WO2013118786A1

WO2013118786A1 - 末梢組織の毛細血管構成細胞の不死化細胞株

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Publication number: WO2013118786A1
Application number: PCT/JP2013/052776
Authority: WO
Inventors: 淳一川辺; 有史竹原; 直幸長谷部
Original assignee: 国立大学法人旭川医科大学; 倉敷紡績株式会社
Priority date: 2012-02-08
Filing date: 2013-01-31
Publication date: 2013-08-15
Also published as: JPWO2013118786A1; JP6188075B2

Abstract

本発明は、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化血管内皮細胞株、不死化周細胞株、および不死化間葉系幹細胞様周細胞株、ならびにこれらの調製方法を提供する。

Description

末梢組織の毛細血管構成細胞の不死化細胞株

　本発明は、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化血管内皮細胞株、不死化周細胞株、および不死化間葉系幹細胞様周細胞株、ならびにその調製方法に関する。

　従来の血管新生研究においては、対象が微小かつ分布が不規則であるが故に新生血管や毛細血管観察に制限が多く（非特許文献１）、次の（ｉ）~（ｉｉｉ）のような問題点がある。
（ｉ）組織学的手法では、組織切片での毛細血管の同定には逐次、免疫染色が不可欠であり、全体の血管新生度の客観的評価が困難である。
（ｉｉ）二次元に近い分布あるいは透過性のある組織で観察が可能な、限られた臓器（結膜や網膜、脳硬膜）や哺乳類以外の動物（鶏卵羊膜、ゼブラフィッシュなど）を利用することが多く、医学的研究において汎用性のある理想的な実験系は少ない。
（ｉｉｉ）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイとして、三次元ゲル培養下で、ヒト由来大血管由来内皮細胞などの内皮細胞を用いた管腔形成や、大血管組織切片を用いた組織切片からの血管新生を観察する方法が頻用されているが、ほとんどが未熟な内皮細胞チューブ形成レベルまでの観察なので、本来の目的とする血管新生を評価しているといえない。

　また、血管細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ法は、条件設定の自由度が高く、経時的変化など詳細な観察を可能とするものであるが、従来の分離血管由来細胞には、次の（ｉ）~（ｉｉ）のような問題点がある。
（ｉ）これまで、大量に内皮細胞が調製できる比較的大きな大血管の組織が頻用されている。しかし、大血管由来内皮細胞は、新生血管の内皮細胞と特性が異なり、個体差や細胞分離調製などによる偏りの問題もあり、血管新生を観察する上で理想的なソースとはいえない。
（ｉｉ）大血管由来でなく毛細血管由来の内皮細胞や周細胞を分離調製することが理想である。しかし、組織内に存在する毛細血管は多種の他細胞に「紛れ込んで」分布している微小組織であり、特異的に分離する方法が無く、また少量の細胞を継代して増やす過程で、細胞老化など細胞自体の特性が変化してしまう問題もあり、毛細血管由来細胞を効率的かつ安定的に調製することが困難である。

　このような問題点をうけ、ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子発現動物を利用して毛細血管細胞も含め多くの不死細胞株が樹立されている。これまで報告されている血管内皮細胞や周細胞株は、脳あるいは網膜（いずれもラット由来）由来のものに限られ（非特許文献２~５）、脳眼以外に由来する、多くの臓器疾患に関与する末梢毛細血管由来の細胞株がない。これは、脳や網膜など、結合組織が粗な、あるいは毛細血管が密集している特殊な臓器以外の組織から毛細血管を純枠に精製することが困難であることに起因している。

　これまでに、ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子発現ラットの骨髄から骨髄内皮前駆細胞を分離し、当該細胞を継代培養して不死化血管内皮細胞株が作製されている（特許文献１）。しかし、骨髄内皮前駆細胞から分化させて得た不死化血管内皮細胞株が、どのくらい完全に分化した“内皮細胞”であるのか、本当の内皮細胞と言えるのか、議論がある。また、ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子発現ラットの大脳組織をホモジナイズして得た脳毛細血管に由来する不死化血管周皮細胞株（特許文献２）が報告されている。しかし、大脳組織をホモジナイズして遠心分離するという単純な方法によって得られた細胞は、本当に脳毛細血管に由来するものであるのか、不明である。

特開２００１−２３１５４９特開２００１−２２４３６７

Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ　９０，１９５−２２１，２００９Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．８１，１４５−１５２，２００２．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６１，１２８９−１２９６，２００２．Ｅｘｐ．Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．７２，１６３−１７２，２００１．Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ．３２６，７４９−７５８，２００６．Ｎａｔｕｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｓ　８，７２６−７３６，２００８Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，３０１−３１３，２００８

　本発明の目的は、多くの臓器疾患に関与する末梢毛細血管由来の毛細血管構成細胞の不死化細胞株を提供することにある。

　上記目的を達成するため、発明者らは毛細血管を密に含む組織を調製し、この組織からコラゲナーゼ酵素液で細胞を分離し、内皮細胞および周細胞に対してある程度の特異性があると言われるマーカー（例えば、それぞれＣＤ１４６およびＮＧ２）に対する抗体を用いて内皮細胞および周細胞を選別し、継代することにより株化した。

　すなわち、本発明は、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化周細胞株および不死化間葉系幹細胞様周細胞株の調製方法、ならびにを非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化血管内皮細胞株の調製方法に関する。

　第１の実施形態において、本発明は、下記工程を含む、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化周細胞株および不死化間葉系幹細胞様周細胞株を調製する方法を提供する：
（ａ）ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の体内で調製した、毛細血管を密に含む組織から、細胞を分離する工程、
（ｂ）ＮＧ２、ＰＤＧＦＲｂ、およびＮＧＦＲから選ばれる少なくとも１つを発現する細胞を選択し、該細胞を継代培養して不死化細胞株を得る工程、および
（ｃ）不死化細胞株の中から、間葉系細胞への分化能を有さない細胞株を不死化周細胞株として選択し、間葉系細胞への分化能を有する細胞株を不死化間葉系幹細胞様周細胞株として選択する工程。

　上記方法は、必要に応じて、さらに下記の工程を含んでいてもよい：
（ｄ）不死化細胞株の中から、周細胞のマーカーを発現する細胞株を選択する工程。

　周細胞のマーカーとしては、たとえば、ＰＤＧＦＲｂ、ａＳＭＡ、ミオカルディン、アンギオポエチン−１、カルポニン、カルデスモン、ａｎｇ−ｌｉｋｅ４、ＮＧＦを挙げることができる。

