WO2021206055A1

WO2021206055A1 - 血管新生促進及び／又は神経再生用ユニット

Info

Publication number: WO2021206055A1
Application number: PCT/JP2021/014496
Authority: WO
Inventors: 晃明桝谷; 健一水谷
Original assignee: 一丸ファルコス株式会社; 学校法人神戸学院
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2021-04-05
Publication date: 2021-10-14
Also published as: EP4134132A4; EP4134132A1; JPWO2021206055A1; US20230138007A1

Abstract

【課題】安全な血管新生促進及び／又は神経再生のための手段（例えば、体内に移植した細胞や組織に血管新生を誘導する技術）、当該移植後の神経幹細胞（神経系の未分化な組織幹細胞）が生着して増殖するための足場などの剤の開発などが求められ、当該手段を提供する。【解決手段】ゲル成分と、プロテオグリカンと、を含む、血管新生促進及び／又は神経再生のために用いられるユニット、などを提供する。

Description

血管新生促進及び／又は神経再生用ユニット

クロスリファレンス

　本出願は、日本国において、２０２０年４月８日に出願された特願２０２０－０６９６８６号、２０２０年５月１５日に出願された特願２０２０－０８５７３６号、２０２０年８月２８日に出願された特願２０２０－１４４２７８号および２０２１年１月２９日に出願された特願２０２１－０１３１７２号、に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。

　本発明は、ヒト等の血管新生促進及び／又は神経再生のためのユニットなどに関する。

　血管新生は、動物において、既存の毛細血管等から血管内皮細胞が遊走、増殖し、管腔形成によって新しい血管網が形成される現象である。創傷の治癒過程（炎症期、増殖期、成熟期）においては、損傷部の治癒に必要な酸素やエネルギーを運ぶために、損傷部に向かって新しい血管が新生される。そのため、血管新生を促進することで、創傷治療を促進することができるものと考えられる。

　血管新生を誘導するものとしては、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等が知られている。しかし、ＶＥＧＦは、例えば腫瘍細胞により産生され病的な血管新生を誘導することが知られている（特許文献１）。また、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から内皮細胞を作製する技術もあるが（特許文献２）、ｉＰＳ細胞に関しては未分化の細胞が残った状態で移植を行うと癌化する可能性と考えられており、技術を用いることに安全性に課題があると考えられる。

　また、パーキンソン病や脊椎損傷などの神経疾患の治療に、ドナー不足さらには倫理的問題などから、神経幹細胞を移植することも検討されている（非特許文献１、特許文献３）。

　ｉＰＳ細胞の発見により、例えば、患者本人からｉＰＳ細胞を作って、そのｉＰＳ細胞から神経幹細胞を誘導することが可能になり、自分の細胞を治療に使用できる自家移植を行うことも期待されている。しかし、患者本人の細胞からｉＰＳ細胞を経て神経幹細胞を作成するのに、半年以上と長い期間を要すると考えられている。それに加えて、ｉＰＳ細胞は細胞の株ごとに安全性や分化の方向性が大きく異なると考えらえており、安全なｉＰＳ細胞であることを検証するにはさらに長い期間を要するのが現状である。更に、脊髄損傷においては、患者の症状が固定する前に神経幹細胞を移植しないと効果がないと考えられている。そのため、例えば、このように細胞移植が有効な期間が限られる疾患では、ｉＰＳ細胞の移植技術を用いても患者本人の細胞を治療に使うことは難しいと考えられている（非特許文献１）。また、当該神経幹細胞の移植の場合でも、当該移植後の細胞の生着率は低いと考えられている（非特許文献２）。

Ｔａｋｅｓｈｉ　Ｍａｔｓｕｉら：ＳＴＥＭ　ＣＥＬＬＳ　２０１２，３０：１１０９－１１１９頁Ｋｏｉｃｈｉ　Ｉｗａｔｓｕｋｉ：Ｓｐｉｎａｌ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　２０１５，２９：２６－３１頁

特開２０１６－２１６３７５ＷＯ２０１４／１９２９２５特開２００５－２７８６４１

　現在も、安全な血管新生促進及び／又は神経再生のための手段（例えば、体内に移植した細胞や組織に血管新生を誘導する技術）、当該移植後の神経幹細胞（神経系の未分化な組織幹細胞）が生着して増殖するための足場などの剤の開発、などが求められている。

　そこで、本発明は、安全な血管新生を促進する手段を提供することなどを目的とする。

　本発明はかかる課題を解決するためになされたものであり、すなわち、本発明の１つは「ゲル成分と、プロテオグリカンと、を含む、血管新生促進及び／又は神経再生のために用いられるユニット」であり、本発明は例えば以下（１）から（１１）の発明である。

（１）ゲル成分と、プロテオグリカンと、を含む、血管新生促進及び／又は神経再生のために用いられるユニット。
（２）ＶＥＧＦを含む、（１）に記載のユニット。
（３）ＦＧＦ－２を含む、（１）又は（２）に記載のユニット
（４）ＥＧＦを含む、（１）から（３）のいずれかに記載のユニット。
（５）血管新生促進を起こすための細胞を更に含む、（１）から（４）のいずれかに記載のユニット。
（６）ゲル成分の上に、ＶＥＧＦを含有する液体培地と血管新生促進を起こすための細胞とが積層される、（２）から（５）のいずれかに記載のユニット。
（７）プロテオグリカンの含有量が、０．１μｇ／ｍｌ以上である、（１）から（６）のいずれかに記載のユニット。
（８）プロテオグリカンがＶＥＧＦを含有する液体培地に含まれる、（２）から（７）のいずれかに記載のユニット。
（９）プロテオグリカンがゲル成分に含まれる、（１）から（８）のいずれかに記載のユニット。
（１０）プロテオグリカンがコンドロイチン硫酸型プロテオグリカンである、（１）～（９）のいずれかに記載のユニット。
（１１）プロテオグリカンがサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンである、（１０）に記載のユニット。

　このユニットを用いることにより、例えばヒト等の体内にこのユニットを移植して、当該体内において安全に血管新生を促進することなどができる。

血管新生能の評価を行った結果（位相差顕微鏡により観察を行って撮影した写真、倍率は４倍）である。図中において、（１）はＰＧ０群の培養開始２時間後の写真、（２）はＰＧ１０００群の培養開始２時間後の写真、（３）はＧＡＧ１０００群の培養開始２時間後の写真、（４）はＰＧ０群の培養開始４時間後の写真、（５）はＰＧ１０００群の培養開始４時間後の写真、（６）はＧＡＧ１０００群の培養開始４時間後の写真、（７）はＰＧ０群の培養開始６時間後の写真、（８）はＰＧ１０００群の培養開始６時間後の写真、（９）はＧＡＧ１０００群の培養開始６時間後の写真、である。図１で示した各群の培養開始６時間後のサンプルにおいて、血管の長さ（図（ａ））、網目構造の数（図（ｂ））、分岐点の数（図（ｃ））を測定した結果である。当該測定した結果は、ランダムに選んだ４つの視野について各々の項目（血管の長さ、網目構造の数、分岐点の数）を定量し、定量した値の平均値を算出した結果である。当該測定では、Ｄｕｎｎｅｔ法による統計解析を行い、＊は有意差を示し、ｐ＜０．０５である。当該測定は、当該培養を３回行い、その３回の平均値を算出することにより行った。各群の血管の長さ（ｐｉｘｅｌ）は、ＰＧ０群では３１８７、ＰＧ１０００群では３１９２、ＧＡＧ１０００群では２９９６（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、であった。各群の網目構造の数は、ＰＧ０群では９．９個、ＰＧ１０００群では１０．９個（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＧＡＧ１０００群では８．２個（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、であった。各群の分岐点の数は、ＰＧ０群では１６．７個、ＰＧ１０００群では２０．４個（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＧＡＧ１０００群では１４．６個（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、であった。血管新生能の評価を行った結果（位相差顕微鏡により観察を行って撮影した写真、倍率は４倍）である。図中において、（１）はＰＧ０群の培養開始２時間後の写真、（２）はＰＧ１群の培養開始２時間後の写真、（３）はＰＧ１０群の培養開始２時間後の写真、（４）はＰＧ１００群の培養開始２時間後の写真、（５）はＰＧ１０００群の培養開始２時間後の写真、（６）はＰＧ０群の培養開始４時間後の写真、（７）はＰＧ１群の培養開始４時間後の写真、（８）はＰＧ１０群の培養開始４時間後の写真、（９）はＰＧ１００群の培養開始４時間後の写真、（１０）はＰＧ１０００群の培養開始４時間後の写真、（１１）はＰＧ０群の培養開始６時間後の写真、（１２）はＰＧ１群の培養開始６時間後の写真、（１３）はＰＧ１０群の培養開始６時間後の写真、（１４）はＰＧ１００群の培養開始６時間後の写真、（１５）はＰＧ１０００群の培養開始６時間後の写真、である。図３で示した各群の培養開始６時間後のサンプルにおいて、血管の長さ（図（ａ））、網目構造の数（図（ｂ））、分岐点の数（図（ｃ））を測定した結果である。当該測定は、当該培養を３回行い、その３回の平均値を算出することにより行った。当該測定した結果は、ランダムに選んだ４つの視野について各々の項目（血管の長さ、網目構造の数、分岐点の数）を定量し、定量した値の平均値を算出した結果である。当該測定では、ＰＧ０を１００とした場合の相対値を示している。当該測定では、Ｄｕｎｎｅｔ法による統計解析を行い、＊は有意差を示し、ｐ＜０．０５（図中では＊と記載）、ｐ＜０．０１（図中では＊＊と記載）、ｐ＜０．００１（図中では＊＊＊と記載）、ｐ＜０．０００１（図中では＊＊＊＊と記載）、である。各群の血管の長さは、ＰＧ０群を１００とした場合、ＰＧ１群は１０８．２０、ＰＧ１０は１２０．８７（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１００は１２９．４４（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１０００は１２３．１７、であった。各群の網目構造の数は、ＰＧ０群を１００とした場合、ＰＧ１群は１２５．２３（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１０は１４８．１７（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１００は１７０．８５（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１０００は１５９．６６、であった。各群の分岐点の数は、ＰＧ０群を１００とした場合、ＰＧ１群は１２７．６８（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１０は１４９．５９（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１００は１６６．２４（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、ＰＧ１０００は１６１．３７（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、であった。血管新生能の評価を行った結果（位相差顕微鏡により観察を行って撮影した写真、倍率は４倍）である。図中において、（１）はＰＧ０群の培養開始２時間後の写真、（２）はＰＧ１００群の培養開始２時間後の写真、（３）はＰＧ０群の培養開始４時間後の写真、（４）はＰＧ１００群の培養開始４時間後の写真、（５）はＰＧ０群の培養開始６時間後の写真、（６）はＰＧ１００群の培養開始６時間後の写真、である。図５で示した各群の培養開始６時間後のサンプルにおいて、血管の長さ（図（ａ））、網目構造の数（図（ｂ））、分岐点の数（図（ｃ））を測定した結果である。当該測定した結果は、ランダムに選んだ４つの視野について各々の項目（血管の長さ、網目構造の数、分岐点の数）を定量し、定量した値の平均値を算出した結果である。当該測定では、Ｄｕｎｎｅｔ法による統計解析を行い、＊は有意差を示し、ｐ＜０．０５（図中では＊と記載）、ｐ＜０．０１（図中では＊＊と記載）、である。当該測定は、当該培養を２回行い、その２回の平均値を算出することにより行った。各群の血管の長さ（ｐｉｘｅｌ）は、ＰＧ０群では２７０２、ＰＧ１０００群では３３６８（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、であった。各群の網目構造の数は、ＰＧ０群では６．４９個、ＰＧ１００群では９．７５個（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、であった。各群の分岐点の数は、ＰＧ０群では１２．５個、ＰＧ１００群では１７．８個（ＰＧ０群と比べ有意差あり）、であった。実験３の結果（蛍光顕微鏡観察によるプロテオグリカンの局在の確認）である。（１）は培地中標識ＰＧ（マトリゲル無）群のＤＡＰＩでの染色結果、（２）は培地中標識ＰＧ（マトリゲル無）群の標識ＰＧ１での染色結果、（３）は培地中標識ＰＧ（マトリゲル無）群のＭｅｒｇｅでの染色結果、（４）は培地中標識ＰＧ群のＤＡＰＩでの染色結果、（５）は培地中標識ＰＧ群の標識ＰＧ１での染色結果、（６）は培地中標識ＰＧ群のＭｅｒｇｅでの染色結果、（７）はゲル中標識ＰＧ群のＤＡＰＩでの染色結果、（８）はゲル中標識ＰＧ群の標識ＰＧ１での染色結果、（９）はゲル中標識ＰＧ群のＭｅｒｇｅでの染色結果、である。「ＤＡＰＩ」はＤＡＰＩ染色によりＨＵＶＥＣの核を標識したことを示し、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ」は標識ＰＧ１にてプロテオグリカンを標識したことを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は当該核の標識と当該プロテオグリカンの標識とを合わせて示す。実験３の結果（コンフォーカル顕微鏡によるプロテオグリカンの局在の確認）であり、図７において示す（４）と（６）と（７）と（９）を抜き出した図である。実験４の結果（コンフォーカル顕微鏡によるプロテオグリカンの局在の確認である。「Ｈｏｅｃｈｓｔ」はヘキスト染色によりＨＵＶＥＣの核を標識したことを示し、「Ｃｅｌｌ　ｍａｓｋ」はＣｅｌｌＭａｓｋ^ＴＭ染色によりＨＵＶＥＣの細胞膜を標識したことを示し、「ＰＧ－Ａｔｔｏ５９０」は標識ＰＧ２にてプロテオグリカンを標識したことを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は当該核の標識と当該細胞膜の標識と当該プロテオグリカンの標識とを合わせて示す。（１）は「Ｈｏｅｃｈｓｔ」の倍率２０倍での当該顕微鏡での観察結果、（２）は「Ｃｅｌｌ　ｍａｓｋ」の倍率２０倍での当該顕微鏡での観察結果、（３）は「ＰＧ－Ａｔｔｏ５９０」の倍率２０倍での当該顕微鏡での観察結果、（４）は「Ｍｅｒｇｅ」の倍率２０倍での当該顕微鏡での観察結果、（５）は「Ｈｏｅｃｈｓｔ」の倍率４０倍での当該顕微鏡での観察結果、（６）は「Ｃｅｌｌ　ｍａｓｋ」の倍率４０倍での当該顕微鏡での観察結果、（７）は「ＰＧ－Ａｔｔｏ５９０」の倍率４０倍での当該顕微鏡での観察結果、（８）は「Ｍｅｒｇｅ」の倍率４０倍での当該顕微鏡での観察結果、（９）は「Ｍｅｒｇｅ」の倍率６０倍での当該顕微鏡での三次元での観察結果、である。

