CN105779395A - 一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法，所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，是以犬脂肪间充质干细胞作为宿主细胞，转染携带SV40大T抗原(Ttag)的慢病毒载体，将Tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组中，经过连续传代筛选得到表达SV40大T抗原基因且具有多向分化潜能的细胞系。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持较强的分裂增殖，不发生衰老和凋亡，同时能节省培养基成本，是一种永生化的细胞系。

Description

一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法。

背景技术

宠物在许多现代家庭中发挥着不可替代的情感调剂作用。但是许多严重的宠物外伤、代谢性疾病等问题却严重影响了宠物的生活质量。目前的兽医临床治疗手段仍然不能从根本上解决许多宠物高发的内外科疾病。因此，人们寄希望于干细胞替代疗法能够解决这些问题。

脂肪间充质干细胞(Adipose-derivedmesenchymalstemcells)是一类存在于脂肪组织中的成体干细胞，能自我更新，在一定的诱导条件下能向成骨细胞、脂肪细胞、胰岛细胞等多个方向分化，其特点是异体、甚至异种移植都不引起免疫排斥反应，组织来源充足，分离培养操作简便，脂肪间充质干细胞的移植也不存在道德伦理等问题。因此，犬脂肪间充质干细胞可作为最佳的供体细胞，为许多宠物临床疾病治疗带来新希望。

体外分离、克隆犬脂肪间充质干细胞作为种子细胞，可以用于组织工程和细胞替代治疗。间充质干细胞的研究已经有很多较好的进展(王赟等，猪胰腺干细胞分离与培养[J].中国农业科学,2008,41(8):2554-2562)；冯如鹏等，胎猪胰岛源胰腺干细胞分离培养与诱导分化试验[J].中国农业科学,2007,40(3):582-587)等先后在动物各种来源的间充质干细胞的分离培养，以及细胞生物学、分子生物学鉴定，诱导分化等方面做了大量的工作；分离到的犬脂肪间充质干细胞在体外定向诱导后已分别检测到成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、原始生殖细胞的标志。但分离出的间充质干细胞随着传代次数的提高，其活力越来越差，最终发生凋亡，难以存活。

发明内容

为了解决分离出的犬脂肪间充质干细胞随着传代次数的提高活力差和难以存活的问题，本发明的目的在于提供一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系及其构建方法。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系，是以犬脂肪间充质干细胞作为宿主细胞，利用携带SV40大T抗原基因序列的慢病毒载体，将Tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组中，经过连续传代筛选得到表达SV40大T抗原且具有多向分化潜能的细胞系。

所述的细胞为成纤维样，呈多角形和短梭状，有两个或两个以上的核仁，细胞间存在接触抑制。

永生化的犬脂肪间充质干细胞系在传代培养50代以后SV40大T抗原还能够被表达。

所述是通过pLOX-Ttag-iresTK表达载体对Tag基因进行携带，将Tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组。

所述的pLOX-Ttag-iresTK表达载体是与包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG构成慢病毒转染载体。

所述的多向分化潜能包括向三胚层细胞分化的潜能、向成骨细胞分化的潜能、向软骨细胞分化的潜能。

一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)犬脂肪间充质干细胞的传代培养：将无菌采集的犬腹腔脂肪去杂后切碎，利用Ⅰ型胶原酶于37℃震荡充分消化；然后加入培养液终止消化后离心；弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，加入培养液吹打均匀，200目筛网过滤，滤液离心后弃去上清，培养液重悬细胞，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；待细胞生长至90％融合时，以胰蛋白酶消化，以1:3比例传代，每两天换液一次；

所述的培养液为：α-MEM培养基中加入10％体积分数的FBS、2mol/L的谷氨酰胺和100mg/mL的青霉素/链霉素；

2)包装携带SV40大T抗原基因的慢病毒：取293T细胞接种于10％FBS无抗性DMEM培养液中，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，然后将转染复合物逐滴加入；培养16h后，换入含有10％体积分数的FBS、0.01mol/L胆固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和chemicallydefinedlipidconcentrate的AdvancedDMEM病毒包装液，继续培养48h后，收集细胞上清，得到慢病毒上清液；

所述的转染复合物为：将包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG和质粒pLOX-Ttag-iresTK混合后加入Opti-MEM培养液中，然后加入转染试剂Turbofect，混匀放置；

