.1％Triton的DPBS)，室温放置30min；加入I抗(Anti- Mouse OCT4、Anti-Rat NANOG等)4℃冰箱避光过夜。IF buffer洗3遍，每次5min；加II抗(Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)、Goat Anti-Rat IgG)，室温避光放置1h。IFbuffer洗3遍，每次5min；DPBS洗1遍；33342染剂避光染色3min；PBS洗1遍；将八孔板拆开，滴2滴封片液，将盖玻片缓慢的放下，擦去多余的封片液，再用指甲油将四周完整的涂抹，完成封片。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

3.多能性基因表达检测

①样品RNA提取：使用RNA提取试剂盒(Cat.No.74104，QIAGEN)。将收集到的RNA混匀后进行浓度的测定。

②样品cDNA的制备：制冰机制冰，将试剂盒中的试剂在冰上融化。反转录反应体系为20μL，分为5μL和15μL两部分，5μL体系包括5μg的RNA， 1μL的引物，然后用无核酸的水配制成5μL体系。70℃加热5min，然后迅速冰浴至少5min，微型离心机中离心10s，冰上放置直至15μL体系加入。15μL 体系包括GoScriptTM5×缓冲液4.0μL，MgCl₂(最终浓度1.5-5.0mM)2.5μL，dNTP 1.0μL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶 1.0μL，无核酸水6μL。将5μL体系与15μL体系混匀，于25℃孵育5min后， 42℃孵育1h。

③实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)反应：将试剂盒中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集。将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接RT-qPCR仪 (Thermo，TCR0096)，打开软件PikoRealsoftware，选择程序设定参数， RT-qPCR反应完成后保存数据并进行分析。

4.核型分析

4.1.秋水仙素处理：在24孔细胞板中处于对数生长期的细胞中加入20 微克/毫升浓度的秋水仙素5微升，处理3h。

4.2.收集细胞：3h后弃去培养液，用Acc酶消化1min，加入含有10％血清替代物的N2B27培养液终止消化。在离心管中收集细胞，1300r/min离心3min。3min后弃上清。

4.3.低渗与预固定：在处理的细胞中滴入0.075mol/L的KCL8ml，用移液枪吹打混匀细胞，置于37℃恒温水浴锅低渗处理40min，在低渗结束前 1min加入固定液(甲醇：乙醇以3:1体积比配置)1ml对检测细胞进行预固定，混匀后以1000r/min离心10min，然后弃上清。

4.4.固定：在固定液细胞中缓慢加入固定液8ml，用移液枪轻轻吹打混匀细胞，置于37℃恒温水浴锅固定30min，以1000r/min离心10min，然后弃上清。上述处理重复2次。

4.5.滴片：在细胞沉淀物中加入新鲜配置的固定液0.5ml，用移液枪轻轻吹打制成细胞悬液，将细胞悬液放置尽量高的位置滴在经冰水浸泡过的洁净载玻片上。70℃烘箱烤1h干燥处理后室温冷却，之后再显微镜下观察(见图7)。

实施例4、干细胞冷冻保存及冷冻液组成

将24孔板中建系传代的pa-EpiLSCs细胞Accutase消化1min，再用 10％血清替代物的终止液进行终止消化。1300r/min离心3min，弃上清，在细胞沉淀中加入冻存液：80％的细胞基础培养液+10％血清替代物(血清替代物)+10％DMSO(二甲基亚砜)，细胞状态为小块状。把加了冻存液的细胞样品放到4℃冰箱静止半小时，再移到-80℃低温冰箱静置12小时，然后移入液氮中长期保存。

本发明利用孤雌胚胎建立EpiSCs like细胞系，并对再生医学研究，如细胞疗法和组织修复等提供一种理想的研究模型。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims

1.一种哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：哺乳动物卵母细胞的体外成熟培养

将采集得到的无颗粒细胞包裹的卵母细胞移到M2液滴中清洗，放入KSOM中平衡30-60min，移到含有氯化锶和细胞松弛素B的激活液中进行孤雌激活；激活5h后，再将卵母细胞置于M2液滴中清洗，37℃，5％CO₂下移到KSOM中进行培养，6-8h后观察卵母细胞的原核，96h获得囊胚；

步骤二：孤雌类上胚层干细胞pa-EpiLSCs诱导建系

1)将囊胚收集到M2中，再移到台式酸中去除孤雌囊胚的透明带，在显微镜下观察透明带去除后，迅速移到M2中清洗，再移到AF培养液中清洗，然后把每一个孤雌激活的囊胚逐一转入含有5％血清替代物的AF培养液的24孔板中进行培养；

2)5d后更换含有2％血清替代物的AF培养液，原代培养8天；P1代培养，8天后，应用挑克隆的方式进行传代，培养液为含有2％血清替代物的AF培养液；P2代培养，12天后，传代方式不变，培养液为含有1％血清替代物的AF培养液；P3代培养，14天后，传代方式不变，培养液为含有1％血清替代物的AF培养液；P4代培养，16天后，传代方式不变，培养液为AF；P5代培养，18天后用Accutase酶消化并进行传代，酶消化时间为1min，培养液为AF；此后，传代方式及培养条件均不变，逐渐纯化；

步骤三：pa-EpiLSCs细胞的冻存

当克隆形态稳定的呈现隆起的近似于椭圆的形状，克隆较厚，边缘清晰时，将24孔板中建系传代的pa-EpiLSCs细胞用Accutase消化1min，再用10％血清替代物的终止液消化进行终止消化；1300r/min离心3min，弃上清，在细胞沉淀中加入冻存液，细胞状态为小块状；把加了冻存液的细胞样品放到4℃冰箱静止半小时，再移到-80℃低温冰箱静置12小时，然后移入液氮中长期保存。

2.根据权利要求1所述哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法，其特征在于，所述AF培养液成分如下：

3.根据权利要求1所述哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法，其特征在于，所述冻存液组成如下：

细胞基础培养液 0.8ml

血清替代物 0.1ml

二甲基亚砜 0.1ml。

4.如权利要求1所述的哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法得到的孤雌类上胚层干细胞系。