実験５において、血管新生能の評価を行った結果（位相差顕微鏡により観察を行って撮影した写真、倍率は４倍）である。図中において、（１）はＰＧ０群の培養開始６時間後の写真、（２）はＰＧ１００群の培養開始６時間後の写真、（３）はウシＰＧ１００群の培養開始６時間後の写真、である。大動脈リングアッセイを用いて、血管新生能を評価した結果（実験６の結果）である。坐骨神経損傷モデルを用いて、神経及び／又は血管の再生能を評価した結果（実験７の結果）である。坐骨神経損傷モデルを用いて、血管新生能を評価した結果（実験８の結果）である。坐骨神経損傷モデルを用いて、血管新生能等を評価した結果（実験９の結果）である。この図１４で示すバーは、５００μｍを示す。この図１４で示す点線は、モデルマウスを作製した際に損傷された坐骨神経の部位である。

坐骨神経損傷モデルを用いて、血管新生能を評価した結果（実験１１の結果）である。実験１２の結果である。実験１２の結果である。この図１７で示すバーは、２０μｍを示す。実験１２の結果である。この図１８で示すバーは、２００μｍを示す。

実験１３にて行った実験手順の模式図である。各投与群のニューロスフェアの形成数の測定結果である。縦軸は、ニューロスフェア（ＮＳ）の形成割合（％）を示すが、具体的にはコントロール群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）を示す。Ｄｕｎｎｅｔ法による統計解析を行い、＊は有意差を示し、ｐ＜０．０５である。各投与群のニューロスフェアの観察結果である。実験１４にて行った実験手順の模式図である。実験１５にて行った実験手順の模式図である。実験１６にて行った実験手順の模式図である。実験１６の結果（神経幹細胞におけるプロテオグリカンの局在の確認）である。「培地２の群」は培地２の条件で培養した群（標識していないプロテオグリカンを含有した培地にて培養した群）であり、「培地８の群」は培地８の条件で培養した群（標識したプロテオグリカンを含有した培地にて培養した群）である。「Ｈｏｅｃｈｓｔ」はヘキスト染色により神経幹細胞の核を標識したことを示し、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＰＧ」は蛍光染色により局在しているプロテオグリカンを標識したことを示す。実験１７の結果（神経幹細胞におけるプロテオグリカンの局在の確認（コンフォーカル顕微鏡による確認））である。「Ｈｏｅｃｈｓｔ」はヘキスト染色により神経幹細胞の核を標識したことを示し、「Ｃｅｌｌ　ｍａｓｋ」は神経幹細胞の細胞膜を標識したことを示し、「ＰＧ－Ａｔｔｏ５９０」はプロテオグリカンを標識したことを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は当該核の標識と当該細胞膜の標識と当該プロテオグリカンの標識とを合わせて示す。

　以下、本発明にかかるユニットについて説明する。

（ＶＥＧＦ）
　血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）は、下垂体ｆｏｌｉｃｕｌｏ－ｓｔｅｌｌａｔｅ（星状濾胞）細胞の培養液より単離された血管内皮細胞に特異的に作用する増殖因子である。ＶＥＧＦは、シスチンノット（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｋｎｏｔ）増殖因子スーパーファミリーの一員であり、胎生期におけるデノボ（ｄｅ　ｎｏｖｏ）な血管形成（Ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ、脈管形成）、既存の血管からの分岐伸長による新たな血管の形成（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、血管新生）などにおいて、重要な役割を担う細胞増殖因子ある。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－ＢなどからなるＶＥＧＦファミリータンパク質を構成している。ＶＥＧＦ－Ａは、血管内皮細胞の増殖、血管透過性の亢進、管膣形成の促進、内皮細胞からの活性物質の産生誘導など作用があり、ＶＥＧＦ－Ｅには腫瘍組織の血管形成への特異的な作用がある。

（液体培地）
　本発明で用いられる培地は、培地調製の簡便さ（例えば浮遊培養を行うときには培地調製をよりしやすいと考えられること）などの観点で、液体培地の方が好ましい。用いる液体培地は、公知の培地を用いることができる。例えば、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミン）を含む培地（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ（例えば、以下実施例にて用いたＤＭＥＭ／ハムＦ－１２培地（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５））、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ－１５培地、ＮＣＴＣ培地、Ｆ－１２培地、ＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ培地）などである。また、必要に応じて、更なる添加物（血清、抗生物質など）も含まれてもよい。

（血管新生）
　血管新生は、生体内で新たな血管のネットワークをつくる重要な形態形成現象の１つで、血管内皮細胞が他の細胞と協働して新しい血管の形成を創傷特異的に促進すること（より詳細に述べると、血管内皮細胞が他の細胞と協働して、出芽・伸長・分岐・管腔形成などを繰り返しながら、二次元・三次元の枝分かれ構造といった血管に特徴的な形を作っていくこと）、である。正常な（生理的な）血管新生に起こる生体内の現象は、例えば、胎児の血管形成、子宮内膜形成、卵胞形成、創傷治癒である。病的な血管新生により起こる生体内の現象として、例えば、悪性腫瘍の形成、眼内血管新生病、関節リウマチ、粥状動脈硬化症である。血管新生が十分でないために起こる生体内の現象は、例えば、閉塞性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞である。血管新生が十分でないために起こる生体内の現象（疾患）に対して治療するために、例えば血管新生を促進する血管再生療法が用いられる。

（血管新生促進を起こすための細胞）
　本発明で用いられる血管新生促進を起こすための細胞は、種類は特に問わないが、ヒト等の哺乳動物の細胞であり、例えば体細胞、その体細胞の前駆細胞又はそれらの混合細胞である。本発明で用いられる血管新生促進を起こすための細胞は、体細胞としては、例えば、心筋細胞、内皮細胞（血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞など）、壁細胞（周皮細胞など）、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞など）、などが挙げられる。なお、以下実施例では、血管新生促進を起こすための細胞として、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を用いた。

（ゲル成分）
　本発明で用いるゲル成分（材料）は、通常、生体適合性のあるものであり、水を大量に含むことができ、酸素、水、栄養物及び酵素などの細胞生存に必要な物質を容易に拡散移動させることができる。ゲル成分の形態は、ユニットに組み込むことができれば特に限定されないが、例えば、粒子状、顆粒状、フィルム状、チューブ状、ディスク状、網状、メッシュ状、多孔質状、懸濁状もしくは分散状などが挙げられる。ゲル成分は、例えばゼラチンハイドロゲルなどハイドロゲルが挙げられる。ゲル成分には、血管新生促進を起こすための細胞の増殖性を調整するなどのために、必要に応じて、諸々の成分、例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、エンタクチン／ニドゲン、所定の成長因子を含有することもできる。以下実施例では、ゲル成分として、例えば、マトリゲル（登録商標、コーニング、Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｕｍｂｅｒ：３５６２３１）、Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｇｅｌ　Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ１－Ａ（新田ゼラチン、６３８－００７８１）を用いた。