　毛細血管を密に含む組織は、たとえば、ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の障害血管の周囲に、細胞外マトリックス成分を含むキャリアを留置し、ここに毛細血管を展開させることで調製することができる。

　前記キャリアは、たとえば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸から選ばれる１または２以上の細胞外マトリックス成分、もしくはマトリゲル（登録商標）などの再構成基底膜マトリックスを含む。

　ある態様において、前記キャリアは、コラーゲンまたはコラーゲンゲルである。

　本発明は、上記した調製方法によって得られる、ＮＧ２を発現し、間葉系細胞への分化能を有さない、分離された毛細血管由来の不死化周細胞株を提供する。

　本発明はまた、上記した調製方法によって得られる、ＮＧ２を発現し、間葉系細胞への分化能を有する、分離された毛細血管由来の不死化間葉系幹細胞様周細胞株を提供する。

　本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株は、さらに、Ｓｃａ１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、およびＣＤ１０６から選ばれる少なくとも１つの間葉系幹細胞マーカーが陽性であり、かつ、ａＳＭＡ陽性、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５陰性であることにより特徴づけられる。

　本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株は、内皮細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、および脂肪細胞に分化可能である。

　第２の実施形態において、本発明は、下記工程を含む、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化血管内皮細胞株を調製する方法を提供する：
（ａ）ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の体内で調製した、毛細血管を密に含む組織から、細胞を分離する工程、および
（ｂ）ＣＤ１４６、ｒＷＦ、およびＣＤ３１から選ばれる少なくとも１つを発現する細胞を選択し、該細胞を継代培養して不死化細胞株を得る工程。

　上記方法は、必要に応じて、さらに下記の工程を含んでいてもよい：
（ｃ）不死化細胞株の中から、血管内皮細胞のマーカーを発現する細胞株を選択する工程。

　血管内皮細胞のマーカーとしては、たとえば、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）、ｖＷＦ、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、ＶＥ−カドヘリン、ＴＩＥ１、およびＴＩＥ２を挙げることができる。

　本発明は、上記した調製方法により得られる、ＣＤ１４６、ｒＷＦ、およびＣＤ３１を発現する、毛細血管由来の不死化血管内皮細胞株を提供する。

　第３の実施形態において、本発明は、毛細血管様構造を調製する方法を提供する。前記方法は、本発明の死化血管内皮細胞株と、本発明の不死化周細胞株とを３次元共培養することにより、毛細血管様構造を調製することを特徴とする。

　あるいは、本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株を、ＶＥＧＦを含む培地を用いて３次元培養することにより、毛細血管様構造を調製することもできる。この場合、ＶＥＧＦを含む培地を用いて３次元培養した後、該培地をＶＥＧＦを含有せずＴＧＦを含有する培地に交換して３次元培養してもよい。

　本発明を用いると、細胞調製は簡略化され、しかも細胞条件（遺伝子背景が単一、個体差なし）が均一化されているので、実験結果のばらつきを最小限に抑えることが期待できる。また、従来の血管研究は多くの場合、様々な動物を用いてきたので、動物愛護の観点からも、研究運営効率の側面からも、適切な継代細胞を用いるｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイ法の利用は有益である。

　毛細血管の形成異常は、腫瘍や網膜症ばかりでなく、動脈硬化や心不全、さらにはインスリン抵抗性など、本邦国民の健康を脅かす重要な難治性疾患の病態に深く関与していることが明らかになってきた。また、最近では再生医療への期待が高まっており、臓器再生の普遍的な必要不可欠な課題として組織内脈管再生構築があり、「血管新生」研究に対する期待が高い。従来の単なる「内皮細胞」を対象とした実験系に対して、毛細血管構成細胞である本細胞株および、これら細胞株を用いるアッセイ法は、毛細血管を正常に維持し、より成熟した血管を再生させるための機序解明のために非常に有用である。

　さらに、多くの組織内に存在する多分化能をもつ間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、各種疾患病態における役割や再生医療への応用などに期待されている（Ｎａｔｕｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｓ　８，７２６−７３６，２００８）。最近、幹細胞として未分化維持あるいは分化制御の機序はもとより、その組織内の局在も不明な組織ＭＳＣの（少なくとも）一部が、毛細血管周細胞として存在していることが明らかになった（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，３，３０１−３１３，２００８）。本細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）および、本細胞株を用いるアッセイ法は、上記の組織由来ＭＳＣに関わる疑問の解明につながり、血管新生ばかりでなく、高齢化社会で問題となっている難治性疾患の病態解明（脂肪や骨組織リモデリング（メタボリック症候群、骨粗鬆症）、繊維化障害など）や再生医療の開発（再生細胞ツールの調製）など、幅広い医学、医療分野に有益なツールとして応用が期待できる。

図１は、障害血管周囲に形成された毛細血管組織を示す図である。図２は、血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）の、単層増殖（Ａ）、ＲＴ−ＰＣＲの結果（Ｂ）、および３次元培養により得られた管腔（Ｃ）を示す図である。図３は、周細胞株（ｃ−ＰＣ）の、多層増殖（Ａ）、ＲＴ−ＰＣＲの結果（Ｂ）、および３次元培養により得られた毛細血管様構造（Ｃ）を示す図である。図４は、血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）と周細胞株（ｃ−ＰＣ）との共培養による毛細血管様構造の形成を示す図である。図５は、間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）が多分化能を有することを示す図である。図６は、間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）による毛細血管様構造の形成を示す図である。図７は、毛細血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）表面への細胞付着能を示す図である。図８は、間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）の生体において多分化能を有することを示す図である。（Ａ）カルディオトキシン障害骨格筋組織への導入による骨格筋細胞への分化、（Ｂ）下肢虚血部位の皮下脂肪組織への導入による毛細血管への分化（Ｂ１：周細胞への分化、Ｂ２：内皮細胞への分化）、（Ｃ）皮下脂肪組織への導入による脂肪細胞への分化。図９は、間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）の表面マーカープロファイルを示す図である。

　本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１２−２４８５４号の明細書に記載された内容を包含する。