3)待传代的犬脂肪间充质干细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒上清液与α-MEM培养液按1:1的体积比例换入犬脂肪间充质干细胞；转染8h后，换入3mLα-MEM培养液；待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养，在37℃、5％CO₂条件连续传代培养超过50代后，得到稳定转染Ttag基因的犬脂肪间充质干细胞。

具体包括以下操作：

1)犬脂肪间充质干细胞的传代培养：将无菌采集的犬腹腔脂肪，置于预冷的PBS中冲洗并除去血液、筋膜后剪成碎组织块，加入Ⅰ型胶原酶，于37℃震荡消化1h；加入培养液终止消化后1000rpm，离心5min；弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，加入培养液吹打均匀，200目筛网过滤，滤液1000rpm，5min常温离心；弃去离心后的上清，培养液重悬细胞并计算细胞活力；按每孔2×10⁵个细胞接种于12孔板，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；待细胞生长至90％融合时，以0.25％质量分数的胰蛋白酶消化，以1:3比例传代，每两天换液一次；

2)包装携带SV40大T抗原基因的慢病毒：取293T细胞以1×10⁶个/mL的密度接种于10％FBS无抗性DMEM培养液的60mm培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，当细胞密度达60％时，将包装质粒pLP/PsPAX2.6μg、pLP/VSVG1.8μg和质粒pLOX-Ttag-iresTK1.6μg加入600μLOpti-MEM培养液中，后加入6μL转染试剂Turbofect，混匀放置20min；将转染复合物逐滴加入培养皿；培养16h后，换入含有10％体积分数的FBS、0.01mol/L胆固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和1×chemicallydefinedlipidconcentrate的AdvancedDMEM病毒包装液，继续培养48h后，收集细胞上清，于-80℃保存；

3)待犬脂肪间充质干细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒上清液与α-MEM培养液按1:1的体积比例换入犬脂肪间充质干细胞进行转染；转染8h后，换入α-MEM培养液；待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养，在37℃、5％CO₂条件连续传代培养超过50代后，得到稳定转染Ttag基因犬脂肪间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1)本发明通过将pLOX-Ttag-iresTK慢病毒载体转染犬脂肪间充质干细胞，经过连续传代得到具有多向分化潜能的永生化的犬脂肪间充质干细胞系；重组后的犬脂肪间充质干细胞在传代后仍然能够表达SV40大T抗原，且细胞生长良好，表现出多向分化潜能(包括向三胚层细胞分化、向成骨细胞分化、向软骨细胞分化的多分化性)；解决了分离出的犬脂肪间充质干细胞随着传代次数的提高活力差和难以存活的问题。

2)本发明筛选获得的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其生长状况良好，转染Ttag后的细胞潜伏期较未转组染细胞有所缩短，转染Ttag组细胞对数增长期长，平台期细胞数量多，说明细胞具有很强的增殖能力；1：3传代的培养时间由未转染前的2天缩减至1.5天，且细胞的生命力较之以前的大大提高，便于规模化的应用；在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系，目前已能够传至50代。

3)本发明筛选获得的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其营养要求较低，原始分离得到的犬脂肪间充质干细胞的培养需要15％的胎牛血清、EGF、bFGF及尼克酰胺等各种营养因子，而现在只要求10％的胎牛血清，降低了培养的成本。

附图说明

图1为永生化的犬脂肪间充质干细胞形态学特征显微显示图。

图2为RT-PCR检测永生化的犬脂肪间充质干细胞系Ttag表达的结果图。

图3为永生化的犬脂肪间充质干细胞系的细胞生长曲线图；其中横坐标为时间(天数)，纵坐标为细胞数(10⁴)。

图4为永生化的犬脂肪间充质干细胞系的多能性干细胞特征性标志鉴定图。

图5为永生化的犬脂肪间充质干细胞系向成骨细胞分化后的特征性标志鉴定图。

图6为永生化的犬脂肪间充质干细胞系向软骨细胞分化后的特征性标志鉴定图。

具体实施方式

本发明提供一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系，是以犬脂肪间充质干细胞作为宿主细胞，转染pLOX-Ttag-iresTK慢病毒载体，经过连续传代得到的表达SV40大T抗原且具有多向分化潜能的转化体。该细胞系在体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡，是一种永生化的细胞系。以下通过对永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建、细胞形态特征、标志物的基因及免疫鉴定、诱导分化试验来做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