（プロテオグリカン）
　プロテオグリカンはコアタンパク質にコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸等のグリコサミノグリカン（以下ＧＡＧと表す。）と呼ばれる糖鎖が共有結合した糖タンパク質である。プロテオグリカンは、細胞外マトリックスの主要構成成分の一つとして皮膚や軟骨など体内に広く分布している。ＧＡＧ鎖は分岐を持たない長い直鎖構造を持つ。多数の硫酸基とカルボキシル基を持つため負に荷電しており、ＧＡＧ鎖はその電気的反発力のために延びた形状をとる。また、プロテオグリカンは、糖の持つ水親和性により、多量の水を保持することができる。プロテオグリカンに含まれる多数のＧＡＧ鎖群はスポンジのように水を柔軟に保持しながら、弾性や衝撃への耐性といった軟骨特有の機能を担っている。

　プロテオグリカンのコアタンパク質はマトリックス中の様々な分子と結合する性質をもつ。軟骨プロテオグリカンの場合、Ｎ末端側にヒアルロン酸やリンクタンパク質との結合領域を持ち、これらの物質と結合すること、同一分子間で会合することもある。Ｃ末端にはレクチン様領域、ＥＧＦ様領域などを持ち様々な他の分子と結合する。この性質により、プロテオグリカンはそれぞれの組織にあった構造を築く。
　プロテオグリカンのうち、コンドロイチン硫酸型プロテオグリカンは、コンドロイチン硫酸がコアタンパク質に共有結合されているプロテオグリカンである。

　サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンは、サケの鼻軟骨から抽出して得られたプロテオグリカンである。ここで、サケは、例えばサケ属（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）に属する魚であるが、好ましくは細胞増殖性（例えば、培養したい細胞をより効率的に培養すること）の観点で学名が「Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｋｅｔａ」のサケが選択される。
　また、本発明に係るユニットに含まれるプロテオグリカンの含有量は、例えば細胞増殖性などの観点で、下限は好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．２μｇ／ｍｌ以上、更に好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以上である。
　本発明に係るユニットに含まれるプロテオグリカンは、例えば公報（日本特許第６３１７０５３号公報）に記載の方法で作製される。以下、実施例で示す実験では、プロテオグリカンとして、例えば、サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））、ウシ鼻中隔由来のプロテオグリカンを用いた。

　本発明に係るユニットにおいては、プロテオグリカンは、液体培地及び／又はゲル成分に含有される。

（ユニット）
　上述のように、本発明に係るユニットは、「ゲル成分と、プロテオグリカンと、を含む、血管新生促進のために用いられるユニット（集団）」、「ＶＥＧＦを含有する液体培地と、血管新生促進を起こすための細胞と、ゲル成分と、プロテオグリカンと、を含むユニット（集団）」などであるが、例えばゲル成分を更に用いて、当該ユニットを複数積層化したものを作製して、該積層化したものを、ヒト等の体内に移植することも可能である。

　本発明に係るユニットは、例えば、細胞移植などの細胞治療（自身の細胞または他人の細胞を用いて疾患を治療する治療法）、再生誘導医療（生体内に存在する幹細胞を、体外に取り出すことなく、怪我や病気で損傷した組織に局所動員し、機能的組織再生を誘導する治療）にて用いることが可能である。

（ＦＧＦ－２）
　ＦＧＦ－２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－２、繊維芽細胞成長因子）は、ｂＦＧＦとも呼ばれ、動物の神経組織、下垂体、副腎皮質、胎盤などから単離できる。ＦＧＦ－２は、神経分化、生存、再生を誘導すると共に、胚発生や分化を調節することが知られている。ＦＧＦ－２は、例えば、細胞増殖因子、血管新生因子、神経栄養因子として幅広い機能を有し、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を始めとする様々な細胞に対して、増殖活性を示す。

（ＥＧＦ）
　ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ、上皮増殖因子）は、上皮性細胞をはじめとする種々の細胞に対し増殖を促進する作用を持つポリペプチドである。ＥＧＦの作用は種特異性が少なく，上皮細胞，繊維芽細胞，肝細胞などさまざまな細胞に対し増殖効果を示す。生体においては細胞の増殖・分化に重要な役割を果たしている成長因子と考えられている。

（神経幹細胞）
　神経幹細胞は、自己複製能と多分化能を併せもった、神経系の未分化な組織幹細胞、である。ヒトなどの哺乳類の胎生期の脳では、神経幹細胞が先ずは盛んに増殖することで自らの数を指数関数的に増やし、次いで、非対称分裂を生み出す。また、胎生後期や生後の脳では、アストロサイトやオリゴデンドロサイトを生み出すことが知られている。神経幹細胞は、中枢神経系を構成する主要な細胞型であるニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトの供給源となる細胞である。本発明では、好ましくはヒト、マウスなどの哺乳類由来の細胞を用いる。

（神経再生）
　中枢及び／又は末梢神経などの神経再生は、神経における正常発生の過程を少なくとも一部再現することを表わし、再生する細胞の由来に左右されない。再生する細胞としては、例えば、幹細胞（例えば、神経幹細胞、胚性幹細胞、骨髄細胞等）、神経前駆細胞または神経細胞等が挙げられる。さらに、神経再生する細胞は、内在性の細胞（例えば、神経幹細胞、神経前駆細胞、神経細胞、成熟神経細胞等）であっても、外因性の細胞（例えば、移植神経幹細胞、移植神経前駆細胞、移植神経細胞、移植成熟神経細胞等）であってもよい。外因性の細胞は、自家由来の細胞であっても他家由来の細胞であってもよい。また、神経再生は、組織再生または機能再生を包含し、例えば、上記した細胞の生着、分化、増殖及び／又は成熟等が含まれる。成熟は、例えば、神経細胞が信号のやりとり等の機能的に働く状態に成長することである。また、再生は、例えば神経栄養因子様作用や神経栄養因子活性増強作用も包含する。例えば、末梢神経再生は、外的要因又は内的要因により傷ついた末梢神経が標的細胞へ伸展すること、神経回路を再構築できること、末梢神経障害の予防及び／又は治療などである。

［実験１：血管新生能の評価］
　ヒト正常新生児由来の臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ、以下「ＨＵＶＥＣ」と記載する）を用いて、プロテオグリカン等が含有されたユニットの血管新生能の評価を行った。

　以下実験方法を記載する。まず、各ウェルにマトリゲル（１５０μｌ／ｗｅｌｌ）を入れ、１０分間室温（２３℃）で静置した。この静置後、更に３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて３０分間静置した。この３０分間静置後に、各ウェルに培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）を加え、平衡化を、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて、１５分間行った。当該平衡化の後、各ウェルにＨＵＶＥＣ（５．０×１０^４個／ｗｅｌｌ）を播種して、以下の各群（ＰＧ０、ＰＧ１、ＰＧ１０、ＰＧ１００、ＰＧ１０００、ＧＡＧ１０００）の培地の条件で、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で細胞培養した。この培養開始から２時間後（図では２ｈと記載）、この培養開始から４時間後（図では４ｈと記載）、この培養開始から６時間後（図では６ｈと記載）において、所定の評価を行った。

　この実験１において、各群（ＰＧ０、ＰＧ１、ＰＧ１０、ＰＧ１００、ＰＧ１０００、ＧＡＧ１０００）の培地の組成は以下である。

（ＰＧ０）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）にプロテオグリカンの含有なし。

（ＰＧ１）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）にプロテオグリカンを最終濃度１μｇ／ｍｌとなるように添加した培地。

（ＰＧ１０）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）にプロテオグリカンを最終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した培地。

（ＰＧ１００）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）にプロテオグリカンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地。

（ＰＧ１０００）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）にプロテオグリカンを最終濃度１０００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地。

（ＧＡＧ１０００）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）にＧＡＧを最終濃度１０００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地。

　この実験１の結果を、図１から図４に示す。図１と図２に示す実験結果は、培地にプロテオグリカンを添加することにより血管新生が促進されるが、培地にＧＡＧ（プロテオグリカンと異なり、コアタンパク質が結合されていない形態）では血管新生が促進されない、という結果であった。図３と図４に示す実験結果は、培地にプロテオグリカンを濃度依存的に添加することにより（少なくともプロテオグリカンを１００μｇ／ｍｌ添加した群までは）、血管新生が促進される結果であった。

［実験２：血管新生能の評価］
　ＨＵＶＥＣを用いて、プロテオグリカン等が含有されたユニットの血管新生能の評価を行った。実験１と異なり、この実験２では、マトリゲルに所定量のプロテオグリカンを添加することによる血管新生能の評価を行った。

　以下実験方法を記載する。各ウェルに、マトリゲル（１５０μｌ／ｗｅｌｌ、プロテオグリカンを添加せず）又はプロテオグリカンが１００μｇ／ｍｌの割合で添加したマトリゲル（１５０μｌ／ｗｅｌｌ）を入れ、１０分間室温（２３℃）で静置した。ここで、図５と図６において、「ＰＧ０」はマトリゲル（１５０μｌ／ｗｅｌｌ、プロテオグリカンを添加せず）の群、「ＰＧ１００」はプロテオグリカンが１００μｇ／ｍｌの割合で添加したマトリゲル（１５０μｌ／ｗｅｌｌ）の群、として記載する。
　この静置後、更に３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて３０分間静置した。この３０分間静置後に、各ウェルに培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）を加え、平衡化を３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて、１５分間行った。当該平衡化の後、各ウェルにＨＵＶＥＣ（５．０×１０^４個／ｗｅｌｌ）を播種して、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて細胞培養した。この培養開始から２時間後（図では２ｈと記載）、この培養開始から４時間後（図では４ｈと記載）、この培養開始から６時間後（図では６ｈと記載）において、所定の評価を行った。

　この実験２の結果を、図５と図６に示す。図５と図６に示す実験結果は、培養液ではなくマトリゲルにプロテオグリカンを添加した場合でも血管新生が促進される、という結果であった。

［実験３：血管新生におけるプロテオグリカンの局在の確認］
　ＨＵＶＥＣを用いて、血管新生におけるプロテオグリカンの局在を、蛍光顕微鏡とコンフォーカル顕微鏡を用いて確認した。

　以下、この実験３の手順を記載する。まず、以下の３種類のウェルを準備する。
・マトリゲルを添加しない群：図７では「培地中標識ＰＧ（マトリゲル無）」と記載。
・マトリゲルを添加（７０μｌ／ｗｅｌｌ）した群：図７と図８では「培地中標識ＰＧ」と記載。
・マトリゲルを添加（７０μｌ／ｗｅｌｌ）し、更にこのマトリゲルには、マトリゲルと培養液とのユニットにおいて最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように、「標識ＰＧ１」を添加した群：図７と図８では「ゲル中標識ＰＧ」と記載。