　本発明は、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化血管内皮細胞株、不死化周細胞株、および不死化間葉系幹細胞様周細胞株に関する。具体的には、不死化血管内皮細胞株、不死化周細胞株、および不死化間葉系幹細胞様周細胞株、それら細胞株の調製方法、ならびに、それら細胞株により再構築された毛細血管様構造に関する。

１．　不死化血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）、不死化周細胞株（ｃ−ＰＣ）、および不死化間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）の調製方法
　血管内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ；ＥＣ）は、血管の内表面を構成する薄く扁平な細胞である。本発明において、「不死化血管内皮細胞株」または「ｃ−ＥＣ」とは、血管内皮細胞としての機能および特性を保持する、不死化された血管内皮細胞クローンをいう。

　周細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ：周皮細胞ともいう）は毛細血管壁を取り巻くように存在する細胞であり、Ｒｏｕｇｅｔ細胞とも呼ばれる中胚葉性の細胞である。現在、生体内に存在する周細胞は単一種類の細胞からなるものではないと推測されているが、既知のマーカーではその種類を識別することはできない。発明者らは、複数の周細胞株の中から、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）様の分化能を有する細胞株をさらに同定し、「間葉系幹細胞様周細胞株」とした。よって、本発明において、「不死化周細胞株」または「ｃ−ＰＣ」とは、周細胞としての機能および特性を保持する不死化された周細胞クローンで、間葉系細胞への分化能を有さない細胞クローンをいい、「不死化間葉系幹細胞様周細胞株」または「ＭＳＣ−ＰＣ」とは、周細胞としての機能および特性を保持する不死化された周細胞で、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞、幹細胞、または神経細胞等の、間葉系に属する細胞への分化能を有する細胞クローンをいう。

１．１　毛細血管を密に含む組織の調製
　不死化血管内皮細胞株を調製するため、まず、非ヒト哺乳動物の生体内で毛細血管を密に含む組織を調製する。

　大血管には血管を養う毛細血管（ｖａｓａ　ｖａｓｏｒｕｍ：脈管の血管）が血管壁外膜から中膜にかけて分布し、血管障害により、プラーク形成し血管壁が肥厚すると、同部位血管の周囲にｖａｓａ　ｖａｓｏｒｕｍ血管新生が亢進することが知られている（Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　２９８，Ｈ２９５−３０５，２０１０．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕ　Ｒｅｓ　７５，６４９−６５８，２００７参照）。そこで、本発明においては、ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入したトランスジェニック動物の障害血管周囲に、血管新生の場となる細胞外マトリックス成分を含むキャリアを留置・導入し、ここに毛細血管を展開させることで、毛細血管を密に含む組織を作成する。

　細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス成分、もしくはマトリゲル（登録商標）などの再構成基底膜マトリックスを用いることができる。コラーゲンは誘導体化（アシル化、エステル化）されていてもよく、ゼラチン、コラーゲンゲル、ハイドロゲル等の変性コラーゲンであってもよい。

　細胞外マトリックス成分を含むキャリアは、新生・展開された毛細血管を含んだ組織として摘出可能な形態であればよく、前記細胞外マトリックス成分から構成されるゲルやスポンジであってもよいし、前記マトリックスを適当な支持体上に被覆したものであってもよい。

　具体的には、たとえば、コラーゲン被膜した担体（例えばチューブやシート等）、またはコラーゲンゲル等を前記動物の障害血管周囲内に留置することにより、該担体表面またはコラーゲンゲル表面に毛細血管を展開させる。次に、担体表面のコラーゲン被膜またはコラーゲンゲル表面を剥離することにより、毛細血管を密に含む薄膜組織を得ることができる。

　本発明において、「毛細血管を“密に”含む」とは、脳や網膜内に存在するような、結合組織が粗で、毛細血管が密集して分布している状態をいう。

　本発明においては、非ヒト哺乳動物として、マウスやラットなどのげっ歯類動物を使用することができる。また、ｒａｓ遺伝子やｃ−ｍｙｃ遺伝子等の癌遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原遺伝子、またはヒトパピローマウイルスのＨＰＶ１６遺伝子を導入されたトランスジェニック動物が使用され得るが、本発明においては、特に、ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入されたトランスジェニック動物が好適に使用される。かかるトランスジェニック動物由来の細胞は、生体組織から分離後、低温（３２~３４℃）で培養することにより細胞内Ｔ抗原は安定発現し、その機能を発揮することにより、継代の過程で本来の細胞の特性を維持させながら不死化することができ、通常培養温度（３６~３８℃）で培養することによりＴ抗原が無効化し、Ｔ抗原の影響を極力除外した形で細胞を実験に利用することができる。

１．２　細胞の分離
　毛細血管を密に含む薄膜組織から、細胞を分離する。細胞の分離は、当業者に周知の方法に従って実施することができ、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ、エラスターゼ、キモトリプシン、およびプロナーゼ等の酵素を用いた処理により分離することができる。

１．３　マーカーによる選択と不死化
（１）不死化血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）
　分離した細胞の中から、血管内皮細胞のマーカーであるを発現している細胞を選択する。選択の指標とするマーカーは、選択の簡便さの点から細胞表面マーカーであるＣＤ１４６、ｒＷＦ、ＣＤ３１のいずれかが好ましく、なかでも発現量の点から、ＣＤ１４６かｒＷＦが好ましく、ＣＤ１４６が最も好ましい。細胞の選択は、当業者に周知の方法に従って実施することができ、例えば、上記マーカーに対する抗体を用いて細胞をラベルした後、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）や磁気細胞分離法等に従って、細胞を分離選択することができる。

　分離した細胞を、内皮細胞用培地を用いて低温で継代培養し、不死化させる。培地は、例えばＥＧＭ−２培地やＥＢＭ−２培地等、市販の内皮細胞用培地を使用することができる。継代培養は、細胞内Ｔ抗原を安定発現させ、その機能を発揮させるため、低温で行う。ここで、低温とは、３２~３４℃、好ましくは３２．５~３３．５℃、より好ましくは３３℃である。

　血管内皮細胞は細胞外マトリックスに付着して増殖する特性を有する付着細胞であり、本発明の細胞株も同様の性質を有する。それゆえ、培養においては適当な足場を用いることが好ましい。足場は細胞が付着して分裂・増殖し得るマトリックスや基質や担体であれば特に制限されず、たとえば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ポリ−Ｄ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ）等を挙げることができる。とくに、ファイブロネクチンをマトリックスとして用いることが望ましい。

