CN106282097A - 诱导多能干细胞、制备诱导多能干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种诱导多能干细胞及其诱导多能干细胞的制备方法。根据本发明的实施例，该诱导多能干细胞来源于绒毛细胞。通过本发明获得的诱导多能干细胞核型正常，具有诱导多能干细胞的多能性特征。

Description

诱导多能干细胞、制备诱导多能干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及一种诱导多能干细胞及其制备方法。

背景技术

2006年，Yamanaka等人应用重编程技术将小鼠成纤维细胞诱导为多能干细胞，也被称为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)。诱导多能干细胞是一类能够维持自我更新并具有多潜能分化能力的干细胞。相对于胚胎干细胞，诱导多能干细胞由体细胞直接进入多能干细胞的状态，避免了伦理学争议。另外，研究者得到的诱导多能干细胞可以携带有疾病特异性基因，一方面可建立从疾病基因型到表型的体外细胞模型进行发病机制研究，另外一方面,由于诱导多能干细胞能由疾病个体的细胞获得，在通过分化移植到该个体的过程中因为同源性可避免免疫排斥反应，所以有望应用于临床进行细胞治疗。

迄今为止，已经使用来自皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞)、羊水、胚外组织(胎盘和脐带)，脐带血，骨膜，牙组织，脂肪组织，神经干细胞，肝细胞，羊膜来源的间质干细胞和外周血细胞，乳腺上皮细胞，以及在人中由骨外膜和脂肪干细胞，脐带基质和胎盘的供体细胞获得了人诱导多能干细胞。

然而，目前的人诱导多能干细胞技术仍有待深入研究。

发明内容

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：目前的诱导性多能干细胞技术已建立皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞)、羊水、胚外组织(胎盘和脐带)，脐带血，骨膜，牙组织，脂肪组织，神经干细胞，肝细胞，羊膜来源的间质干细胞和外周血细胞，乳腺上皮细胞，以及在人中由骨外膜和脂肪干细胞，脐带基质和胎盘为供体细胞的人iPSCs。但是目前缺乏来自于绒毛细胞的iPSC及制备方法。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种绒毛细胞诱导多能干细胞及其制备方法。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种诱导多能干细胞，其来源于绒毛细胞。根据本发明的实施例，此绒毛细胞诱导多能干细胞核型正常，具有诱导多能干细胞的多能性特征，包括表达OCT4，SOX2，Nanog，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81多能性标记物以及能够在动物模型体内形成三胚层组织的畸胎瘤。由于原代细胞重编程得到的多能干细胞能进一步诱导分化成滋养细胞,多能干细胞和滋养细胞携带同样的致病基因,可以通过该分化过程对疾病相关的滋养细胞进行体外研究,从而建立体外细胞模型。因此本领域技术人员能够理解根据本发明实施例的绒毛细胞诱导多能干细胞可以为产前诊断疾病机制、细胞遗传研究提供细胞疾病模型。关于诱导多能干细胞分化成滋养细胞，可以参见Ezashi,T,Telugu,BPVL,Roberts,RM.Model systems for studying trophoblast differentiation fromhuman pluripotent stem cells.CELL AND TISSUE RESEARCH,2012,349(3):809-824。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备绒毛细胞诱导多能干细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)使多能干细胞诱导因子在绒毛细胞中表达；(2)将步骤(1)中所得到的绒毛细胞在适于去分化的条件下进行培养，以便获得绒毛细胞诱导多能干细胞。通过以上步骤，可以有效地制备绒毛细胞诱导多能干细胞，并且表现出多能干细胞的多能性特征。如前所述，该绒毛细胞诱导多能干细胞核型正常，具有诱导多能干细胞的多能性特征，包括表达Oct4，Sox2，Nanog，SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81多能性标记物以及能够在动物模型体内形成三胚层组织的畸胎瘤。

根据本发明的实施例，上述制备诱导多能干细胞的方法还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，在上述步骤(1)中，所述多能干细胞诱导因子包括OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4以及microRNA302-367。OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4是在胚胎干细胞中能高度表达并决定其“全能性”的四个基因，microRNA302-367具有促进多能干细胞生成的作用。采用第一质粒(携带人OCT4、S0X2、SV40LT、KLF4四个基因)及第二质粒(携带microRNA302-367)将多能干细胞诱导因子转入宿主绒毛细胞，高效表达后促进绒毛细胞向多能干细胞转变并使其具有多能性特征。第一质粒和第二质粒为本领域技术人员常用质粒，优选PEP4作为第一质粒，PCEP4作为第二质粒。换句话说，根据本发明的实施例，可以将人OCT4、S0X2、SV40LT、KLF4四个基因构建在同一个质粒，例如PEP4，另外，将microRNA302-367构建在单独的质粒上，例如PCEP4。由此，可以进一步提高获得诱导多能干细胞的效率。

根据本发明的实施例，在步骤(1)中，优选电转染方式，将携带表达所述多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞中。通过电转，可以高效地将携带表达多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞，促进了绒毛细胞向多能干细胞的转变，从而具有了多能干细胞的多能性特征。