　これらのウェルを準備した後、１０分間室温（２３℃）で静置した。この静置後、更に３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて３０分間静置した。

　この３０分間静置後に、各ウェルに培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）を加え、平衡化を３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて、１５分間行った。当該平衡化の後、各ウェルにＨＵＶＥＣ（５．０×１０^４個／ｗｅｌｌ）を播種した。ここで、マトリゲルを添加（７０μｌ／ｗｅｌｌ）した群（培地中標識ＰＧ群）では、マトリゲルと培養液とのユニットにおいて最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように、培養液に「標識ＰＧ１」を更に添加した。

　当該播種した後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて２時間細胞培養した。当該培養後、４００ｇで３分間遠心分離することで各ウェルの細胞を回収した。回収した細胞を、ＰＢＳで５分ｗａｓｈした。当該ｗａｓｈ後の細胞を４％パラホルムアルデドで１５分間固定した。当該固定後、細胞を再度ＰＢＳにて５分ｗａｓｈした。当該ｗａｓｈ後に、細胞をスライドガラス上にＤＡＰＩ（株式会社同仁化学研究所、Ｄ２１２－Ｃｅｌｌｓｔａｉｎ^ＴＭ－ＤＡＰＩ）が含有された封入剤でマウントすることで観察試料を作製した。蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社：倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ８１）とコンフォーカル顕微鏡（オリンパス株式会社：共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ３０００）とを用い、倍率４０倍で、ＨＵＶＥＣの核（ＤＡＰＩにて染色）、プロテオグリカンの局在を比較した。

　観察結果を図７と図８に示す。図７と図８において、青色はＤＡＰＩにてＨＵＶＥＣの核が染色されたこと、緑色はプロテオグリカンが標識されたことを示している。培地中標識ＰＧ（マトリゲル無し）群では、プロテオグリカンの局在を確認できなかった（図７の（１）から（３））。一方で、培地中標識ＰＧ群とゲル中標識ＰＧでは（図７の（４）から（９）、図８）、当該細胞培養開始２時間後で既に、内皮細胞の局在とプロテオグリカンの局在が高い相関性を示したこと（具体的には、環状構造を作ろうとしている血管に沿ってプロテオグリカンが分布すること）、を確認した。

［実験４：血管新生におけるプロテオグリカンの局在の確認］
　ＨＵＶＥＣを用いて、血管新生におけるプロテオグリカンの局在を、蛍光顕微鏡とコンフォーカル顕微鏡を用いて確認した。この実験４で用いた標識されたプロテオグリカンは、実験３で用いた標識ＰＧ２ではなく、標識ＰＧ１である。

　以下、この実験４の手順を記載する。まず、以下の２種類のウェルを準備する。
・マトリゲルを添加しない群：図９では図示していない群。
・マトリゲルを添加（７０μｌ／ｗｅｌｌ）し、更にこのマトリゲルには、マトリゲルと培養液とのユニットにおいて最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように、プロテオグリカンを添加した群：図９で図示した群。

　当該播種した後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて２時間細胞培養した。観察で用いる細胞（当該培養後の細胞）を回収する１時間前に、細胞の核を染色するためにヘキスト３３３４２（最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ、Ｈｏｅｃｈｓｔ^ＴＭ　３３３４２イメージングプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））及び細胞の細胞膜を染色するためにＣｅｌｌｍａｓｋ（最終濃度５ｍｇ／ｍＬ、ＣｅｌｌＭａｓｋ^ＴＭ染色（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を添加して染色した。当該培養後、４００ｇで３分間遠心分離することで細胞を回収した。当該回収した細胞を、ＰＢＳで５分ｗａｓｈした。当該ｗａｓｈ後の細胞を４％パラホルムアルデドで１５分間固定した。当該固定後、細胞を再度ＰＢＳにて５分ｗａｓｈした。当該ｗａｓｈ後に、細胞をスライドガラス上に封入剤でマウントすることで観察試料を作製した。コンフォーカル顕微鏡（オリンパス株式会社：共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ３０００）を用い、倍率２０倍と倍率４０倍と倍率６０倍で、ＨＵＶＥＣの核（上述のヘキストにて染色）、ＨＵＶＥＣの細胞膜（上述のＣｅｌｌｍａｓｋにて染色）、プロテオグリカンの局在を比較した。

　観察結果を図９に示す。図９において、「Ｈｏｅｃｈｓｔ」はヘキスト染色によりＨＵＶＥＣの核を標識したことを示し、「Ｃｅｌｌ　ｍａｓｋ」はＣｅｌｌＭａｓｋ^ＴＭ染色によりＨＵＶＥＣの細胞膜を標識したことを示し、「ＰＧ－Ａｔｔｏ５９０」は標識ＰＧ２にてプロテオグリカンを標識したことを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は当該核の標識と当該細胞膜の標識と当該プロテオグリカンの標識とを合わせて示す。図９で示す確認結果により、図７と図８で示す結果と同じように、当該細胞培養開始２時間後で既に、内皮細胞の局在とプロテオグリカンの局在が高い相関性を示したこと（具体的には、環状構造を作ろうとしている血管に沿ってプロテオグリカンが分布すること）、を確認した。なお、図９では図示しないが、マトリゲルを添加しない群では、図９に示すような局在を確認できなかった。

［実験５：血管新生能の評価］
　ＨＵＶＥＣを用いて、プロテオグリカン等が含有されたユニットの血管新生能の評価を行った。

　以下実験方法を記載する。まず、各ウェルにマトリゲル（１５０μｌ／ｗｅｌｌ）を入れ、１０分間室温（２３℃）で静置した。この静置後、更に３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて３０分間静置した。この３０分間静置後に、各ウェルに培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）を加え、平衡化を、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下にて、１５分間行った。当該平衡化の後、各ウェルにＨＵＶＥＣ（５．０×１０^４個／ｗｅｌｌ）を播種して、以下の各群（ＰＧ０、ＰＧ１００、ウシＰＧ１００）の培地の条件で、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で細胞培養した。この培養開始から６時間後において、所定の評価を行った。

　この実験５において、各群（ＰＧ０、ＰＧ１００、ウシＰＧ１００）の培地の組成は以下である。

（ＰＧ０）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）に、プロテオグリカンの含有なし。

（ＰＧ１００）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）に、プロテオグリカン（サケ鼻軟骨由来のプロテオグリカン）を最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地。

（ウシＰＧ１００）
　培養液（ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ）に、ウシ鼻中隔由来のプロテオグリカンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように添加した培地。

　この実験５の結果を、図１０及び以下表１から表３に示す。表１から表３では、図１０で示した各群の培養開始から６時間後のサンプルにおいて、血管の長さ（表１）、網目構造の数（表２）、分岐点の数（表３）を測定した結果を示す。表１から表３で示す結果は、ランダムに選んだ４つの視野について各々の項目（血管の長さ、網目構造の数、分岐点の数）を定量し、定量した値の平均値を算出した結果である。表１から表３において、測定値はＰＧ０を１００とした場合の相対値を示し、ＳＤは標準偏差である。

　実験５の結果では、培地にサケ鼻軟骨由来のプロテオグリカンの添加群（ＰＧ１００）だけでなく、ウシ鼻中隔由来のプロテオグリカンの添加群（ウシＰＧ１００）でも、血管新生が促進される結果であった。

　なお、この実験１から実験５では、以下の試料等を用いた。
・ＨＵＶＥＣ（Ｃ２５１７Ａ及びＣ２５１７ＡＳ、ＬＯＮＺＡ）：ヒト正常新生児由来の臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｖｅｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ）、単一ドナー由来の細胞。
・ＥＧＭ^ＴＭ－２　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ^ＴＭ（ＣＣ－３１６２、ＬＯＮＺＡ）：ＥＢＭ^ＴＭ　－２　基本培地（ＣＣ－３１５６）が５００ｍＬの場合に、ＶＥＧＦ（０．５ｍＬ）、ｈＥＧＦ（０．５ｍＬ、ヒト由来のＥＧＦ）、Ｒ３－ＩＧＦ－１（０．５　ｍＬ）、Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ（０．５ｍＬ）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（０．２ｍＬ）、ｈＦＧＦβ（２ｍＬ、ヒト由来のＦＧＦベータ）、Ｈｅｐａｒｉｎ（０．５ｍＬ）、ＦＢＳ（１０ｍＬ）及びＧＡ（０．５ｍＬ）が含有される。
・プロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来。なお、なおこのプロテオグリカンから常法によりＧＡＧのみを精製し作製したものが実験１で用いたＧＡＧである。ＧＡＧは、プロテオグリカンと異なり、コアタンパク質が結合されていない。
・蛍光標識したプロテオグリカンその１（明細書と図面では「標識ＰＧ１」とも記載）：ＡＴＴＯ　４８８　ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とプロテオグリカンとを、メーカー推奨の方法（製品：ＡＴＴＯ　４８８　ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に示す方法）にて、室温で２時間反応させた。この反応の後、Ｚｅｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製を行い、蛍光標識したプロテオグリカンを回収した。標識ＰＧ１は、この回収した蛍光標識したプロテオグリカンである。
・蛍光標識したプロテオグリカンその２（明細書と図面では「標識ＰＧ２」とも記載）：Ａｔｔｏ　５９０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、７０４２５）とプロテオグリカンとを、メーカー推奨の方法（製品：Ａｔｔｏ　５９０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、７０４２５）に示す方法）にて、室温で２時間反応させた。この反応の後、Ｚｅｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製を行い、蛍光標識したプロテオグリカンを回収した。標識ＰＧ２は、この回収した蛍光標識したプロテオグリカンである。
・マトリゲル（コーニング、Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｕｍｂｅｒ：３５６２３１）：Ｃｏｒｎｉｎｇ^ＴＭマトリゲル　基底膜マトリックス　グロースファクター　リデュースト　フェノールレッドフリー。
・ウシ鼻中隔由来のプロテオグリカン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、製品番号：Ｐ５８６４）：プロテオグリカン　ウシ鼻中隔由来（Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　ｎａｓａｌ　ｓｅｐｔｕｍ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｌｌｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ）

［実験６：大動脈リングアッセイを用いた血管新生能の評価］
　ＶＥＧＦとゲル成分（コラーゲンゲル）とプロテオグリカンとを含むユニットの効果を確認するために、１２週齢のオスの血管レポーターマウス（Ｆｌｔ１－ｔｄｓＲｅｄ　ＢＡＣトランスジェニックマウス）の胸部大動脈を用いて、大動脈リングアッセイ（Ａｏｒｔｉｃ　ｒｉｎｇ　アッセイ（ｅｘ　ｖｉｖｏアッセイ））を行った。当該アッセイは、論文（ＴＨＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ｏｆ　ＪＡＰＡＮＥＳＥ　ＣＯＬＬＥＧＥ　ｏｆ　ＡＮＧＩＯＬＯＧＹ　ｖｏｌ．４５　Ｎｏ．１０、６３７ページから６４１ページ）の記載を参考にして行った。