（２）不死化周細胞株（ｃ−ＰＣ）および不死化間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）
　分離した細胞の中から、周細胞のマーカーを発現している細胞を選択する。選択の指標とするマーカーは、選択の簡便さと血管内皮細胞との区別の点から、細胞表面マーカーであるＮＧ２、ＰＤＧＦＲｂ、およびＮＧＦＲが好ましく、特にＮＧ２が好ましい。細胞の選択は、当業者に周知の方法に従って実施することができ、例えば、上記マーカーに対する抗体を用いて細胞をラベルした後、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）や磁気細胞分離法等に従って、細胞を分離選択することができる。

　分離したＮＧ２を発現している細胞を、基本培地を用いて低温で継代培養し、不死化させる。基本培地としては、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、α−ＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ培地及びこれらの混合物を用いることができる。

　継代培養は、細胞内Ｔ抗原を安定発現させ、その機能を発揮させるため、低温で行う。ここで、低温とは、３２~３４℃、好ましくは３２．５~３３．５℃、より好ましくは３３℃である。

　周細胞および間葉系幹細胞は細胞外マトリックスに付着して増殖する特性を有する付着細胞であり、本発明の細胞株も同様の性質を有する。それゆえ、培養においては適当な足場を用いることが好ましい。足場は細胞が付着して分裂・増殖し得るマトリックスや基質や担体であれば特に制限されず、たとえば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ポリ−Ｄ−リジン（ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ）等を挙げることができる。とくに、コラーゲンをマトリックスとして用いることが望ましい。

　次に、得られた不死化された細胞株が間葉系細胞（例えば骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞、内皮細胞、幹細胞、または神経細胞等）への分化能を有するか否かを確認し、分化能を有さない細胞株を不死化周細胞株、分化能を有するものを不死化間葉系幹細胞様周細胞株として選択する。具体的には、当業者に周知の間葉系細胞への分化培地を用いて細胞株を通常培養温度で培養し、当業者に周知の方法に従って、各間葉系細胞のマーカーの発現を調べ、または細胞の染色を行い、分化したか否かを判断する。ここで、通常培養温度とは３６~３８℃、好ましくは３７℃である。

　本発明の一態様では、得られた不死化された細胞株を、脂肪細胞分化培地を用いて３７℃で培養し、オイルレッド（Ｏｉｌ　Ｒｅｄ）染色やＦＡＢＰ４の発現を確認することにより、不死化周細胞株と不死化間葉系幹細胞様周細胞株を選択してもよい。培地は、例えばイソブチルメチルキサンチン（ｉｓｏｂｕｔｙｌｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎ，３ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、およびインスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）等を含むＤＭＥＭ培地等、市販の脂肪細胞分化培地を使用することができる。オイルレッドで染色され、またはＦＡＢＰ陽性の場合、脂肪細胞へ分化したといえるので、係る細胞株は不死化間葉系幹細胞様周細胞株であり、オイルレッドで染色されず、またはＦＡＢＰ陰性の場合、脂肪細胞へ分化しなかったといえるので、係る細胞株は不死化周細胞株である。

　また、本発明の別の態様では、得られた不死化された細胞株を、骨芽細胞分化培地を用いて３７℃で培養し、アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ　Ｒｅｄ）染色やオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）の発現を確認することにより、不死化周細胞株と不死化間葉系幹細胞様周細胞株を選択してもよい。培地は、例えばアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ）、ヒドロコルチゾン（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ）、およびβ−グリセロリン酸（ｂｅｔａ−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含むＭＥＭ培地等、市販の骨芽細胞分化培地を使用することができる。アリザリンレッドで染色され、またはオステオポンチン陽性の場合、骨芽細胞へ分化したといえるので、係る細胞株は不死化間葉系幹細胞様周細胞株であり、アリザリンレッドで染色されず、またはオステオポンチン陰性の場合、骨芽細胞へ分化しなかったといえるので、係る細胞株は不死化周細胞株である。

２．　不死化血管内皮細胞株
　上記１の調製方法に従って得られる本発明の不死化血管内皮細胞株は、ＣＤ１４６、ｒＷＦ、ＣＤ３１のような血管内皮細胞のマーカーを発現する、毛細血管由来の細胞株であり、血管内皮細胞としての機能および特性を保持する。また、本発明の不死化血管内皮細胞株は、単層化増殖し、アセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃｅｔｙｌ　ＬＤＬ）への吸着性を有し、レクチン（Ｌｅｃｔｉｎ）に結合する。マウス由来細胞の場合、本発明の不死化血管内皮細胞株は、レクチンのうち、バンデイラエアシンプリシフォリアアグルチニン（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＢＳ−１レクチン）に結合する。

　本発明の不死化血管内皮細胞株は、必要に応じて、さらに、敷石状に単層増殖するコロニーの選択や、既知の血管内皮細胞のマーカーを用いた選択を行い、樹立することができる。例えば、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）、ｖＷＦ、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、ＶＥ−カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＴＩＥ１、およびＴＩＥ２からなる群から選択される少なくとも１つの発現を、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはウエスタンブロッティング法で検出することにより、単離された不死化血管内皮細胞株を同定することができる。

　例えば、上記１の調製方法に従って得られる不死化血管内皮細胞株のなかから、さらに、敷石状に単層化増殖する細胞株で、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）陽性、ｖＷＦ陽性、アセチル化低密度リポタンパク質吸着性および／またはＢＳ−１レクチン結合能を有する細胞を選択し、本発明の不死化血管内皮細胞株としてもよい。

　本発明の不死化血管内皮細胞株を、ＶＥＧＦを含有する３次元培地を用いて通常培養温度で培養すると、内皮管腔形成（ＥＣ　ｔｕｂｉｎｇ）を生じる。

３．　不死化周細胞株（ｃ−ＰＣ）および不死化間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）
３．１　不死化周細胞株
　上記１の調製方法に従って得られる本発明の不死化周細胞株は、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲｂ、ＮＧＦＲのような周細胞マーカーを発現する、毛細血管由来の細胞株であり、周細胞としての機能および特性を保持するが、間葉系細胞への分化能は有さない。また、本発明の不死化周細胞株は、コンフルエント状態で多層化増殖する。