根据本发明的实施例，在步骤(1)中，电转染条件是200V电压、电击200微秒或300V电压、电击200微秒或200V电压、电击300微秒或300V电压、电击300微秒组合的任一一种，电转染优选200V的电压，电击300微秒。发明人发现，通过电转染方式将核酸分子转入绒毛细胞中的效率与电转染的电压和电击时间是非常相关的。通过对各种电转染条件进行筛选，发明人意外地发现优选200V的电压，电击300微秒的条件组合。发明人发现，如果电压过高或电击时间超过300微秒，则会导致绒毛细胞的死亡率显著增大，如果电压过低或者电击时间低于200微秒，则会导致电转染效率显著下降，无法满足后续形成诱导多能干细胞的需求。优选200V的电压，电击300微秒的电转条件组合，电击两次可以有效提高将携带表达多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞的效率，促进了绒毛细胞向多能干细胞的转变，从而具有了多能干细胞的多能性特征。

根据本发明的实施例，在步骤(2)中，将所述步骤(1)中所得到的绒毛细胞依次在绒毛细胞培养基和诱导培养基中进行培养。根据本发明的实施例，绒毛细胞培养基为CHANG Amnio^TM培养基，诱导培养基为mTeSR^TM1。根据本发明的实施例，该诱导培养基进一步含有终浓度为0.5微摩尔/升的A83-01，终浓度为0.5微摩尔/升的Thiazovivin；终浓度为1微摩尔/升的PD0325901；以及终浓度为3微摩尔/升的CHIR99021。电转后使绒毛细胞在CHANG Amnio^TM培养基的环境中进行贴壁和恢复状态，继而在无血清的诱导培养基中进行诱导培养。一方面使得电转后的绒毛细胞恢复状态，贴壁生长，另一方面，无血清培养基可以使得绒毛细胞处于同一细胞周期，同时可以避免血清的干扰。从而有利于绒毛细胞向多能干细胞的转变，使得绒毛细胞诱导多能干细胞具有多能性特征。发明人惊奇地发现，当诱导培养基中含有终浓度为0.5微摩尔/升的A83-01，终浓度为0.5微摩尔/升的Thiazovivin；终浓度为1微摩尔/升的PD0325901；以及终浓度为3微摩尔/升的CHIR99021时，可以显著提高诱导多能干细胞的形成效率，并且浓度的含量对于形成多能干细胞的效率有着显著的影响。

根据本发明的实施例，电转后绒毛细胞培养基培养24小时，诱导培养基培养20天，根据本发明的实施例，培养20天后可以获得大量生长典型的原始诱导多能干细胞，克隆边缘清晰平滑，克隆内细胞核质比大，细胞排列紧密均一。挑取不同位置的克隆继续进行维持培养和冻存，从而可以获得并保存大量具有多能性的绒毛细胞诱导多能干细胞。

附图说明

图1是根据本发明实施例的用于机械传代的玻璃吸管的结构示意图；

图2是根据本发明实施例的绒毛细胞从转染到诱导成iPSC的过程中各培养基成分的变化；

图3是根据本发明实施例的绒毛细胞从解冻培养到诱导成iPSC的细胞生长状态的改变过程；

图4是根据本发明实施例的绒毛细胞诱导多能干细胞的传代和冻存前后克隆细胞状态对比图；

图5是根据本发明实施例的绒毛细胞诱导多能干细胞多能性标志物荧光免疫检测结果；

图6是根据本发明实施例的绒毛细胞诱导多能干细胞的核型鉴定结果；

图7是根据本发明实施例的绒毛细胞诱导多能干细胞的实时定量PCR检测多能性基因的结果；

图8是根据本发明实施例的绒毛细胞诱导多能干细胞的畸胎瘤生成检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1试剂、实验工具以及实验材料的收集

绒毛细胞：由海南医学院附属医院生殖医学中心经无菌条件B超引导下抽取绒毛组织，并从中原代分离培养；标本已经捐助夫妇知情同意，并签署知情同意书后使用。

mTeSR^TM1工作液的配制

在后续实施例中所用的iPSC培养基mTeSR^TM1(StemCell)为商品化生产的培养基，包括mTeSR^TM1 basal和mTeSR^TM1 supplemental，按产品说明书的配制方法：将mTeSR^TM1supplemental(100ml)置于4摄氏度过夜解冻，次日，在生物安全柜中，将解冻的mTeSR^TM1supplemental加入到mTeSR^TM1 basal培养基(400ml)中，充分混匀，分装至50ml离心管(40ml/管)，于-20摄氏度保存，使用前将其置于4摄氏度过夜解冻，解冻的培养基不用时4摄氏度保存，有效期为2周。