　まず、ガラスボトムｄｉｓｈに、コラーゲンゲルの層（Ｂａｓｅ　Ｌａｙｅｒ）を作製した。

　次に、実験で用いるリング状の大動脈片（約２ｍｍ厚）を作製した。当該レポーターマウスより胸大動脈を採取して、当該採取した胸大動脈から外膜を除去して、当該大動脈片を作製した。

　次に、当該ｄｉｓｈ上に、約２個の大動脈片を、培養皿の底面と垂直になるように置き、再構成コラーゲン液（０．３質量％　Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ１－Ａ、新田ゼラチン）を重層した。当該重層した後、３０分間３７℃で静置して、当該ｄｉｓｈ上の混合物（Ｂａｓｅ　Ｌａｙｅｒ、大動脈片及び再構成コラーゲン液）のゲル化を行った。

　当該ゲル化の後、当該混合物に対して、コントロールの培養液又はプロテオグリカンが含有された培養液を添加した。当該添加後、当該培養液が添加された混合物を１４日間３７℃で培養した。なお、コントロールの培養液を添加した群を「コントロール群」、プロテオグリカンが含有された培養液を添加した群を「ＰＧ投与群」とした。大動脈片からから伸展した細胞を位相差顕微鏡で確認した。コントロール群及びＰＧ投与群について、当該大動脈片から伸展した細胞（図１１において矢印で示すもの）の総面積を測定した。図１１のバーは、２００μｍを示す。当該総面積の値を、血管新生能の測定結果した。

　測定結果を以下記載する。コントロール群の総面積を１００とした場合に、当該コントロール群と比べ、ＰＧ投与群は５５５．２（スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ－ｔｅｓｔ）にて、ｐ＜０．００１）であった。よって、コントロール群に比べ、ＰＧ投与群では有意に血管新生能が確認できた。

　なお、この実験６では、以下の試料等を用いた。
・コラーゲンゲル：Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｇｅｌ　Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ　ｔｙｐｅ１－Ａ（新田ゼラチン、６３８－００７８１）
・ガラスボトムｄｉｓｈ：３５ｍｍガラスボトムｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ、３９１１－０３５）
・コントロールの培養液（コントロール群の培養液）：基礎培地５００ｍＬの場合に、当該基礎培地に、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ増殖添加剤セットに含有の６種類の液、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるようにＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３６２４４３６）が含有された液で、プロテオグリカンが含有されていない液。
・プロテオグリカンが含有された培養液（ＰＧ投与群の培養液）：基礎培地５００ｍＬの場合に、当該基礎培地に、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ増殖添加剤セットに含有の６種類の液、最終濃度が２０ｎｇ／ｍＬとなるようにＶＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３６２４４３６）が含有された液で、プロテオグリカンが最終濃度で１００μｇ／ｍＬの割合で含有された液。
・基礎培地：ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ２（倉敷紡績株式会社、ＫＥ－２３５０Ｓ）
・ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＧ増殖添加剤セット（倉敷紡績株式会社、ＫＥ－６１５０）：正常ヒト血管内皮細胞用増殖添加剤（５００ｍｌ用）のキットであり、ＦＢＳ（１０ｍＬ）、ｈＥＧＦ（０．５ｍＬ、ヒト由来のＥＧＦ）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ（ハイドロコーチゾン、ヒドロコルチゾン、０．５ｍＬ）、ｈＦＧＦβ（０．５ｍＬ、ヒト由来のＦＧＦベータ）、Ｈｅｐａｒｉｎ（０．５ｍＬ）及び抗菌剤（０．５ｍＬ、ゲンタマイシン／アンフォテリシンＢ）が含まれるキットである。
・プロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来。

［実験７：坐骨神経損傷モデルによる神経及び／又は血管の再生能の評価］
　坐骨神経を損傷させたモデルマウス（坐骨神経を切断したモデルマウス）を用いて、ＶＥＧＦとゲル成分（マトリゲル）とプロテオグリカンとを含むユニットの投与による神経及び／又は血管の再生能を評価した。

　実験方法を記載する。先ず、１２週齢のオスの血管レポーターマウス（Ｆｌｔ１－ｔｄｓＲｅｄ　ＢＡＣトランスジェニックマウス）の尾部の方の坐骨神経（右肢及び左肢の坐骨神経）を切断して、当該モデルマウス（ｎ＝２）を作製した。当該モデルマウスの右側坐骨神経には１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置を、当該モデルマウスの左側坐骨神経にはＣｏｎｔｒｏｌ群処置を行った。

　ここで、以下定義する。
・１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置：マトリゲルにプロテオグリカン（最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬ）を入れたユニットを、当該坐骨神経（当該坐骨神経の損傷（切断）部位）に載置した処置。
・Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置：マトリゲルを、当該坐骨神経（当該坐骨神経の損傷（切断）部位）に載置した処置。
・プロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来。
・マトリゲル（コーニング、Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｕｍｂｅｒ：３５６２３１）：Ｃｏｒｎｉｎｇ^ＴＭマトリゲル　基底膜マトリックス　グロースファクター　リデュースト　フェノールレッドフリー。

　当該処置後、直ちに当該処置したモデルマウスの部位の筋層及び皮膚を縫合した。当該縫合後、当該モデルマウスの５日間の通常の飼育又は８日間の通常の飼育を行った。当該通常の飼育後、当該モデルマウスを解剖して、当該処置した部位の肉眼及び実体顕微鏡での確認を行った。当該確認の後、当該モデルマウスから坐骨神経（５ｍｍ程度）を採取した。

　当該確認の結果及び採取した坐骨神経の写真を図１２に示す。
　当該確認では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置（図１２ではＣｏｎｔｒｏｌと標記、プロテオグリカンが含有されない群）に比べ、１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置（図１２では１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧと標記）にて、処置５日後にて坐骨神経の再生が確認できた（図１２の矢印の部位）。処置８日目では、Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置（プロテオグリカンが含有されない群）に比べ、１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置にて、更に坐骨神経の再生が確認できた。なお、当該再生した部位付近は、肉眼で見たところ、炎症が見られなかった。
　当該採取した坐骨神経を確認すると、処置５日目でも処置８日目でも、Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置（プロテオグリカンが含有されない群）の坐骨神経に比べ、１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置にて、更に坐骨神経が大きくなっていることを確認した。

［実験８：坐骨神経損傷モデルによる血管新生能の評価］
坐骨神経を損傷させたモデルマウス（坐骨神経を切断したモデルマウス）を用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングを用いて、ゲル成分（マトリゲル）とプロテオグリカンとを含むユニットの投与による血管の再生能を評価した。では、機器含めＩＶＩＳ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ））を用いて、当該イメージングを用いた評価を行った。

　実験方法を記載する。先ず、９週齢のメスの血管レポーターマウス（Ｆｌｔ１－ｔｄｓＲｅｄ　ＢＡＣトランスジェニックマウス）の尾部の方の坐骨神経（右肢及び左肢の坐骨神経）を切断して、当該モデルマウス（ｎ＝１）を作製した。当該モデルマウスの右側坐骨神経には１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置を、当該モデルマウスの左側坐骨神経にはＣｏｎｔｒｏｌ群処置を行った。

　ここで、以下定義する。
・ＰＧ群処置：マトリゲルにプロテオグリカン（最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬ）を入れたユニットを、当該坐骨神経（当該坐骨神経を損傷（切断）した部位）に載置した処置。
・Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置：マトリゲルを、当該坐骨神経（当該坐骨神経を損傷（切断）した部位）に載置した処置。
・プロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来。
・マトリゲル（コーニング、Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｕｍｂｅｒ：３５６２３１）：Ｃｏｒｎｉｎｇ^ＴＭマトリゲル　基底膜マトリックス　グロースファクター　リデュースト　フェノールレッドフリー。

　当該処置後、直ちに当該処置したモデルマウスの部位の筋層及び皮膚を縫合した。当該縫合後、アルファルファフリーの蛍光イメージング用飼料（５Ｖ５Ｍ、ＰｉｃｏＬａｂ^ＲＳｅｌｅｃｔＭｏｕｓｅ５０ＩＦ／９Ｆ）を用いて、当該モデルマウスの７日間の通常の飼育も行った。

　当該飼育の７日目に、ＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ^ＴＭ７５０ＥＸ（パーキングエルマ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、ＮｅＶ１００１１ＥＸ）を当該モデルマウス尾静脈に注射により投与（投与量：ｄｏｓｅ　ｏｆ　２ｎｍｏｌ／１００μＬ　ｏｆ　ＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ　７５０　ＥＸ　ｐｅｒ　ｍｏｕｓｅ）を行った。当該注射による投与後の一定時間、通常の飼育を継続した。当該注射による投与後の１８時間後、２１時間後及び２４時間後の当該モデルマウスのＩＶＩＳの撮影を行った。

　当該撮影の条件を以下に示す。
・Ｅｘｐｏｓｕｒｅ：５．００ｓｅｃ
・Ｂｉｎｉｎｇ：Ｍｅｄｉｕｍ
・Ｆｓｔｏｐ：２
・Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：６４０
・Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：Ｃｙ５．５

　なお、当該撮影直前に、当該モデルマウスの全身麻酔を行い、当該麻酔後に当該モデルマウスの所定部位の体毛を除去した。当該除去後に撮影を行った。当該全身麻酔は、麻酔を循環させた吸引麻酔ボックス内へ当該モデルマウスを一定時間入れることにより、行われた。当該除去は、上述の処置（ＰＧ群処置又はＣｏｎｔｒｏｌ群処置）を行った部位付近の体毛の除去である。

　撮影した結果を図１３に示す。図１３において、（１）が当該１８時間後の結果、（２）が当該２１時間後の結果、（３）が当該２４時間後の結果である。図１３の右側には、蛍光（図１３に記載のＥｐｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の程度を示す。当該程度は、放射効率（図１３に記載の式、ｒａｄｉａｎｔ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により算出した。当該程度において、黄色の方がよりマウス生体内で血管新生が起きていることを示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置群（図１３ではＣｏｎｔｒｏｌと標記）に比べ、ＰＧ群処置群（図１３ではＰＧと標記）では、顕著に黄色の発現確認（図１３の矢印の部位）ができた。当該発現は血管新生が起きていることを示している。

　図１３にて示す評価において、図１３の四角で示した部位について、Ｔｏｔａｌ　Ｒａｄｉａｎｔ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（［ｐ／ｓ］／［μＷ／ｃｍ^２］、光源の光度（光の強さ））及びＡｖｅｒａｇｅ　Ｒａｄｉａｎｔ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（［ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ］／［μＷ／ｃｍ^２］、光源から放射された皮膚表面における輝度の平均値）も定量した。当該定量結果を表４及び表５に示す。表４及び表５の「（１）、（２）、（３）、Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＧ」の標記は、図１３の標記の群を示す。当該定量結果からも、Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置群に比べ、ＰＧ群処置群では、顕著に黄色の発現確認がされたことが示された。