　本発明の不死化周細胞株は、必要に応じて、さらに、多層化増殖するコロニーの選択や、既知の周細胞のマーカーを用いた選択を行い、樹立することができる。例えば、ＰＤＧＦＲｂ、ａＳＭＡ、ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）、アンギオポエチン−１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１）、カルポニン（ｃａｌｐｏｎｉｎ）、およびカルデスモン（ｃａｌｄｅｓｍｏｎ）からなる群から選択される少なくとも１つの発現を、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはウエスタンブロッティング法で検出することにより、単離された不死化周細胞株を同定することができる。

　例えば、上記１の調製方法に従って得られる不死化周細胞株のなかから、多層化増殖する細胞株で、ＰＤＧＦＲｂ陽性、ａＳＭＡ陽性、およびミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）陽性であり、間葉系細胞への分化能を有さない細胞株を選択し、本発明の不死化周細胞株としてもよい。

　本発明の不死化周細胞株は、継代を続けても形態に変化は見られない。

　本発明の不死化周細胞株を新生血管と通常培養温度で共培養すると、新生血管の血管内皮周囲に付着して、毛細血管様構造が形成される。

３．２　不死化間葉系幹細胞様周細胞株
　上記１の調製方法に従って得られる本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株は、ＮＧ２、ＰＤＧＦＲｂ、ＮＧＦＲのような周細胞マーカーを発現する、毛細血管由来の細胞株であり、周細胞としての機能および特性を保持し、間葉系細胞への分化能を有する。また、本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株は、コンフルエント状態で多層化増殖する。

　本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株は、必要に応じて、さらに、多層化増殖する細胞株の選択、既知の周細胞のマーカーを用いた選択を行い、樹立することができる。例えば、ＰＤＧＦＲｂ、ａＳＭＡ、ミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）、アンギオポエチン−１、カルポニン、およびカルデスモンからなる群から選択される少なくとも１つの発現を、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはウエスタンブロッティング法で検出することにより、単離された不死化間葉系幹細胞様周細胞株を同定することができる。

　例えば、上記１の調製方法に従って得られる不死化間葉系幹細胞様周細胞株のなかから、多層化増殖する細胞株で、ＰＤＧＦＲｂ陽性、ａＳＭＡ陽性、およびミオカルディン（Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ）陽性であり、間葉系細胞への分化能を有する細胞株を選択し、本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株としてもよい。

　本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株は、（１）間葉系幹細胞マーカーであるＳｃａ１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６を発現し、（２）周細胞マーカーであるＮＧ２、ａＳＭＡ陽性、（３）血球系マーカーＣＤ１１、ＣＤ４５陰性という表面マーカープロファイルを有する。したがって、フローサイトメトリー等を用いて、同細胞を同定することができる。

　本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株は、継代を続けると細胞形態が多種になる傾向が観察されるが、４０継代以上の継代培養後でも間葉系幹細胞様の多分化能を有している。

４．毛細血管様構造の再構築
　本発明において、「毛細血管様構造」とは、毛細血管のように、内皮細胞からなるチューブ（ＥＣチューブ）の周囲を周細胞が取り巻いている構造をいい、その直径は約５~２０μｍである。

４．１　不死化血管内皮細胞株と不死化周細胞株を用いる場合の調製方法
　本発明の不死化血管内皮細胞株と不死化周細胞株とを３次元共培養することにより、毛細血管様構造が形成され、毛細血管を再構築することができる。具体的には、ＶＥＧＦ含有３次元ゲル培地を用いて通常培養温度で不死化血管内皮細胞株と不死化周細胞株とを共培養することにより、毛細血管様構造を得ることができる。培地としては、ＶＥＧＦを添加した基本培地を使用することができ、３次元ゲル培地を調製するためには、例えばマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）（ＢＤ社）等、市販のキットを使用することができる。

４．２　不死化間葉系幹細胞様周細胞株を用いる場合の調製方法
　本発明の不死化間葉系幹細胞様周細胞株を３次元培養することにより、毛細血管様構造が形成され、毛細血管を再構築することができる。具体的には、ＶＥＧＦ含有３次元ゲル培地を用いて通常培養温度で不死化間葉系幹細胞様周細胞株を培養することにより、毛細血管様構造を得ることができる。その後、培地をＴＧＦ−β含有３次元ゲル培地に交換して通常培養温度で培養を続けると、さらに太い成熟した毛細血管様構造を得ることができる。培地としては、ＶＥＧＦを添加した基本培地およびＴＧＦ−βを添加した基本培地を使用することができ、３次元ゲル培地を調製するためには、例えばマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）（ＢＤ社）等、市販のキットを使用することができる。

１．新生毛細血管組織の調製
　ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子発現マウス（８週歳）の大腿動脈内に、ｗｉｒｅ（外径０．３ｍｍ　Ｃｏｏｋ社）を挿入し血流を再開させることにより障害血管リモデリングモデルを作成する（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｖａｓｃ　Ｂｉｏｌ　２０１０，３０，４６４−４７０）。障害血管に伴走するようにコラーゲン被膜ポリプロピレン製チューブ（ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ　ｔｕｂｅ；ＣＣＴ）（外径０．７ｍｍ）を留置したのち皮膚を再縫合した。手術２週間後、障害血管外膜および留置したＣＣＴ上に新生血管が分布していた（図１Ａ）。このＣＣＴを単離して、ＣＣＴ表面の被膜を剥離した。この被膜（厚さ２００~５００ｕｍ）には、様々な成熟レベルの新生血管が二次元に密に展開しているのが観察される（図１Ｂ，Ｃ）。

　図１Ａは、マウス大腿動脈をワイヤー障害し、その近傍にＣＣＴを設置して２週間後、ＣＣＴ表面に新生血管が形成されている様子を示す。図１Ｂは、ＣＣＴ表面に形成された被膜を剥離して得られた、毛細血管が２次元に展開する被膜組織を示す。図１Ｃは、得られた被膜組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色した染色像を示し、係る染色像から、様々な成熟レベルの新生血管が存在することがわかる（バー＝１００μｍ）。