CHANG Amnio^TM培养基的配制

在后续实施例中所用的的绒毛细胞培养基CHANG Amnio^TM(Irvine Scientific)为商品化生产的培养基，按产品说明书的使用方法：将CHANG Amnio^TM(100ml)置于4摄氏度过夜解冻，次日，在生物安全柜中，将解冻的CHANG Amnio^TM充分混匀，分装至50ml离心管(40ml/管)，于-20摄氏度保存，使用前将其置于4摄氏度过夜解冻，解冻的培养基不用时4摄氏度保存，有效期为2周。

细胞冷冻液的配制

按下列方法配制细胞冷冻液，所有试剂及耗材在配制及使用过程中均要求无菌，并将配好的冷冻工作液在4摄氏度保存，使用期限为1周内。

(1)绒毛细胞冷冻液(含90％胎牛血清，10％二甲亚砜)配制：取15ml无菌试管，加入胎牛血清(FBS)9ml后，加入1ml二甲亚砜(DMSO)混匀。

(2)iPSC冷冻液(含60％mTeSR^TM1，10％DMSO，30％DFBS)配制：取15ml无菌试管，加入iPSC培养基mTeSR^TM1 6ml后，分别加入透析型胎牛血清(DFBS)3ml、二甲基亚砜1ml，混匀。

EDTA工作液(0.5mM)的配制

在后续实施例中所用的EDTA为商品化生产的消化液(购自上海双螺旋生物科技有限公司)，储存液为0.5M EDTA(pH 8.0)，工作浓度为0.5mM。使用时将0.5M EDTA按500×的比例用DPBS(无钙镁离子的磷酸盐缓冲液，购自life technologies)稀释即为工作液。

Matrigel^TM工作液的配制

在后续实施例中所用的无饲养层培养体系培养iPSC，所用的基质为BD Matrigel^TM(BD公司)，按产品说明书的使用方法将BD Matrigel^TM(5ml)置于4摄氏度过夜解冻，次日，在生物安全柜中，将解冻的Matrigel^TM置于冰上并充分混匀，分装至0.5ml EP管(280ul/管)制成母液，-20摄氏度保存。使用之前4摄氏度解冻，每50ml DMEM/F12中加280微升的Matrigel^TM母液混匀即为工作液。

mTeSR^TM1+4i工作液的配制

在后续实施例中所用的使用到的小分子化合物(抑制剂或诱导剂)包括：PD0325901、IR99021、A83-01和Thiazovivin，即4i(均购自STEMGENT Stemolecule^TM)。其中，A83-01和Thiazovivin为粉剂，PD0325901、CHIR99021为液体。储存及使用均要避光。

(1)用474.5微升DMSO(sigma公司)将A83-01溶解成50mM(储存浓度为10mM，工作浓度为0.5微摩尔/升)；用321.2微升DMSO将Thiazovivin溶解成100mM(储存浓度为10mM，工作浓度为0.5微摩尔/升)；同时，PD0325901储存浓度为10mM，工作浓度为1微摩尔/升；CHIR99021储存浓度为10mM，工作浓度为3微摩尔/升，CHIR99021。以上化合物的储存液于-20摄氏度中可保存6个月。

(2)量取50ml的mTeSR^TM1培养基于50ml离心管中，并分别加入上述化合物配制成的工作液，其中PD0325901加5微升、CHIR99021加15微升、A83-01加2.5微升、Thiazovivin加2.5微升，充分混匀即为mTeSR^TM1+4i工作液。用锡箔纸包紧以达到避光效果，并4摄氏度保存待用。

玻璃管制作

将3ml玻璃巴氏吸管细头用酒精灯小火预热，然后把要拉的部位在外火焰加热软化，缓慢而均匀地转动玻璃管，两手用力要均匀，转速要一致，以免玻璃管在火焰中扭曲。待烧到红黄时弯曲到30°左右的角度才从火焰中迅速取出，顺着管口方向边拉。待冷却后，按所需要的长度截断，并将毛细部分一头用火焰封死，即可用来做纯化克隆及传代，成型玻璃管如图1所示。

绒毛细胞(原始细胞)的获得

在后续实施例中所采用的绒毛细胞为无菌条件经B超引导穿刺取得的绒毛组织分离获得，其分离、培养传代、冷冻贮存方法如下：

(1)通风橱或生物安全柜在实验前紫外消毒30分钟，标记并检查相应的试管和样本瓶。

(2)取2个100mm培养皿，在两个培养皿中的一个中加入约5ml含双抗(100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的链霉素)的PBS，用于后续对绒毛样品进行清洗。

(3)将两个培养基中的另一个放在立体显微镜架物台上，打开盖子，向培养皿中滴三滴PBS，依次编号为液滴1、液滴2、液滴3。

(4)在一级生物安全柜中，将所有的绒毛样品加入到步骤(2)中含有5ml双抗的100mm培养皿中；在显微镜视野下，用预先经过消毒的眼科镊挑取适量的绒毛组织，分离掉明显的母体组织和血块。

(5)将绒毛转移到步骤(3)中的液滴1中，如果样品中还含有血块或者母体组织，则继续分离血块和母体组织，之后取出绒毛并转移到液滴2中观察并继续分离血块和母体组织直至干净为止，最后将绒毛在液滴3中进行冲洗。