［実験９：坐骨神経損傷モデルによる血管新生能等の評価］
坐骨神経を損傷させたモデルマウス（坐骨神経を切断したモデルマウス）を用いて、ゲル成分（マトリゲル）とプロテオグリカンとを含むユニットの投与により、免疫組織染色により、血管新生及び神経再生が起こるかを確認した。

　実験方法を記載する。先ず、１２週齢のメスの血管レポーターマウス（Ｆｌｋ１－ＧＦＰ－ＢＡＣトランスジェニックマウス）の尾部の方の坐骨神経（右肢及び左肢の坐骨神経）を切断して、当該モデルマウス（ｎ＝１）を作製した。当該モデルマウスの右側坐骨神経には１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置を、当該モデルマウスの左側坐骨神経にはＣｏｎｔｒｏｌ群処置を行った。

　当該処置後、直ちに当該処置したモデルマウスの部位の筋層及び皮膚を縫合した。当該縫合後、アルファルファフリーの蛍光イメージング用飼料（５Ｖ５Ｍ、ＰｉｃｏＬａｂ^ＲＳｅｌｅｃｔＭｏｕｓｅ５０ＩＦ／９Ｆ）を用いて、当該モデルマウスの８日間の通常の飼育を行った。当該８日間の通常の飼育後、当該モデルマウスの右肢の坐骨神経及び左肢の坐骨神経を採取した。当該右肢は１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置が行われた肢、当該左肢はＣｏｎｔｒｏｌ群処置が行われた肢である。

　当該採取した右肢の坐骨神経及び左肢の坐骨神経をＰＢＳで５分ｗａｓｈした。当該ｗａｓｈ後の細胞を４％パラホルムアルデドで１時間固定した。当該固定後、３０質量％のスクロース溶液により置換した。当該置換後、凍結組織切片作製用包埋剤（ティシュー・テック　Ｏ．Ｃ．Ｔ．　コンパウンド、サクラファインテックジャパン）を用いて、当該右肢の坐骨神経及び当該左肢の坐骨神経をそれぞれ包埋してサンプルを作製した。当該包埋後、当該包埋したサンプルを－８０℃にて３時間静置した。当該静置により、当該右肢の坐骨神経の凍結切片及び当該左肢の坐骨神経の凍結切片を作製した。クリオスタットＨＭ５２５ＮＸ（サーモフィッシャーサイエンフィフック株式会社）を用いて、当該凍結切片を切り、１００μｍ厚で切片を作製した。

　当該１００μｍ厚の切片をＢｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒにより、室温（２５℃程度）で３時間ブロッキングした。当該ブロッキング後、切片を、所定の抗体を１０％Ｄｏｎｋｅｙ　Ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳにより希釈して作製した反応液（一次抗体反応液）で、４℃で一晩（８時間程度）一次抗体反応を行った。当該一次抗体反応後、０．３％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳを用いて切片を洗浄（室温にて５分×３回）した。当該洗浄後、当該洗浄後の切片を、所定の二次抗体を１０％Ｄｏｎｋｅｙ　Ｓｅｒｕｍ／ＰＢＳにより希釈して作製した反応液（二次抗体反応液）で、室温で３時間二次抗体反応を行った。当該二次抗体反応後、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳを用いて切片を洗浄（室温にて５分×１回）した。当該洗浄後の切片を、所定のマウント剤を用いて封入した。
　当該封入後の切片を、コンフォーカル顕微鏡（オリンパス株式会社：共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ３０００）を用い、倍率４倍で、当該血管新生及び神経再生が起こるかを確認した。

　上述の当該切片を作製する際に用いた液の組成は以下の通りである。

　当該一次抗体反応を、以下表１０で示す一次抗体反応液行った。

　当該二次抗体反応を、以下表１１で示す二次抗体反応液行った。

　この実験９の結果を、図１４に示す。図１４において、「ＶＥＧＦＲ２－ＥＧＦＰ」は血管新生が起きているかを見るための実験群（ＥＧＦＰによる緑色の発現により確認）、「Ｎｅｕｒｏ　ｆｉｌａｅｎｔ」は神経再生が起きているかを見るための実験群（赤色の発現により確認）、「Ｍｅｒｇｅ」は「ＶＥＧＦＲ２－ＥＧＦＰ」と「Ｎｅｕｒｏ　ｆｉｌａｅｎｔ」とを合わせて示しているもの、である。

　「ＶＥＧＦＲ２－ＥＧＦＰ」に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置群（図１４ではＣｏｎｔｒｏｌと標記）に比べ、ＰＧ群処置群（図１４ではＰＧと標記）では、顕著に緑色の発現（図１４の中の矢印）の発現確認できた。当該発現は血管新生が起きていることを示している。
　「Ｎｅｕｒｏ　ｆｉｌａｅｎｔ」に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置群に比べ、ＰＧ群処置群では、顕著に赤色の発現（図１４の中の矢印）の発現確認できた。当該発現は神経再生（軸索の形成）が起きていることを示している。
　「Ｍｅｒｇｅ」に示すように、ＰＧ群処置群において、血管新生が起きている部位と神経再生が起きている部位とが重複していることが確認された。

［実験１０：坐骨神経損傷モデルを用いた運動機能評価］
坐骨神経を損傷させたモデルマウス（坐骨神経を切断したモデルマウス）を用いて、ゲル成分（マトリゲル）とプロテオグリカンとを含むユニットの投与により、運動機能が改善されるかをＢＢＢスコアリングにより評価した。

　ＢＢＢスコアリングは、オープンフィールドテストの一つである。ＢＢＢスコアリングは、被験体（この実験１０では、以下Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置を行った当該モデルマウス、以下１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置を行った当該モデルマウス）を４０～６０ｃｍ四方程度の空間に放した際の動作を観察することで評価する、評価法である。この実験１０で行ったＢＢＢスコアリングの点数表を表１２に示す。

　実験方法を記載する。先ず、６週齢のメスの血管レポーターマウス（Ｆｌｔ１－ｔｄｓＲｅｄ　ＢＡＣトランスジェニックマウス）を２匹準備した。当該２匹のマウスの尾部の方の坐骨神経（右肢及び左肢の坐骨神経）を切断して、当該モデルマウスを作製した。
　当該１匹のモデルマウス（ｎ＝１）には当該切断した部位にＣｏｎｔｒｏｌ群処置を行った。残りの１匹のモデルマウス（ｎ＝１）には当該切断した部位に１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置を行った。

　当該処置後、直ちに当該処置したモデルマウスの部位の筋層及び皮膚を縫合した。当該縫合後、当該モデルマウスの通常の飼育を行い、ＢＢＢスコアリング（表１２に基づいての点数のカウント）を行った。当該行った結果を表１２に示す。表１１において、「２時間」は当該縫合後２時間経過の際の点数、「１日」は当該縫合後１日経過の際の点数、「８日」は当該縫合後８日経過の際の点数、「１７日」は当該縫合後８日経過の際の点数、を示す。

　表１３に示すように、Ｃｏｎｔｒｏｌ群処置群に比べ、ＰＧ群処置群では、「１７日」において、運動機能の改善（当該処置を行った後肢において、つま先で地面を勢いよく蹴る動作が常に認められ、つま先の方向は接地時も離床時も体幹と平行である）が確認できた。

［実験１１：坐骨神経損傷モデルによる血管新生能の評価］
坐骨神経を損傷させたモデルマウス（坐骨神経を切断したモデルマウス）を用いて、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングを用いて、ゲル成分（マトリゲル）とプロテオグリカンとを含むユニットなどの投与による血管の再生能を評価した。では、機器含めＩＶＩＳ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ））を用いて、当該イメージングを用いた評価を行った。

　実験方法を記載する。先ず、９週齢のメスの血管レポーターマウス（Ｆｌｔ１－ｔｄｓＲｅｄ　ＢＡＣトランスジェニックマウス）の尾部の方の坐骨神経（右肢及び左肢の坐骨神経）を切断して、当該モデルマウス（ｎ＝１）を作製した。当該モデルマウスの左側坐骨神経には１０ｍｇ／ｍＬ　ＰＧ群処置を、当該モデルマウスの右側坐骨神経にはＰＧ＋ＳＵ４３１２群処置を行った。

　ここで、以下定義する。
・ＰＧ群処置：マトリゲルにプロテオグリカン（最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬ）を入れたユニットを、当該坐骨神経（当該坐骨神経を損傷（切断）した部位）に載置した処置。
・ＰＧ＋ＳＵ４３１２群処置：マトリゲルにプロテオグリカン（最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬ）及びＳＵ４３１２（最終濃度が１０μＭ）を入れたユニットを、当該坐骨神経（当該坐骨神経を損傷（切断）した部位）に載置した処置。
・プロテオグリカン（富士フイルム和光純薬株式会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来。
・マトリゲル（コーニング、Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｎｕｍｂｅｒ：３５６２３１）：Ｃｏｒｎｉｎｇ^ＴＭマトリゲル　基底膜マトリックス　グロースファクター　リデュースト　フェノールレッドフリー。
・ＳＵ４３１２（Ｓ８５６７、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）：ＶＥＧＦ受容体の阻害剤

　当該飼育の７日目に、ＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ^ＴＭ７５０ＥＸ（パーキングエルマ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、ＮｅＶ１００１１ＥＸ）を当該モデルマウス尾静脈に注射により投与（投与量：ｄｏｓｅ　ｏｆ　２ｎｍｏｌ／１００μＬ　ｏｆ　ＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ　７５０　ＥＸ　ｐｅｒ　ｍｏｕｓｅ）を行った。当該注射による投与後の一定時間、通常の飼育を継続した。当該注射による投与後の２４時間後の当該モデルマウスのＩＶＩＳの撮影を行った。

　当該撮影した結果を図１５に示す。図１５の右側には、蛍光（図１５に記載のＥｐｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）の程度を示す。当該程度は、放射効率（図１５に記載の式、ｒａｄｉａｎｔ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）により算出した。当該程度において、黄色の方がよりマウス生体内で血管新生が起きていることを示す。ＰＧ群処置群（図１５ではＰＧと標記）に比べ、ＰＧ＋ＳＵ４３１２群処置群（図１５ではＰＧ＋ＳＵ４３１２と標記）では、黄色の発現が低かった。