1、pLOX-Ttag-iresTK慢病毒载体的构建

pLOX-Ttag-iresTK慢病毒载体购自Addgene公司。

2、永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建

永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建具体包括以下步骤：

1)犬脂肪间充质干细胞的传代培养：

无菌采集宠物犬腹腔脂肪组织，置于预冷的PBS中冲洗并除去血液、筋膜等，后剪为1mm³左右的组织块，加入Ⅰ型胶原酶，于37℃震荡消化1h。加入培养液(α-MEM加入10％FBS、2mol/L谷氨酰胺、100mg/mL青霉素/链霉素)终止消化后1000rpm，离心5min。弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，加入培养液吹打均匀，200目筛网过滤，滤液1000rpm，5min常温离心。弃去离心后的上清，培养液重悬细胞，用台盼兰染色计算细胞活力。按每孔2×10⁵个细胞接种于12孔板，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。待细胞生长至90％融合时，以0.25％胰蛋白酶消化，以1:3比例传代，每两天换液一次；

2)包装携带SV40大T抗原基因的慢病毒。取293T细胞以密度1×10⁶个/mL，接种于10％FBS无抗性DMEM培养液的60mm培养皿中，37℃，5％CO₂培养箱中培养24h，当细胞密度达60％左右时，将包装质粒pLP/PsPAX2.6μg、pLP/VSVG1.8μg和质粒pLOX-Ttag-iresTK1.6μg加入600μLOpti-MEM培养液中，后加入6μL转染试剂Turbofect，混匀放置20min。将转染复合物逐滴加入60mm培养皿。培养16h后，换入3mL含有10％FBS、0.01mmol/L胆固醇、0.01mmol/L蛋黄卵磷脂和1×chemicallydefinedlipidconcentrate的1.5mLAdvancedDMEM病毒包装液，继续培养48h后，收集细胞上清，于-80℃保存。

3)待犬脂肪间充质干细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒上清液与α-MEM培养液按1:1的体积比例换入犬脂肪间充质干细胞；转染8h后，换入3mLα-MEM培养液。待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养。

4)将稳定转染pLOX-Ttag-iresTK的犬脂肪间充质干细胞传代培养，于α-MEM加入10％FBS、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺和100mg/mL青霉素/链霉素培养，在37℃、5％CO₂条件下连续传代连超过50代后得到永生化的犬脂肪间充质干细胞系。

3、永生化的犬脂肪间充质干细胞系的鉴定

3.1细胞形态学特征

将永生化的犬脂肪间充质干细胞在相差显微镜下观察形态变化，并与未转染的犬脂肪间充质干细胞进行比较。具体结果如图1所示，其中，A为原代分离的犬脂肪间充质干细胞(MSCs)，B为未转染组的MSCs，C、D为转染pLOX-Ttag-iresTK后的犬脂肪间充质干细胞(MSCs)；转染后永生化的犬脂肪间充质干细胞与未永生化的相比，其细胞形态相似为成纤维样，大多数细胞呈多角形和短梭状，呈网络状排列，有两个或两个以上的核仁，细胞间存在接触抑制。

3.2RT-PCR检测永生化的犬脂肪间充质干细胞系中目标基因SV40(大T抗原)的表达

根据Addgene公司提供的pLOX-Ttag-iresTK载体参考序列，设计并人工合成一对特异性检测引物P，该对引物能够扩增大小为386bp的片段；引物P为：

上游引物：TGACCTCCATAGAAGACACCG21；

下游引物：CAAATACCTCAGTTGCATCCC20。

细胞总RNA的提取：取第50代转染pLOX-Ttag-iresTK的犬脂肪间充质干细胞，PBS洗涤2～3次；然后加入1mLTrizol混匀，室温下静置5min进行细胞裂解，将裂解物转移到离心管，并向离心管中加入0.2mL氯仿，震荡，室温下静置15min，4℃，10000r/min离心15min；离心后取上层部分移入另一支离心管，加入0.2mL异丙醇，上下颠倒，轻轻混匀，室温下静置30min，4℃，10000r/min离心15min；弃上清，加入1mL75％乙醇振荡，7500r/min离心5min；将沉淀自然干燥(室温下放置10min左右)，用30μLDEPC水重悬RNA。

PCR扩增进行第一链cDNA的合成：

PCR扩增体系为：5×PrimeScriptBuffer2μL，500ng的总RNA，逆转录酶(PrimeScriptRTEnzymeMix)0.5μL，Random6mers2μL，Oliqo(dT)Primer0.5μL，RNaseFreeH₂O补齐至10μL；混匀，37℃孵育30min，然后85℃延伸5s，得到第一链cDNA。