(6)取1ml的0.25％胰酶-EDTA，加入到在步骤(3)的培养皿中并做成液滴，将绒毛从液滴3取出并沥干，并将绒毛转到上述做好的0.25％胰酶-EDTA液滴上充分混匀，消化5min。

(7)把步骤(6)中经过胰酶-EDTA消化的绒毛悬液转移到干净无菌的15mL离心管中，向离心管中加入含有2％胎牛血清(FBS)的PBS至13mL以终止胰酶-EDTA的消化，之后按照1500rpm的转速离心5min。

(8)离心后，去除离心管的上清液，向离心管中加入1.5mLPBS及0.5mL胶原蛋白酶Ⅰ(胶原蛋白酶Ⅰ的终浓度为500U)，充分混匀，置于37摄氏度水浴箱中水浴30min，其间每隔7min要充分振荡摇匀一次以帮助绒毛消化。

(9)肉眼观察绒毛标本是否已经被消化完全，如果没有消化完全可适当延长消化时间，至绒毛基本消化完全为止。

(10)向上述15ml离心管中加入PBS至体积为12mL，充分混匀后按照1500rpm的转速离心5min，以漂洗掉残留的胶原蛋白酶。取上清，重复步骤(10)一次。

(11)从上述15ml离心管中吸去上清保留细胞沉淀，并向剩余的细胞沉淀中添加1mL的CHANG Amnio^TM培养基到离心管中重悬细胞沉淀，并将所得到的重悬浮液转移到25cm²培养瓶或者培养管中，补足培养基，在37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中静置培养；第3天观察细胞是否有细菌污染，第6-7天观察所培养的细胞生长情况并更换培养基或传代及冻存细胞。

传代的操作包括：(1)吸弃旧培养基，用适量PBS洗涤细胞2次；(2)采用1ml 0.25％胰酶-EDTA(GIBIO公司，使用前37摄氏度预温15min)室温下消化1min，在消化过程中应在解剖显微镜下观察，待见到大多数细胞的伪足收起，并出现多数细胞呈球状时，向培养瓶或培养管中加入3ml含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液充分混匀以终止消化；(3)将细胞悬液用10ml移液管转移到15ml离心管中，按照1500rpm的转速离心5min，弃上清；(4)向离心管中加入5ml CHANG Amnio^TM培养基重悬细胞沉淀，将所得到的重悬浮液平均分配到两个25cm²培养皿中，并在37摄氏度，5％二氧化碳的条件下培养。次日观察细胞均贴壁生长，每天更换培养基直至下次传代或冻存。

绒毛细胞的冻存与解冻方法如下：

绒毛细胞采用慢冻法冷冻，待细胞密度达到80％-90％时即可冷冻，具体步骤如下：

(1)针对经过传代培养的绒毛细胞，吸弃培养基后利用PBS洗涤细胞2次；(2)采用1ml 0.25％胰酶-EDTA(GIBIO公司，使用前37摄氏度预温15min)室温下消化1min，在消化过程中应在解剖显微镜下观察，待见到大多数细胞的伪足收起，并出现多数细胞呈球状时，向培养瓶或培养管中加入3ml含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液充分混匀以终止消化；(3)取20微升于血细胞计数板进行计数；(4)将细胞悬液用10ml移液管转移到15ml离心管中，按照1500rpm的转速离心5min，弃上清；(5)按照1×10⁶个细胞中加入1ml含10％DMSO的FBS冷冻工作液，利用FBS冷冻工作液重悬离心后的细胞沉淀，并将重悬浮液分配至冷冻管中，每个冷冻管分配1毫升重悬浮液；(7)将冷冻管置于程序降温盒中，在﹣80摄氏度深低温冰箱中过夜，次日将冻存管转移至液氮中长期储存，即完成冷冻。

解冻

可使用处在培养传代过程的新鲜的绒毛细胞作为重编程诱导细胞用于制备诱导多能干细胞，也可以解冻已经冻存的绒毛细胞用作重编程诱导细胞用于制备诱导多能干细胞，具体解冻方法如下：(1)从液氮中取出装有细胞的冻存管，置于37摄氏度水浴箱中，待冻存管中尚存绿豆大小的冰块时将冻存管取出；(2)用1ml移液枪头将冷冻管中解冻后的细胞悬液吹打均匀并转移至15ml离心管，加入CHANG Amnio^TM培养基4ml，按照1500rpm的转速离心5min；(3)离心后，从离心管中吸弃上清，加入CHANG Amnio^TM培养基重悬细胞，并将所得到的重悬浮液转移到25cm²培养瓶中，补足培养基，在37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中培养，备用。