　この図１５に示す群において、図１５にて四角で示す部位について、Ｔｏｔａｌ　Ｒａｄｉａｎｔ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（［ｐ／ｓ］／［μＷ／ｃｍ^２］）及びＡｖｅｒａｇｅ　Ｒａｄｉａｎｔ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（［ｐ／ｓ／ｃｍ^２／ｓｒ］／［μＷ／ｃｍ^２］）も定量した。当該定量結果を表１４に示す。表の「ＰＧ、ＰＧ＋ＳＵ４３１２」の標記は、図１５の群を示す。当該定量結果からも、ＰＧ群処置群に比べ、ＰＧ＋ＳＵ４３１２群処置群では、黄色の発現量が低いことが示された。このＰＧ＋ＳＵ４３１２群処置群の結果から、このＰＧ群に更にＶＥＧＦがあれば、更に血管新生が起きることが考えられる。

［実験１２：マウスの脳組織におけるアグリカンの発現等の確認］
　脳における血管新生の過程にて、アグリカン（プロテオグリカン）がどのように機能するかを知るために、当該発現等の確認を行った。アグリカン（Ａｇｇｒｅｃａｎ）は、軟骨組織の細胞外マトリックスに存在する主要な構造プロテオグリカンである。分子量は２，５００ｋＤａ超で、コアタンパク質に１００～１５０本のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合した構造を形成している。バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）は、広範な組織に分布する大型のプロテオグリカンで、多くのＮ－及びＯ－結合型糖鎖を持つ複雑な構造を有する。当該バーシカンのコアタンパクはヒアルロン酸結合能を有し、細胞外マトリックスの構成及び形態維持を担う。

　この実験１２の実験方法を記載する。胎齢１５．５日のマウスの脳、胎齢１７．５日のマウスの脳、１．５ヶ月齢のマウスの脳及び１４．５ヶ月齢のマウスの脳を採取した。この実験１０にて用いたマウスは、オスの血管レポーターマウス（Ｆｌｔ１－ｔｄｓＲｅｄ　ＢＡＣトランスジェニックマウス）であった。

　当該採取した脳をＰＢＳで５分ｗａｓｈした。当該ｗａｓｈ後の細胞を４％パラホルムアルデドで１時間固定した。当該固定後、５％アガロースゲル中に脳を包埋した。ビブラトームを用いて当該包理した脳を切り、１５０μｍ厚で切片を作製した。当該切片を０．３％Ｔｒｉｔｏｎと１０％Ｄｏｎｋｅｙ　ｓｅｒｕｍを含むＰＢＳ溶液で一昼夜ブロッキングした。当該ブロッキング後、切片を、所定の抗体を含む反応液（一次抗体反応液）で一昼夜一次抗体反応を行った。当該一次抗体反応後、ＰＢＳを用いて切片を洗浄して、当該洗浄後の切片を、二次抗体反応液で、一昼夜二次抗体反応を行った。当該二次抗体反応後、ＰＢＳを用いて切片を洗浄して、当該洗浄後の切片を、所定のマウント剤を用いて封入した。
　当該封入後の切片を、コンフォーカル顕微鏡（オリンパス株式会社：共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ３０００）を用い、倍率１０倍（図１６）、倍率４０倍（図１７）、倍率２０倍（図１８）で、アグリカンの発現を確認した。

　この実験１２の結果を、図１６から図１８で示す。図１７は、図１６のＥ１７．５の群の矢印の部位を４倍拡大した図である。図１６に示すように、発生期の大脳皮質において、アグリカンは血管系で、バーシカンは神経系で発現することを確認した。図１７で示すように、アグリカンは皮質板付近の毛細血管での発現が見られた。図１８で示すように、Ｍ１．５とＭ１４．５とを比較すると、Ｍ１４．５では加齢に伴いアグリカンの発現の消失が見られた。

　図１６から図１８において、以下のように標記する。
・Ｅ１５．５：胎齢１５．５日のマウスの脳の群
・Ｅ１７．５：胎齢１７．５日のマウスの脳の群
・Ｍ１．５：１．５ヶ月齢のマウスの脳の群
・Ｍ１４．５：１４．５ヶ月齢のマウスの脳の群
・アグリカン：抗アグリカン抗体によりアグリカンを免疫染色した実験群
・ＶＥＧＦＲ１－ＤＳＲｅｄ：抗ＶＥＧＦＲ１抗体によりＶＥＧＦＲ１を免疫染色して、ＤＳＲｅｄ（蛍光タンパク質）
・ＶＥＧＦＲ２－ＥＧＦＰ：抗ＶＥＧＦＲ２抗体によりＶＥＧＦＲ２を免疫染色して、ＥＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）を用いて当該染色を示した実験群
・バーシカン：抗Ｖｅｒｓｉｃａｎ抗体によりＶｅｒｓｉｃａｎを免疫染色した実験群
・ＤＡＰＩ：ＤＡＰＩ染色した実験群
・ＣＰ：皮質板（ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｐｌａｔｅ）
・ＳＰ：サブプレート（ｓｕｂｐｌａｔｅ）
・ＩＺ：中間層（ｉｎｔｅｒ　ｍｅｄｉａｔｅ　ｚｏｎｅ）
・ＳＶＺ：脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｚｏｎｅ）
・ＶＺ：脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ　ｚｏｎｅ）

　なお、この実験１２では、以下表１５で示す一次抗体反応液、以下表１６で示す二次抗体反応液、を用いた。

［実験１３：ニューロスフェア（ＮＳ）の形成数の測定と、ＮＳの観察］
　ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養される細胞が神経幹細胞であることを確認等するために、ＮＳの形成数の測定とＮＳの形態の観察を行った。

（神経幹細胞の培養の手順）
　実験１３で行った神経幹細胞の培養の手順（実験手順）を以下説明する。なお、図１９には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち２４万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、７日間培養した。７日間培養後、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）により、各投与群の６ウェルプレート中の形成された細胞塊を観察した。この観察において、形成された細胞塊のうち半径５０μｍ以上のものをニューロスフェアと定めて、このニューロスフェアの数を測定した。なお、この７日間培養後の観察の比較対象として、各投与群の培養０日の観察も所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて同様に行った。

　各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）の液体培地の組成は以下である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。
（コントロール）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし

（培地１）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０μｇ／ｍｌ

（培地２）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１００μｇ／ｍｌ

（培地３）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０００μｇ／ｍｌ

　なお、この各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７^ＴＭＰｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）　（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））

（各投与群のニューロスフェア（ＮＳ）の形成数の測定結果）
　この測定結果を図２０に示す。この図２０で示しているのは、コントロール群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）である。培地１は１１７．３１７７５３３７６０１４％であり、培地２は１３４．６７７９５０９４０２１８％であり、培地３は１４９．３０５５０８５５３６２３％である。プロテオグリカンの含有量が増加することにより、ＮＳの形成数が増加することが確認された。培地２と培地３については、コントロールと比べ、統計学的に有意にＮＳの形成数が増加することが確認された。

（ＮＳの観察結果）
　この観察結果を図２１に示す。７日間培養後の観察結果（図２１の「培養７日」）の比較対象として、培養０日（図２１の「培養０日」）の観察結果も挙げている。コントロールに比べ、培地１～３では、多くのＮＳが確認された。なお、図２１の矢印で示しているのは、一部のＮＳである。

　よって、ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することにより、より多くの神経幹細胞を増殖することが確認された。

［実験１４：デュアルルシフェラーゼアッセイ（Ｈｅｓ－１の転写活性の確認）］
　神経幹細胞の未分化性の維持とアストロサイトへの分化を制御するタンパク質（転写因子）であるＨｅｓ－１の転写活性を確認することにより、上述の神経幹細胞（ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養された細胞）が、未分化性の維持等がされているかどうかを確認した。

　このデュアルルシフェラーゼアッセイの手順を以下説明する。
　まず、神経幹細胞を準備した。なお、図２２には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％　トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞を、約６万個／１サンプルずつに分けて、以下の７つの投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）用のサンプルを作製した。

　このサンプルに、トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、Ｎｅｏｎ（登録商標）　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて、Ｈｅｓ－１ｃＤＮＡ及びレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）を遺伝子導入した。Ｈｅｓ－１ｃＤＮＡ及びレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）は、ａｄｄｇｅｎｅ社製の「ｐＨｅｓ１（２．５ｋ）－ｌｕｃ（Ｐｌａｓｍｉｄ　＃４３８０６）」を用いた。この遺伝子導入後、各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）の液体培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、１日間培養した。１日間培養後、各サンプルにルシフェラーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ、Ｎｅｏｎ^ＴＭ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）を添加して、検出システム（プロメガ株式会社、ＧｌｏＭａｘ^ＴＭ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｒｅａｄｅｒ）を用いて、各サンプルのルシフェラーゼの発現を観察した。

　このデュアルルシフェラーゼアッセイで用いた各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）の液体培地の組成は以下である。コントロールと培地１と培地２と培地３は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。なお、この培養において、コーニング社の「Ｃｏｓｔａｒ^ＴＭ　２４　ウェル」を用いた。

（コントロール）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし

（培地４）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦの含有なし
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカン　最終濃度１０００μｇ／ｍｌ

（培地５）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦの含有なし
　・プロテオグリカン　最終濃度１０００μｇ／ｍｌ

（培地６）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ１５０μｌ（最終濃度３０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし

　なお、この各投与群（コントロール、培地１、培地２、培地３、培地４、培地５、培地６）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７^ＴＭＰｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）　（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））

　各ウェルにおけるルシフェラーゼの発現量（Ｈｅｓ－１の転写活性）の観察結果を以下記載する。コントロール群の発現量を１００としたところ、培地１の群の発現量は１２３．８３、培地２の群の発現量は１３１．２４、培地３の群の発現量は１５９．５１、培地４の群の発現量は１１３．８５、培地５の群の発現量は１１９．６７、培地６の群の発現量は１３１．５５であった。ルシフェラーゼの発現量が高いほど、Ｈｅｓ－１の転写活性が高くなり、神経幹細胞の未分化性を維持している細胞と考えられる。培地６はポジティブコントロールとして神経幹細胞の未分化能を維持している細胞とするが、培地６（プロテオグリカンは含有しないがコントロールと比較してｂＦＧＦの含有量が３倍である培地）と比較して、培地１、培地２及び培地３の群（ＦＧＦ－２、ＥＧＦ及びプロテオグリカンを含有することに培養された細胞）が神経幹細胞の未分化性を維持していることが確認された。

［実験１５：ＮＳの形成数の測定］
　プロテオグリカンの代わりに、ＧＡＧを含有した培地にて、この培地で培養された細胞がＮＳの形成ができるかどうかを確認した。この実験１５において、ＧＡＧは、プロテオグリカンと異なり、コアタンパク質が結合されていない。