PCR扩增双链cDNA，反应体系如下：双纯水9.1μl，10×PCRBuffer1.5μl，MgCl₂1.5μl，上、下游引物各0.3μL，Taq酶0.1μl，dNTPMixture1.2μl，第一链cDNA1.0μl，总体积为15.0μl。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min，4℃保存。

取5μlPCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示，与未转染组不表达Ttag相比，外源性的目的基因Ttag在转染后传代第50代细胞仍高表达Ttag。

5、生长曲线的测定

取传代的永生化的犬脂肪间充质干细胞(第35代)和未转染的第6代犬脂肪间充质干细胞，以0.5×10⁴个/孔的细胞密度接种24孔培养板上，每天取3孔，胰蛋白酶消化悬浮细胞，基础培养液中和，细胞计数，取平均值记作当天细胞数，连续计数7天。以细胞数(10⁴)为纵坐标，培养天数(d)为横坐标，绘制生长曲线，结果如图3所示。比较转染Ttag传代后的第35代和未转染第6代细胞生长曲线，其中转染Ttag后的细胞潜伏期较未转组染细胞有所缩短，转染Ttag组细胞对数增长期长，平台期细胞数量多，说明细胞具有很强的增殖能力。

所构建的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，体外传代50代以上仍有较好的活力，保持分裂增殖，不发生衰老和凋亡。

6、永生化的犬脂肪间充质干细胞系的分化潜能

脂肪间充质干细胞存在于脂肪组织，能自我更新，具有多向分化潜能。体外分离、克隆脂肪间充质干细胞，并定向诱导其分化为功能性细胞，是治疗各种组织缺损和老年退化性疾病的有效途径。

6.1诱导永生化的MSCs向三胚层细胞分化

1)取第35代永生化的MSCs，以5×10⁵个/孔的细胞密度接种35mm抗贴壁培养皿上，12h后细胞形成EB状细胞团，悬浮培养7d。在体视镜下挑出单个细胞团，接种于48孔培养板。

2)对48孔培养板中的EB细胞进行免疫荧光染色，细胞贴壁生长2d后用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗两次，0.1％Tris-HCL室温孵育10min，PBS洗两次，5％胎牛血清(PBS稀释)封闭，室温孵育30min，倾去血清，分别滴加PDX1(1︰500)、AFP(1︰200)、Desmin(1︰500)、PAX7(1︰500)、NSE(1︰100)和β-tublinⅢ(1︰1000)一抗工作液，4℃过夜，PBS洗两遍，滴加二抗(1︰500)工作液，室温孵育1h，PBS洗两遍，每次5min，33342染核5min，PBS洗两遍，每次5min，荧光显微镜下观察照相记录结果；

上述免疫荧光的一抗标志分别为三胚层分化的标记，检测结果分别如图4所示，其中，PDX1、AFP(内胚层)、Desmin、PAX7(中胚层)、NSE、β-tublin(外胚层)特异标记均呈阳性。

6.2诱导永生化的MSCs向成骨细胞分化

取第35代永生化的MSCs，在细胞爬片上长至80％融合时换为成骨诱导培养液(α-MEM，10％FBS，0.1μmol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L抗坏血酸)每2d换液。诱导16d后用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤3次，加入茜素红染液(0.1％茜素红溶于Tris-HCl，pH8.3)覆盖细胞，置于37℃温箱染色30min，PBS洗涤3次，倒置显微镜观察。检测结果如图5所示，可以看到分化成骨细胞的染色标志。

6.3诱导永生化的MSCs向软骨细胞分化

取第35代永生化的MSCs，在细胞爬片上长至20％融合时换为软骨诱导培养液(α-MEM，10％FBS，10μg/LTGF-β1，10μg/LIGF-1，37.5mg/L抗坏血酸，6.25mg/L转铁蛋白)进行诱导，每2d换液。诱导14d后用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤3次，加入阿尔新蓝染液，室温染色过夜。PBS洗涤3次，倒置显微镜观察。检测结果如图6所示，可以看到分化成软骨细胞的染色标志。

检测结果表明所构建的永生化的犬脂肪间充质干细胞系是一种永生化的细胞系，能够传至50代，而且具有多向分化潜能，解决了分离出的犬脂肪间充质干细胞随着传代次数的提高活力差和难以存活的问题。

Claims (8)

1.一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于，是以犬脂肪间充质干细胞作为宿主细胞，利用携带SV40大T抗原基因序列的慢病毒载体，将Tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组中，经过连续传代筛选得到表达SV40大T抗原且具有多向分化潜能的细胞系。