诱导iPSC培养板准备

iPSC的细胞培养板于细胞接种前准备，准备好的培养板保存于培养箱中，使用有效期为1周。培养皿的准备步骤如下：

(1)Matrigel^TM包被培养皿：在每个六孔板的孔中加入Matrigel^TM工作液1ml，37摄氏度放置0.5h，使基质均匀包被培养板底。

(2)换液：iPSC接种前，吸弃培养板中Matrigel^TM，加入2ml CHANG Amnio^TM培养基，在培养箱中平衡至少一个小时后使用。

实施例2绒毛细胞诱导多能干细胞(iPSC)的诱导

在本实施例中，采用通过电穿孔方法将包含多能干细胞诱导因子的cDNA或miRNA簇的质粒导入步骤实施例1中所得到的绒毛细胞中，所采用的多能干细胞诱导因子为0CT4、S0X2、SV40LT、KLF4和microRNA302-367的组合。然后，将引入含有多能干细胞诱导因子编码核酸的绒毛细胞转入无细胞饲养层、CHANG Amnio^TM培养基环境下培养，然后再转入无血清、无细胞饲养层的人胚胎干细胞培养环境中，培养20天后，获得大量生长典型的原始诱导多能干细胞克隆，将这些克隆挑取后继续培养。具体操作步骤如下：

(1)电转前2～3天，将细胞解冻或者传代，至转化前使细胞密度约70％-85％。吸弃旧培养基，加入2ml DPBS洗涤细胞2次，吸弃DPBS；

(2)采用1ml 0.25％胰酶-EDTA(GIBIO公司，使用前37摄氏度预温15min)室温下消化1min，在消化过程中应在解剖显微镜下观察，待见到大多数细胞的伪足收起，并出现多数细胞呈球状时，向培养瓶或培养管中加入3ml含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液充分混匀以终止消化；

(3)取20微升于血细胞计数板进行计数；

(4)将细胞悬液用10ml移液管转移到15ml离心管中，按照300g的转速离心5min，弃上清,用DPBS重悬细胞，达到密度为1.2x10⁶个细胞/ml。取1ml加入EP管中，在300g的转速下离心5min，离心后收集细胞；

(5)向所收集的细胞中，加入DPBS(对于1mm电击杯加100微升DPBS，对于2mm电击杯加400微升DPBS)，并缓慢混匀细胞；

(6)向EP管的细胞悬液中加入包含多能干细胞诱导因子的质粒充分混匀；

(7)将细胞-质粒悬液转移至电击杯中，将电击杯放到电击巢中；

(8)设置多功能细胞融合仪(Eppendorf公司)程序和模式。

模式：真核细胞

电压：200V

电击时间：300微秒

电击次数：2次；

(9)按下Start键开始电击，电击后将细胞继续停留于电击杯中10min；

(10)取出电击杯，用移液器轻轻混匀电击杯中的细胞悬液，将细胞悬液平分成两份(每份细胞量约为6x10⁵)并接种到前面准备的六孔板(Matrigel^TM包被培养皿)中，轻轻晃动孔板，使细胞均匀分布，置于37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中培养。

(11)接种培养24小时后，若细胞贴壁良好，可每天换液至细胞汇合度约40％，之后，更换为2ml mTeSR^TM1或者mTeSR^TM1+4i进行诱导培养。

(12)更换mTeSR^TM1或者mTeSR^TM1+4i培养基后需隔天换液，至细胞长出5～8个具有典型ES集落的致密形态的克隆后可撤去mTeSR^TM1+4i，以后每天换液(若细胞克隆较多，培养基可增加至3ml/孔)；而且在第25天时，证明了上述这些克隆集落为AP染色阳性。

(13)mTeSR^TM1培养至20天后，ES样集落克隆占据低倍镜视野下的1/2，克隆边缘清晰平滑，克隆内细胞核质比大，细胞排列紧密均一，我们挑取来自不同位置的6个克隆在无血清、无细胞饲养层的人胚胎干细胞培养环境中维持培养，并进行进一步表征验证。

为了方便理解，图2中总结了在绒毛细胞从转染到诱导形成诱导多能干细胞的过程中所采用的培养基的类型和时间。

绒毛细胞从解冻培养到诱导成iPSC的中细胞生长状态的改变过程如图3所示。其中，图3-A为绒毛细胞解冻培养第1天的生长状态：细胞幼嫩，死细胞和杂质均较少；图3-B转染前绒毛细胞的生长状态：细胞拉长，密度约为70％；图3-C为绒毛细胞转染后第1天的生长状态：死细胞较少，贴壁密度约为10％；图3-D为绒毛细胞转染后第10天的生长状态：显微镜下可以看到一团形态与周围不一样的细胞团(形变的细胞克隆)，并且高倍镜下可以观察到有少量核质比较大的细胞；图3-E为绒毛细胞转染后第14天的生长状态：形变的细胞克隆不断变大，克隆边缘清晰，细胞排列紧密，核质比明显增大；图3-F为绒毛细胞转染后第27天时进行的AP染色，染色结果为阳性。