　この実験１５の手順を以下説明する。なお、図２３には、この実験手順の模式図を示す。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％　トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち１８万個の細胞を用いて、以下の投与群（コントロール、培地２、培地７）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、６日間培養した。６日間培養後、所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）により、各投与群の６ウェルプレート中の形成された細胞塊を観察した。この観察において、形成された細胞塊のうち半径５０μｍ以上のものをニューロスフェアと定めて、このニューロスフェアの数を測定した。なお、この６日間培養後の観察の比較対象として、各投与群の培養０日の観察も所定の位相差顕微鏡（倍率２０倍）を用いて同様に行った。

　各投与群（コントロール、培地２、培地７）の液体培地の組成は以下である。コントロールと培地２は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。
（コントロール）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・プロテオグリカンの含有なし

（培地７）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＧＡＧ　最終濃度１００μｇ／ｍｌ

　なお、この各投与群（コントロール、培地２、培地７）に含有されている成分は、以下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７^ＴＭＰｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）　（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））、なおこのプロテオグリカンから常法によりＧＡＧのみを精製し作製したものが実験３で用いたＧＡＧである。

　ＮＳの形成数の測定結果を次に記載する。コントロールの群のＮＳの形成数を１００（％）とした場合のＮＳの形成割合（％）である。培地２の群は１１８．７％であり、培地７の群は５８．８％であった。プロテオグリカンの構造（コアタンパク質とＧＡＧ構造との結合構造）により、ＮＳの形成ができることが示唆された。

［実験１６：神経幹細胞におけるプロテオグリカンの局在の確認］
　プロテオグリカン等と含有する培地にて増殖された神経幹細胞において、プロテオグリカンがどこに局在するかを確認した。

　この確認の手順を以下説明する。なお、図２４には、この実験手順の模式図を示す。
　まず、神経幹細胞を準備した。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％　トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち１８万個の細胞を用いて、以下の培地群（培地２、培地８）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地（当該培地群に記載の培地）が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、２４時間培養して、神経幹細胞を増殖させて、観察用の神経幹細胞を準備した。なお、観察で用いる神経幹細胞を回収する１時間前に、培地にヘキスト３３３４２（最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ、Ｈｏｅｃｈｓｔ^ＴＭ　３３３４２イメージングプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を添加して神経幹細胞の核と染色した。観察は、蛍光顕微鏡（オリンパス株式会社：倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ８１）を用い、倍率２０倍で当該２４時間培養後の各投与群の６ウェルプレート中の形成された細胞におけるプロテオグリカンの局在を観察した。

　この実験１６で用いた各培地群（培地２、培地８）の液体培地の組成は以下である。培地２は、上述の実験１で用いた液体培地と同じ組成である。なお、どの投与群でも、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。

（培地８）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・蛍光標識したプロテオグリカン　最終濃度１００μｇ／ｍｌ

　この各培地群（培地２、培地８）に含有されている成分については、以
下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７^ＴＭＰｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）　（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））

　培地８に含有の「蛍光標識したプロテオグリカン」については、次のように作製した。ＡＴＴＯ　４８８　ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とプロテオグリカンとを、メーカー推奨の方法（製品：ＡＴＴＯ　４８８　ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に示す方法）にて、室温で２時間反応させた。この反応の後、Ｚｅｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製を行い、蛍光標識したプロテオグリカンを回収した。この回収した蛍光標識したプロテオグリカンを、この実験４で用いた。

　観察した結果を図２５に示す。図２５では、培地２の群（培地８の群と異なり、蛍光標識していないプロテオグリカンを含有した培地）の群と、培地８の群（培地８の群と異なり、蛍光標識したプロテオグリカンを含有した培地）の群の蛍光顕微鏡での観察結果である。図７では、「Ｈｏｅｃｈｓｔ」はヘキスト染色（Ｈｏｅｃｈｓｔ^ＴＭ　３３３４２イメージングプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））により神経幹細胞の核を標識したことを示し、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＰＧ」は蛍光染色により局在しているプロテオグリカンを標識したことを示す。培地８の群において、蛍光標識されたプロテオグリカンが、神経幹細胞の細胞周囲に局在していることが確認できた。この確認結果から、神経幹細胞の培養液中に添加したプロテオグリカンは、神経幹細胞の細胞周囲に局在し、細胞周囲環境（ＰＣＭ）の構築に関わっている可能性が示唆された。

［実験１７：神経幹細胞におけるプロテオグリカンの局在の確認（コンフォーカル顕微鏡による確認）］
　プロテオグリカン等と含有する培地にて増殖された神経幹細胞において、プロテオグリカンがどこに局在するかについて、コンフォーカル顕微鏡を用いての確認も行った。

　この確認の手順を以下説明する。
　まず、神経幹細胞を準備した。日本エスエルシー株式会社製のＩＣＲマウスを用いて妊娠１４日目のメスのマウスを作製した。そして、そのマウスの体内に存在するマウス胎児を取り出し、そのマウス胎児の大脳皮質から分散した細胞を準備した。この分散では、０．０５ｗ／ｖ％トリプシン（富士フイルム和光純薬株式会社の製品（０．２５ｗ／ｖ％　トリプシン－１ｍｍｏｌ／ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）（商品コード：２０１－１６９４５、２０９－１６９４１））をＰＢＳにて希釈したもの）を用いた。この分散した細胞のうち１８万個の細胞を用いて、以下の培地群（培地９）を作製した。この細胞を、６万個／１サンプルずつ、分けて用いた。所定の液体培地が存在している６ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、ＣＡＴ＃１４０６７５）に播種する。６ウェルプレートに、１ウェルあたり、所定の液体培地（当該培地群に記載の培地）が２ｍｌ、この細胞が１万個存在するように、各ウェルに均等に播種した。この播種後、３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で、２４時間培養して、神経幹細胞を増殖させて、観察で用いる神経幹細胞を準備した。なお、観察で用いる神経幹細胞を回収する１時間前に、神経幹細胞の核を染色するためにヘキスト３３３４２（最終濃度１０　ｍｇ／ｍＬ、Ｈｏｅｃｈｓｔ^ＴＭ　３３３４２イメージングプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））及び神経幹細胞の細胞膜を染色するためにＣｅｌｌ　ｍａｓｋ（最終濃度５ｍｇ／ｍＬ、ＣｅｌｌＭａｓ^ＴＭ染色（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を添加して染色し、これを４００ｇで３分間遠心分離することで細胞を回収した後、４％パラホルムアルデドで１０分間固定した。こうして準備した細胞をＰＢＳで洗い、スライドガラス上に封入剤でマウントすることで観察資料を作製した。観察は、コンフォーカル顕微鏡（オリンパス株式会社：共焦点レーザー走査型顕微鏡ＦＶ３０００）を用い、倍率４０倍で、神経幹細胞の核、神経幹細胞の細胞膜及びプロテオグリカンの局在を比較した。

　この実験１７で用いた各培地群（培地９）の液体培地の組成は以下である。なお、基礎培地としてＤＭＥＭ／ハムＦ－１２（ナカライテスク株式会社、０８４６０－９５）を用いたが、以下では、５０ｍｌ中の各成分の組成を示す。

（培地９）
　・Ｎ２　５００μｌ
　・Ｂ２７　１ｍｌ
　・Ｈｅｐａｒｉｎ　５０μｌ（最終濃度２ｎｇ／ｍｌ）
　・抗生物質　１００μｌ
　　（最終濃度ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１０μｇ／ｍｌ）
　・ｂＦＧＦ５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・ＥＧＦ　５０μｌ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）
　・蛍光標識したプロテオグリカン　最終濃度１００μｇ／ｍｌ

　この培地９に含有されている成分については、以下のものを用いた。
　・Ｎ２：Ｎ－２　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１００Ｘ）
（ｇｉｂｃｏ：１７５０２－０４８）
　・Ｂ２７：Ｂ－２７^ＴＭＰｌｕｓ　ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔビタミンＡ不含（５０Ｘ）（ｇｉｂｃｏ：Ａ３５８２８－０１）
　・Ｈｅｐａｒｉｎ：　ヘパリンナトリウム（ナカライテスク（商品コード：１７５１３－９６、１７５１３－４１、１７５１３－５４）
　・抗生物質：ペニシリン―ストレプトマイシン（ＷＡＫＯ：１６８－２３１９１）
　・ｂＦＧＦ：ｂＦＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：１００－１８Ｂ）
　・ＥＧＦ：ＥＧＦ（ｆｕｎａｋｏｓｈｉ：３１５－０９）
　・プロテオグリカン：プロテオグリカン、サケ鼻軟骨由来（富士フイルム和光純薬会社（商品コード：１６２－２２１３１、１６８－２２１３３））

　培地９含有の「蛍光標識したプロテオグリカン」については、次のように作製した。Ａｔｔｏ　５９０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、７０４２５）とプロテオグリカンとを、メーカー推奨の方法（製品：Ａｔｔｏ　５９０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、７０４２５）に示す方法）にて、室温で２時間反応させた。この反応の後、Ｚｅｂａ　Ｓｐｉｎ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて精製を行い、蛍光標識したプロテオグリカンを回収した。この回収した蛍光標識したプロテオグリカンを、この実験５で用いた。

　観察した結果を図２６に示す。「Ｈｏｅｃｈｓｔ」はヘキスト染色により神経幹細胞の核を標識したことを示し、「Ｃｅｌｌ　ｍａｓｋ」はＣｅｌｌＭａｓｋ^ＴＭ染色により神経幹細胞の細胞膜を標識したことを示し、「ＰＧ－Ａｔｔｏ５９０」はプロテオグリカンを標識したことを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は当該核の標識と当該細胞膜の標識と当該プロテオグリカンの標識とを合わせて示す。図２６で示す確認結果により、図２５で示す結果と同じように、神経幹細胞の培養液中に添加したプロテオグリカンが神経幹細胞の細胞周囲に局在し、細胞周囲環境（ＰＣＭ）の構築に関わっている可能性が示唆された。

　以上、本発明の実施の形態（実施例も含め）について、図面も参照して説明してきたが、本発明の具体的構成は、これに限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、設計変更等があっても、本発明に含まれるものである。

Claims

　ゲル成分と、プロテオグリカンと、を含む、血管新生促進及び／又は神経再生のために用いられるユニット。
　ＶＥＧＦを含む、請求項１に記載のユニット。
　ＦＧＦ－２を含有する、請求項１又は２に記載のユニット。
　ＥＧＦを含有する、請求項１～３のいずれか１項に記載のユニット。
　血管新生促進を起こすための細胞を更に含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のユニット。
　ゲル成分の上に、ＶＥＧＦを含有する液体培地と血管新生促進を起こすための細胞とが積層される、請求項２～５のいずれか１項に記載のユニット。
　プロテオグリカンの含有量が、０．１μｇ／ｍｌ以上である、請求項１～６のいずれかに記載のユニット。
　プロテオグリカンがＶＥＧＦを含有する液体培地に含まれる、請求項２～７のいずれかに記載のユニット。
　プロテオグリカンがゲル成分に含まれる、請求項１～８のいずれかに記載のユニット。