２．毛細血管細胞株の樹立
　上記１において単離した被膜から細胞分離用酵素液により細胞成分を分離し、抗ＣＤ１４６抗体（ウサギモノクローナル（ｒａｂｂｉｔ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体，Ａｂｃａｍ）および抗ＮＧ２抗体（ウサギポリクローナル（ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）抗体，Ａｂｃａｍ）でラベルしたのち、Ｍａｇｎｅｔ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社）によりＣＤ１４６陽性細胞およびＮＧ２陽性細胞を分離した。それぞれの細胞を、ＣＤ１４６陽性細胞は内皮細胞用培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ　ＭＶ２，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を用いて、ＮＧ２陽性細胞は基本培地（Ｄ−ＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）を用いて１０継代した後、不死化細胞を再度ＣＤ１４６抗体、ＮＧ２抗体／ＭＣＳＳで分離した後、不死化ＣＤ１４６陽性細胞株およびＮＧ２陽性細胞株を樹立した。ＣＤ１４６陽性細胞のなかから、希釈培養系で単一細胞コロニーを形成させ、単層化増殖する細胞コロニーでＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）、ｖＷＦ陽性かつアセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ　ＬＤＬ−ＤｉＩ，Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）吸着性／Ｌｅｃｔｉｎ（Ｂａｎｄｅｉｒｅａ　ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＢＳ−１　ｌｅｃｔｉｎ）−ＦＩＴＣ，Ｓｉｇｍａ）結合能をもつ細胞株を内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）として樹立した（図２ＡおよびＢ）。同細胞は、３次元ゲル培地下で培養すると、管腔形成能（ＥＣｔｕｂｉｎｇ）を有する（図２Ｃ）。

　図２Ａは、血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）が、多角形細胞でコンフルエントで単層増殖する様子を示す。図２Ａより、ｃ−ＥＣが内皮細胞に特徴的なアセチル化低密度リポタンパク質−Ｄｉｌ（赤）吸着性とレクチン−ＦＩＴＣ（緑）結合性を有することがわかる（バー＝１００μｍ）。図２Ｂは、内皮細胞のマーカーであるＣＤ１４６、フォン・ヴィルブランド因子（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ，ｖＷＦ）、Ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ２）、およびａＳＭＡ（α平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ））の遺伝子発現を確認したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ｃ−ＥＣはＣＤ１４６、ｖＷＦ、およびＦｌｋ１を発現し、ａＳＭＡは発現していない。図２Ｃは、ｃ−ＥＣを、ＶＥＧＦ含有３次元マトリゲル、３７℃で培養したときの顕微鏡観察像を示す（バー＝１００μｍ）。図２Ｃより、ｃ−ＥＣをＶＥＧＦ含有３次元培地下で培養するとチューブ様構造を形成したこと、すなわちｃ−ＥＣがチュービング形成能を有することがわかる。

　ＮＧ２陽性細胞のなかから、希釈培養系で単一細胞由来の細胞コロニーを形成させた。コンフルエント状態で多層化する細胞コロニー（図３Ａ）でＰＤＧＦＲｂ、ａＳＭＡ、Ｍｙｏｃａｒｄｉｎ陽性を周細胞株（ｃ−ＰＣ）として分離した（図３Ｂ）。ＧＦＰ発現ｃ−ＰＣ細胞を含む３次元ゲル培地下で、ラット大動脈短軸組織切片を共培養すると、大動脈外膜から発生してきた新生血管内皮の周りにｃ−ＰＣ細胞が取り巻き、毛細血管様構造を形成した（図３Ｃ）。

　図３Ａは、周細胞株（ｃ−ＰＣ）が、紡錘状細胞で、平滑筋細胞様の“Ｈｉｌｌ　＆　Ｖａｌｌｅｙ”状（起伏）の多層増殖する様子を示す（バー＝１００μｍ）。図３Ｂは、周細胞のマーカーであるＮＧ２、周細胞と平滑筋細胞とに共通するマーカーであるＰＤＧＦＲｂ、ａＳＭＡ、ミオカルディンおよびＳＭ２２、ならびに内皮細胞のマーカーであるｖＷＦおよびＦｌｋ１の遺伝子発現を確認したＲＴ−ＰＣＲの結果を示す。ｃ−ＰＣはＮＧ２、ＰＤＧＦＲｂ、ａＳＭＡ、ミオカルディン、およびＳＭ２２を発現し、ｖＷＦおよびＦｌｋ１は発現していない。図３Ｃは、３次元培地下で、ｃ−ＰＣを新生血管（内皮をＣＤ３１（赤）で染色）と共培養すると、血管内皮の周囲に周細胞（ＧＦＰ（緑））が付着して、毛細血管様構造を形成した様子を示す（バー＝５０μｍ）。

３．毛細血管由来細胞（ｃ−ＥＣおよびｃ−ＰＣ）による毛細血管の再構築
　上記２で樹立した細胞をマトリゲル３次元ＶＥＧＦ含培養系でインキュベートすると、ｃ−ＥＣはチュービング形成するが（図４左）、一方で、ｃ−ＰＣは、細胞塊コロニーを形成するのみである（図４右）。ｃ−ＥＣおよびｃ−ＰＣ細胞に対して、組み換えレトロウイルスによりＤＳ−Ｒｅｄ（赤蛍光）およびＧＦＰ（緑蛍光）発現細胞を作成し、共培養すると、ｃ−ＥＣ（Ｄｓ−Ｒｅｄ）で形成されたチュービングの周囲にｃ−ＰＣ（ＧＦＰ）が取り囲んで毛細血管様構造を形成した（図４中央）。

　図４は、３次元ゲル培養下で、血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）を単独培養した場合（左）、周細胞株（ｃ−ＰＣ）を単独培養した場合（右）、および血管内皮細胞株（ｃ−ＥＣ）と周細胞株（ｃ−ＰＣ）とを共培養した場合（中央）の、顕微鏡観察像および蛍光顕微鏡観察像を示す。血管内皮細胞株（Ｄｓ−Ｒｅｄ（赤）発現）は、内皮管腔形成（ＥＣチュービング）するが、周細胞（ＧＦＰ（緑）発現）は細胞塊様に増殖した。両細胞を共培養すると、ｃ−ＥＣによって形成されたＥＣチューブの周りにｃ−ＰＣが接着増殖し、毛細血管（ｃａｐｉｌｌａｒｙ）様構造が形成された（バー＝１００μｍ）。