实施例3绒毛诱导多能干细胞的传代和维持

在本实施例中，克隆纯化及传代初期采用机械法传代iPSC。当iPSC的克隆生长直径1mm左右，并且有一定厚度时即可传代；具体操作步骤如下：

(1)用前面所制备的玻璃管在解剖显微镜下将细胞克隆切割成大小相等的细胞块(每个细胞团块大小约300-600微米)。

(2)用10微升移液枪头将这些细胞块转移到提前准备好的培养皿中，置于培养箱中培养，即完成传代。

机械法传代前后细胞克隆的状态如图4-A和图4-A’所示，图4-A为机械法纯化前克隆的状态：克隆中间发白的地方及周围散开的为分化了的细胞，需要纯化以获得更均一的克隆；图4-A’为机械法纯化后克隆的状态：细胞克隆与周围界限明显，细胞排列紧密均一。

在本实施例中，克隆纯化及传代后期采用EDTA消化法传代iPSC。当iPSC的克隆生长到孔皿的50％～80％，并且分化细胞少时即可传代；具体操作步骤如下：

(1)弃掉旧培养基，加入0.5mM EDTA工作液消化3min(37摄氏度培养箱中)。

(2)吸去EDTA溶液，加入1ml mTeSR^TM1培养基，用移液器轻轻将细胞从孔皿上吹打下来，并转移到提前准备好的培养皿中，混匀充分，置于培养箱中培养，即完成传代。

消化法传代前后细胞克隆的状态如图4-B和图4-B’所示,细胞克隆界限依然明显，细胞排列紧密均一、核质比高。

实施例4绒毛诱导多能干细胞的的冷冻保存

在本实施例中，采用程序化冻存iPSC，当iPSC的克隆生长到孔皿的70％～90％时即可用于冷冻保存；具体操作步骤如下：

(1)弃掉旧培养基，加入0.5mM EDTA工作液消化3min(37摄氏度培养箱中)。

(2)吸去EDTA溶液，加入1ml iPSC冷冻液，用移液器轻轻将细胞从孔皿上吹打下来，混匀充分并转移到冻存管中，做好标记。

(3)将冷冻管置于程序降温盒中，在﹣80摄氏度深低温冰箱中过夜，次日将冻存管转移至液氮中长期储存，即完成冷冻。

实施例5绒毛诱导多能干细胞的解冻

在本实施例中，采用快速解冻的方法将绒毛诱导多能干细胞复苏，具体步骤如下：

(1)从液氮中取出装有细胞的冻存管，置于37摄氏度水浴箱中，待冻存管中尚存绿豆大小的冰块时将冻存管取出。

(2)用1ml移液枪头将冷冻管中解冻后的细胞悬液吹打均匀并转移至15ml离心管，缓慢加入DMEM/F12培养基4ml，边加边晃动便于充分混匀，按照1500rpm的转速离心5min。

(3)吸弃上清，加入mTeSR^TM1培养基重悬细胞，并转移到相应的培养皿中，补足培养基，放到37摄氏度、5％二氧化碳的培养箱中培养。

绒毛诱导多能干细胞程序化冷冻前和解冻培养后细胞克隆的状态分别如图4-C和图4-C’所示。经过程序化冷冻后解冻培养的绒毛诱导多能干细胞依然保持着类似于胚胎干细胞的形态：细胞核大,有一个或几个核仁，细胞克隆界限明显，细胞排列紧密。由此，可见绒毛诱导多能干细胞程序化冷冻前后细胞的形态保持不变，可以证明绒毛诱导多能干细胞可以像其他类型的iPSC一样用该方法进行保存。

实施例6绒毛细胞诱导多能干细胞的鉴定

1、碱性磷酸酶染色实验(AP染色)

在本实施例中，发明人挑取克隆后剩余的细胞克隆进行AP染色，步骤如下：

(1)洗涤：吸弃旧培养基，2ml PBS洗孔板2次。

(2)固定：加入1.5ml 4％多聚甲醛，在室温下固定2min。

(3)洗涤：弃固定液，0.5ml TBST(Tris-HCL NaCl Twwen20)洗孔板2次。

(4)平衡：加入2ml AP缓冲液，在室温下平衡5min。

(5)染色：弃AP缓冲液，加入1.5ml AP显色液(NBT+PICP+AP Buffer)，避光染色30min。

(6)洗涤：弃染色液，2ml PBS洗2次，加1.5ml PBS后，奥林巴斯倒置显微镜下观察显色情况并拍照记录，结果如图3-F所示。

已知碱性磷酸酶与细胞的分化多能性相关，因此AP染色可以反映出细胞的多能性状态。通常，未分化的诱导多能干细胞能特异性地高表达碱性磷酸酶，而在分化的诱导多能干细胞中，碱性磷酸酶的表达量会急剧下降。通过AP染色对绒毛诱导多能干细胞克隆进行鉴定，结果显示本发明获得的绒毛诱导多能干细胞高表达碱性磷酸酶，结果如图3-F所示。正如图3-F所显示的，绒毛诱导多能干细胞克隆碱性磷酸酶染色结果(阳性)。