2.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于，其细胞为成纤维样，呈多角形和短梭状，有两个或两个以上的核仁，细胞间存在接触抑制。

3.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于，永生化的犬脂肪间充质干细胞系在传代培养50代以后SV40大T抗原还能够被表达。

4.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于，是通过pLOX-Ttag-iresTK表达载体对Tag基因进行携带，将Tag基因整合入犬脂肪间充质干细胞基因组。

5.如权利要求4所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于，所述的pLOX-Ttag-iresTK表达载体是与包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG构成慢病毒转染载体。

6.如权利要求1所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系，其特征在于，所述的多向分化潜能包括向三胚层细胞分化的潜能、向成骨细胞分化的潜能、向软骨细胞分化的潜能。

7.一种永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)犬脂肪间充质干细胞的传代培养：将无菌采集的犬腹腔脂肪去杂后切碎，利用Ⅰ型胶原酶于37℃震荡充分消化；然后加入培养液终止消化后离心；弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，加入培养液吹打均匀，200目筛网过滤，滤液离心后弃去上清，培养液重悬细胞，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；待细胞生长至90％融合时，以胰蛋白酶消化，以1:3比例传代，每两天换液一次；

所述的培养液为：α-MEM培养基中加入10％体积分数的FBS、2mol/L的谷氨酰胺和100mg/mL的青霉素/链霉素；

2)包装携带SV40大T抗原基因的慢病毒：取293T细胞接种于10％FBS无抗性DMEM培养液中，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，然后将转染复合物逐滴加入；培养16h后，换入含有10％体积分数的FBS、0.01mol/L胆固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和chemicallydefinedlipidconcentrate的AdvancedDMEM病毒包装液，继续培养48h后，收集细胞上清，得到慢病毒上清液；

所述的转染复合物为：将包装质粒pLP/PsPAX、pLP/VSVG和质粒pLOX-Ttag-iresTK混合后加入Opti-MEM培养液中，然后加入转染试剂Turbofect，混匀放置；

3)待传代的犬脂肪间充质干细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒上清液与α-MEM培养液按1:1的体积比例换入犬脂肪间充质干细胞；转染8h后，换入3mLα-MEM培养液；待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养，在37℃、5％CO₂条件连续传代培养超过50代后，得到稳定转染Ttag基因的犬脂肪间充质干细胞。

8.如权利要求7所述的永生化的犬脂肪间充质干细胞系的构建方法，其特征在于，具体包括以下操作：

1)犬脂肪间充质干细胞的传代培养：将无菌采集的犬腹腔脂肪，置于预冷的PBS中冲洗并除去血液、筋膜后剪成碎组织块，加入Ⅰ型胶原酶，于37℃震荡消化1h；加入培养液终止消化后1000rpm，离心5min；弃去上层悬液及上浮的白色脂肪，加入培养液吹打均匀，200目筛网过滤，滤液1000rpm，5min常温离心；弃去离心后的上清，培养液重悬细胞并计算细胞活力；按每孔2×10⁵个细胞接种于12孔板，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；待细胞生长至90％融合时，以0.25％质量分数的胰蛋白酶消化，以1:3比例传代，每两天换液一次；

2)包装携带SV40大T抗原基因的慢病毒：取293T细胞以1×10⁶个/mL的密度接种于10％FBS无抗性DMEM培养液的60mm培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，当细胞密度达60％时，将包装质粒pLP/PsPAX2.6μg、pLP/VSVG1.8μg和质粒pLOX-Ttag-iresTK1.6μg加入600μLOpti-MEM培养液中，后加入6μL转染试剂Turbofect，混匀放置20min；将转染复合物逐滴加入培养皿；培养16h后，换入含有10％体积分数的FBS、0.01mol/L胆固醇、0.01mol/L蛋黄卵磷脂和1×chemicallydefinedlipidconcentrate的AdvancedDMEM病毒包装液，继续培养48h后，收集细胞上清，于-80℃保存；

3)待犬脂肪间充质干细胞融合度达到50％，将收集到的慢病毒上清液与α-MEM培养液按1:1的体积比例换入犬脂肪间充质干细胞进行转染；转染8h后，换入α-MEM培养液；待细胞单层铺满整个培养皿后传代培养，在37℃、5％CO₂条件连续传代培养超过50代后，得到稳定转染Ttag基因犬脂肪间充质干细胞。