４．毛細血管由来間葉系幹細胞様周細胞（ＭＳＣ−ＰＣ）の多分化能
　５株のｃ−ＰＣ細胞株のなかで３株は、特に細胞形態が多種になる傾向が強いことに気づき、再度、単一細胞からクローニングさせたところ、同様の特性を維持していた。同細胞は、脂肪細胞分化培地および骨芽細胞分化培地で培養すると、効率的に脂肪および骨芽細胞に分化する能力があることを確認した（図５）。特に脂肪細胞の場合、分化誘導後、７日以内に７０~８０％の細胞が分化誘導され、２~３週間の培養のなかで、脂肪滴を細胞質に大量に蓄える成熟脂肪細胞まで分化することを確認している（図５）。

　図５は、間葉系幹細胞様周細胞（ＭＳＣ−ＰＣ）の顕微鏡観察像、ならびに該細胞を脂肪細胞分化培地で培養した後のＦＡＢＰ４による免疫染色像とオイルレッド染色像、および該細胞を骨芽細胞分化培地で培養した後のオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）による免疫染色像とアリザリンレッド染色像を示す（バー＝５０μｍ）。ＮＧ２陽性ＰＣ細胞株の中で、脂肪細胞分化能（ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）および骨芽細胞分化能（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）を有する細胞株を樹立した。同細胞株を脂肪分化培地で１週間培養すると７０~８０％の細胞がＦＡＢＰ４陽性細胞へ、さらに２~３週間培養すると大量の脂肪滴（オイルレッド染色）を細胞質にもつ成熟脂肪細胞へ分化した。同様に、樹立した細胞株を骨芽細胞分化培地で３週間培養するとオステオポンチン陽性骨芽細胞への分化を認め、細胞塊の一部はカルシウム沈着（アリザリンレッド染色）を認めた（バー＝５０μｍ）。

　同細胞株はＶＥＧＦ含む内皮細胞用培地で培養するとｖＷＦ陽性内皮細胞化し、さらにＶＥＧＦ含有三次元ゲル培養系で培養すると、単なるＥＣチュービング形成のみならず、その周囲にＰＣ細胞が取り巻く毛細血管様構造を形成した（図６Ａ）。

　電子顕微鏡で観察すると、一部周囲にＰＣ細胞で囲まれるＥＣチュービング以上の大きな管腔が形成されていた（図６Ｂ）。この時点でＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　β）で刺激すると、さらに太い血管構造を形成した（図６Ｃ）。

　図６Ａは、間葉系幹細胞様周細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）をＶＥＧＦ含有３次元ゲル内で培養すると、内皮細胞分化が誘導されたこと（Ａ内挿入図）、およびＥＣチューブ周辺に他の周細胞が集積して毛細血管様構造を形成したことを示す。図６Ｂは、毛細血管様構造を電子顕微鏡を用いて観察した像であり、ＥＣチューブより大きな管腔構造をとり、一部で周細胞がそのチューブ外側に付着しているのが観察される。図６Ｃは、さらに培地をＶＥＧＦ（−）ＴＧＦ（＋）培地に交換して２日後の毛細血管様構造であり、Ａに比べ、さらに太い成熟した毛細血管様構造が形成されていることがわかる（バー＝１００μｍ）。

５．ｃ−ＥＣ細胞への細胞接着能評価
　ｃＥＣをコンフルエント状態に培養した後、この培地皿に骨髄由来の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）（ＧＦＰ発現マウス由来）を加えて、６時間後に内皮細胞表面に接着しているＧＦＰ陽性ＥＰＣ細胞数を計測した。内皮との接着に必要な接着分子（インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ））発現が低下しているＥＰＣでは内皮接着性が有意に低下していることが認められた（図７）。

　図７は、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）の血管内皮への接着能をみるため、ｃ−ＥＣをコンフルエント単層状態に培養し、マウス骨髄より単離したＥＰＣ（ＧＦＰ緑発光）を含む培養液で６時間インキュベートした後、内皮表面に付着しているＥＰＣ数を評価した結果を示す。接着分子（インテグリンβ１等）の発現が低下しているＥＰＣ（被検体）において、内皮細胞表面への付着能が有意に低下している（バー＝５０μｍ、Ｍｅａｎ＋ＳＥＭ、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。

６．ＭＳＣ−ＰＣの生体における多分化能評価
　マウス組織へのＤｓＲｅｄ蛍光標識ＭＳＣ−ＰＣの導入により、様々な組織への分化を確認した。
（１）骨格筋細胞への分化
　ＳＣＩＤマウス腓腹筋にｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ（１０ｕｇ／ｍｏｕｓｅ筋肉注射）処置して、骨格筋を障害させた後、同部位へＭＳＣ−ＰＣを導入した。２週間後に骨格筋組織を取出し免疫染色解析を行った。結果を図８Ａに示す（バー＝５０μｍ）。障害から再生している骨格筋繊維の一部がＭＳＣ−ＰＣ由来のものであることが確認された（緑＝ｌｅｃｔｉｎ染色＝血流のある血管内皮）。

（２）毛細血管（内皮細胞および周細胞）への分化
　ＳＣＩＤマウス大腿動脈結紮させた下肢虚血領域において、皮下組織部へＭＳＣ−ＰＣを導入した。２週間後に同部位組織を取出し免疫染色解析を行った。結果を図８Ｂに示す（バー＝５０μｍ）。導入細胞（赤色シグナル）は、新生血管の内皮細胞（ｌｅｃｔｉｎ染色＝血流のある血管内皮と重合してオレンジ色になっている）および、周細胞（緑内皮細胞の外側に付着）に分化していることが確認された。

（３）脂肪細胞への分化
　ＳＣＩＤマウス皮下脂肪組織へのＭＳＣ−ＰＣ導入後、２週間目に組織を取出し免疫染色解析を行った。結果を図８Ｃに示す（バー＝５０μｍ）。脂肪組織において導入した細胞（赤色シグナル）が脂肪細胞へ分化していることが確認された（緑＝Ｂｏｄｉｐｙ染色＝脂肪染色）。

７．ＭＳＣ−ＰＣの細胞マーカープロファイル
　ＭＳＣ−ＰＣにおいて、フローサイトメトリー解析により代表的な周細胞および間葉系幹細胞マーカーの発現性を確認した。結果を図９に示す。