2、免疫荧光染色

将细胞爬片置于十二孔板内，用Matrigel^TM包被细胞爬片。将绒毛细胞诱导多能干细胞传代至此十二孔板中，生长3-4天，用于免疫荧光染色，结果如图5所示。具体步骤如下：

(1)染色前，弃旧培养基，1ml PBS洗涤3次，加入0.5ml 4％多聚甲醛，室温固定30min。

(2)弃固定液，1ml PBS洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；加入0.5ml通透液(0.2％Triton-X100在PBS中的溶液)，室温通透30min。

(3)弃通透液，1ml PBST洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；加入0.5ml封闭液(10％山羊血清、5％BSA in PBST)，室温封闭1小时。

(4)弃封闭液后，加0.5ml一抗(该一抗包括：兔抗Oct4IgG，Abcam，ab19857；小鼠抗SSEA4IgG，Abcam，ab16287；小鼠抗TRA-1-60IgM,Millipore，MAB4360；以及小鼠抗TRA-1-81IgM，Millipore，MAB4381)，用比十二孔板稍小的封口膜覆盖液面，4摄氏度湿盒避光处理1小时。

(5)弃一抗，1ml PBST洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；加入0.5ml二抗(该二抗包括：山羊抗兔IgM Alexa Flour488，Invitrogen，A11008；山羊抗小鼠IgM Dylight488，GeneTex，GTX76752；以及山羊抗小鼠IgG Alexa Flour&reg 488，Abcam，ab150117)，室温湿盒避光孵育处理1小时。

(6)弃二抗，1ml PBST洗涤3次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；加入0.5ml DAPI，湿盒避光处理5min。

(7)弃DAPI染液，0.5ml PBS避光洗涤2次，每次洗涤均置于摇床上摇晃5min；加入新的PBS 0.5ml，于奥林巴斯倒置显微镜下观察拍照记录，或者用封片剂处理制成玻片观察并保存。以便检测解冻后经传代培养的iPSC克隆的多能性标志物表达情况。

图5结果显示，根据本发明实施例所得到的绒毛诱导多能干细胞经过OCT-4、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81免疫荧光染色，多能性标志物检测结果均为阳性表达。其中图5(A)中表示展现绿色荧光的OCT-4表达于细胞表面；展现绿色荧光的SSEA-4表达于细胞膜表面；展现绿色荧光的TRA-1-60表达于细胞膜表面；展现绿色荧光的TRA-1-81表达于细胞膜表面；图5(B)显示了细胞核DAPI染色阳性蓝色。

3、核型分析

将本发明实施例中所制备的绒毛细胞诱导多能干细胞传代至在Matrigel^TM包被的六孔板上，当六孔板两个孔的细胞密度达70％-80％，即可用于做核型分析(结果如图6所示)。具体操作步骤如下：

(1)吸弃旧的培养液，更换2mL新鲜的mTeSR^TM 1培养基。

(2)滴入14微升(20ug/ml)的秋水仙胺(使最终工作浓度为：0.14微克/ml)处理3h。

(3)吸弃含有秋水仙胺的培养基，用2mL PBS洗涤2次，用1mL 0.25％胰酶-EDTA消化细胞1min。

(4)加入1mL含10％FBS的培养基终止消化，将细胞吹打下来(要求尽可能单个细胞)，转移至15ml离心管，按照1500rpm的转速离心5分钟。

(5)弃上清，留沉淀。向15ml离心管内加入37摄氏度预温的低渗液0.075mM KCl 8ml，用滴管反复冲打分散细胞，置于37摄氏度水浴箱中低渗处理12min。

(6)向低渗的细胞悬液内缓慢加入2ml固定液(甲醇和乙酸按体积比3：1的比例混合)，轻轻混匀后置室温下固定3min后，按照1500rpm的转速离心5分钟。

(7)弃上清，留沉淀。沿管壁缓慢加入8ml固定液，轻轻混匀后放37摄氏度水浴箱预固定30min，按照1500rpm的转速离心5分钟。

(8)弃上清，留下沉淀细胞，重新加固定液1ml(加固定液的量根据沉淀物的量和制片后细胞的分布情况调整)，混匀后液体成毛玻璃状，滴冰片，每块玻片2滴，过酒精灯干燥。

(9)将制好的玻片置90摄氏度烤箱中烘烤25min。

(10)取3个50ml立式染色缸(分别标记为染色缸Ⅰ、II、III)，置37摄氏度水浴中预温30min。染色缸Ⅰ加入磷酸盐缓冲液49ml，1.25％胰酶1ml，混匀，用于细胞遗传消化显带，消化时间1min 20s。染色缸Ⅱ内加大约50ml生理盐水，用于漂洗。染色缸Ⅲ内加入双蒸水45ml，染色液两管，混匀，用于染片，染片时间4min。取出，用自来水冲洗，置烤箱中将玻片烤干，或自然晾干。奥林巴斯正置显微镜观查：15-20个核型，并通过染色体自动扫片分析系统(蔡司MetaSystems)扫描分析。

图6-A显示了原始绒毛细胞(转染前的细胞)核型鉴定结果，图6-B显示了绒毛诱导多能干细胞传代培养7代后的细胞的核型鉴定结果，因此图6结果显示为所得到的诱导多能干细胞具有正常核型。

4、实时荧光定量PCR鉴定iPSC和原始绒毛细胞中干细胞标志物的表达

在本实施例中，采用表1所示的引物对各标志物基因的表达进行分析

表1 Q-PCR所用特异性引物及其相应的扩增基因片段长度

收集原始绒毛细胞(未经过转染)和培养5代以后的iPS细胞。使用RNA提取试剂盒(Magen)，按照说明书操作提取总RNA，并按照下列步骤将所得到RNA反转录为DNA：

(1)取上述提取的RNA 10微升(100ng/微升)置于PCR管中，加入Oligo(dT)1.5微升，瞬时离心。

(2)PCR管置于80摄氏度5min后立即置于冰上5min。

(3)依次向PCR管中加入下列试剂(见表2)：ImProm-II^TM 5X反应缓冲液6微升、MgCl₂(25mM)7.2微升、dNTP(10mM)1.5微升、RNA酶抑制剂1.5微升、逆转录酶0.75微升、RNase-Free Water 1.55微升，总反应体系为30微升。

表2 逆转录PCR体系

(4)震荡混匀，瞬时离心，上机。42摄氏度反应60min，99摄氏度反应10min，得到cDNA。

接下来，按照下列步骤进行实时荧光定量PCR检测

(1)依次向PCR管中加入下列试剂：2×MIX 10微升、上游引物(10pmol/ul)：0.15微升、下游引物(10pmol/ul)：0.15微升、ROX:0.3微升、cDNA：1微升、H₂O：8.4微升，总反应体系为20微升。其中，多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的特异性引物及其相应的扩增基因片段长度见表1。

(2)将上述反应体系混匀，瞬时离心，然后利用实时荧光定量PCR仪(Agilent Mx3000P)进行扩增，扩增程序为：95摄氏度预变性，5min；95摄氏度变性，40s，60摄氏度退火，30s，72摄氏度延伸，30s，反应40个循环；最后再72摄氏度延伸，7min。

由此，利用实时定量PCR分别检测多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达情况。结果如图7所示。图7结果显示，使用本申请的方法获得的iPSC多能性基因Sox2、Oct4和Nanog的表达均上调，而这些因子在原始绒毛细胞中均没有可检测到的表达。

实施例7畸胎瘤生成检测

(1)将未分装的Matrigel，按1:3用DMEM/F12稀释。

(2)每在小鼠上注射一个部位，准备一个孔的六孔板细胞，约1.5×10⁶-2×10⁶个细胞。一般一株细胞注射2只小鼠，每只小鼠注射两个部位。

(3)将待注射细胞用Dispase消化后，用稀释的Matrigel重悬。

(4)将重悬后的细胞立即对NOD-SCID小鼠进行皮下或肌肉注射，并做好标记。

(5)约4-6周后，会有畸胎瘤长出。

(6)处死小鼠，取出畸胎瘤，制作切片进行苏木精-伊红染色。显微镜寻找观察内、中、外三个胚层的典型细胞。结果如图8所示，图8结果显示，使用根据本发明实施例的方法所获得的诱导多能干细胞具有体内分化成三个胚层的能力。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种诱导多能干细胞，其来源于绒毛细胞。

2.一种制备权利要求1所述的诱导多能干细胞的方法，其特征在于，包括：

(1)使多能干细胞诱导因子在绒毛细胞中表达；以及

(2)将步骤(1)中所得到的绒毛细胞在适于去分化的条件下进行培养，以便获得所述诱导多能干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述多能干细胞诱导因子包括0CT4、S0X2、SV40LT、KLF4以及microRNA302-367。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，将携带表达所述多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞中，

优选地，采用电转染法，将携带表达所述多能干细胞诱导因子的核酸分子的质粒转入所述绒毛细胞中。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述质粒包括：

第一质粒，所述第一质粒携带表达所述0CT4、S0X2、SV40LT和KLF4的核酸分子；以及

第二质粒，所述第二质粒携带表达所述microRNA302-367的核酸分子。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述电转染采用200V或300V的电压并且电击200或300微秒，优选地，所述电转染采用200V的电压，电击300微秒。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，将所述步骤(1)中所得到的绒毛细胞依次在绒毛细胞培养基和诱导培养基中进行培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述绒毛细胞培养基为CHANG Amnio^TM培养基。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为mTeSR^TM1，

任选地，所述诱导培养基进一步含有：

终浓度为0.5微摩尔/升的A83-01；

终浓度为0.5微摩尔/升的Thiazovivin；

终浓度为1微摩尔/升的PD0325901；

终浓度为3微摩尔/升的CHIR99021。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，利用所述绒毛细胞培养基培养24小时，利用所述诱导培养基培养20天。