　周細胞マーカー（ＮＧ２、ａＳＭＡ）は陽性であり、Ｓｃａ１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６などの代表的な間葉系幹細胞マーカーはすべて陽性である。また、血球系マーカーであるＣＤ１１やＣＤ４５は陰性であった。

　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

　従来の単なる「内皮細胞」を対象とした実験系に対して、毛細血管構成細胞である本細胞株および、これら細胞株を用いる実験系は、毛細血管を正常に維持するための、また、より成熟した血管を再生させるための機序解明のために非常に有用である。毛細血管の形成異常は腫瘍、網膜症、動脈硬化、心不全、インスリン抵抗性等の重要な難治性疾患の病態に関与していることが明らかとなってきたため、本発明の細胞株およびこれら細胞株を用いる実験系により、これらの疾患の予防薬や治療薬を開発できる可能性がある。また、本発明の細胞株およびこれら細胞株を用いる実験系により、臓器再生に必要な組織内脈管再生構築法を開発できる可能性がある。

　本細胞株（ＭＳＣ−ＰＣ）および、本細胞を用いる実験系により、組織由来ＭＳＣに関わる疑問の解明につながり、上記の血管新生ばかりでなく、高齢化社会で問題となっている難治性疾患病態解明（脂肪や骨組織リモデリング（メタボリック症候群、骨粗鬆症）、繊維化障害など）や再生医療の開発（再生細胞ツールの調製）など、幅広い医学、医療分野に有益なツールとして応用が期待できる。

Claims

　下記工程を含む、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化周細胞株および不死化間葉系幹細胞様周細胞株を調製する方法：
（ａ）ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の体内で調製した、毛細血管を密に含む組織から、細胞を分離する工程、
（ｂ）ＮＧ２、ＰＤＧＦＲｂ、およびＮＧＦＲから選ばれる少なくとも１つを発現する細胞を選択し、該細胞を継代培養して不死化細胞株を得る工程、および
（ｃ）不死化細胞株の中から、間葉系細胞への分化能を有さない細胞株を不死化周細胞株として選択し、間葉系細胞への分化能を有する細胞株を不死化間葉系幹細胞様周細胞株として選択する工程。
さらに、
（ｄ）不死化細胞株の中から、周細胞のマーカーを発現する細胞株を選択する工程
を含む、請求項１に記載の調製方法。
　周細胞のマーカーがＰＤＧＦＲｂ、ａＳＭＡ、ミオカルディン、アンギオポエチン−１、カルポニン、カルデスモン、ａｎｇ−ｌｉｋｅ４、およびＮＧＦからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の調製方法。
　ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の障害血管の周囲に、細胞外マトリックス成分を含むキャリアを留置し、毛細血管を密に含む組織を調製することを特徴とする、請求項１~３のいずれか１項に記載の調製方法。
　前記キャリアが、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸から選ばれる１または２以上の細胞外マトリックス成分、もしくはマトリゲル（登録商標）などの再構成基底膜マトリックスを含む、請求項４に記載の調製方法。
　前記キャリアが、コラーゲンまたはコラーゲンゲルを含む、請求項４に記載の調製方法。
　請求項１~６のいずれか１項に記載の調製方法により得られる、ＮＧ２を発現し、間葉系細胞への分化能を有さない、分離された毛細血管由来の不死化周細胞株。
　請求項１~６のいずれか１項に記載の調製方法により得られる、ＮＧ２を発現し、間葉系細胞への分化能を有する、分離された毛細血管由来の不死化間葉系幹細胞様周細胞株。
　さらに、Ｓｃａ１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、およびＣＤ１０６から選ばれる少なくとも１つの間葉系幹細胞マーカーが陽性であり、かつ、ａＳＭＡ陽性、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ４５陰性である、請求項８に記載の不死化間葉系幹細胞様周細胞株。
　内皮細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、および脂肪細胞に分化可能である、請求項７または８に記載の不死化間葉系幹細胞様周細胞株。
　下記工程を含む、非ヒト哺乳動物の毛細血管に由来する不死化血管内皮細胞株を調製する方法：
（ａ）ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の体内で調製した、毛細血管を密に含む組織から、細胞を分離する工程、および
（ｂ）ＣＤ１４６、ｒＷＦ、およびＣＤ３１から選ばれる少なくとも１つを発現する細胞を選択し、該細胞を継代培養して不死化細胞株を得る工程。
　さらに、
（ｃ）不死化細胞株の中から、血管内皮細胞のマーカーを発現する細胞株を選択する工程を含む、請求項１１に記載の調製方法。
　血管内皮細胞のマーカーがＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）、ｖＷＦ、ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、ＶＥ−カドヘリン、ＴＩＥ１、およびＴＩＥ２からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の調製方法。
　ＳＶ４０温度感受性変異株ｔｓＡ５８Ｔ抗原遺伝子を導入した非ヒト哺乳動物の障害血管の周囲に、細胞外マトリックス成分を含むキャリアを留置し、毛細血管を密に含む組織を調製することを特徴とする、請求項１１~１３のいずれか１項に記載の調製方法。
　前記キャリアが、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸から選ばれる１または２以上の細胞外マトリックス成分、もしくはマトリゲル（登録商標）などの再構成基底膜マトリックスを含む、請求項１４に記載の調製方法。
　前記キャリアが、コラーゲンまたはコラーゲンゲルを含む、請求項１５に記載の調製方法。
　請求項１１~１６のいずれか１項に記載の調製方法により得られる、ＣＤ１４６、ｒＷＦ、およびＣＤ３１を発現する、毛細血管由来の不死化血管内皮細胞株。
　請求項１７に記載の不死化血管内皮細胞株と、請求項７に記載の不死化周細胞株とを３次元共培養することにより、毛細血管様構造を調製する方法。
　請求項８~１０のいずれか１項に記載の不死化間葉系幹細胞様周細胞株を、ＶＥＧＦを含む培地を用いて３次元培養することにより、毛細血管様構造を調製する方法。
　ＶＥＧＦを含む培地を用いて３次元培養した後、該培地をＶＥＧＦを含有せずＴＧＦを含有する培地に交換して３次元培養する工程をさらに含む、請求項１９に記載の方法。