JPS62129222A

JPS62129222A - 細胞培養組成物およびその用途

Info

Publication number: JPS62129222A
Application number: JP61203534A
Authority: JP
Inventors: ハインダ・カレン・クレインマン; ジヨージ・レイリイ・マーチン
Original assignee: US Department of Health and Human Services; US Government
Current assignee: US Department of Health and Human Services; US Government
Priority date: 1985-08-30
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1987-06-11
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: ATE66247T1; EP0218065A3; US4829000A; EP0218065A2; JPH0740932B2; CA1291432C; EP0218065B1; DE3680851D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（技術分野）この発明は基底膜錯体に係わシ、特に再結合された基底
膜誘導細胞外基層（マドＩ）？’ル（ｍｉｔｒｉｇｅｌ
））であって、加熱により重合し、試験管内および生体
内で細胞成長および分化を促進するものに関する。

（従来技術）基底膜は薄い連続的シートからなシ、基質から上皮を分
離し、神経、筋繊維、平滑筋細胞および脂肪細胞を囲ん
でいる。この基底膜はタイプ■コラーゲン、グリコプロ
ティンラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）。

エンタフチン（ｅｎｔａｅｔｉｎ）、　ニドダン（ｎｉ
ｄｏｇｅｎ）およびヘノぐラン硫酸グロテオグリカン（
ｈｅｐａｒａｎｓｕｌｆａｔｅ　ｐ１０ｔｅｏｇｌｙｃ
ａｎ）からなる。研究によると、これら物質はラミナル
シダ（ｌａｒｎｉｎａｄｅｎｓａ）およびラミナルシダ
（ｌａｍｌｎａ　１ｕｃｉｄａ）を横切る延長部内に共
分布を示す。電子顕微鏡によれば、これら成分はＳ　ｎ
ｍ巾の索からなる網状体として現われ、これらの共分布
から基底膜の形成は種々の成分の相互作用を介して生ず
ると考えられる。タイグ■コラーゲン分子は分子間ジス
ルフィド結合を形成し。

プラスミンで消化した基底膜中に見らｉする連続的網状
体と関連する（　Ｉｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃａ
１ｌ　Ｂｉｏｌ。

９７．１５２４−１５３７．１９８３）。

基底膜の各成分は相互に作用し合うことが知ら九てｂる
。精製された各成分について試験管により研究した結果
、ラミニンはその短い鎖を介して。

変性されたものでなく生のタイプ■コラーデンと結合し
、また、その長い鎖中のドメインを介してヘノ９ランス
ル７エートプロテオグリカンと結合している。これらの
基底膜成分は可溶性である。しかし、これらの巨大分子
を試験管中で相互に混合したとき、ラミニン／タイプ■
コラーダン／ヘパラン硫酸プロテオグリカンを１：１：
０．１モル比の割合で含む凝集状沈でんを生ずる（　Ｋ
ｌｅｉｎｍａｎａｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ
　　２２　、４９６９−４９７４＊１９８３）。しかし
、この沈でん物は膜構造から予想されるような弾性およ
び結持性を示さない。

基底膜のｎｌ製成分は従来、培養細胞のコーテング剤と
して使用されている（Ｔｅｒｒａｎｏｖａ　ｅｔ　ａｌ
、、ｃｅｌ１２２ニア１９：１９８０）。しかし、この
物質は可溶であって、本発明の組成物で得られるような
３次元マトリックスを形成しない。

（発明が解決すべき問題点）本発明は再結合された基底膜誘導細胞外組成物（マトリ
グル）であって、加熱により重合し、３次元マトリック
スを形成し、試験管内および生体内で細胞成長および分
化を促進する組成物を提供することを目的とする。

さらに本発明はマ）ｌＪｆルの製造法および細胞成長な
らびに分化を促進する方法を提供することを目的とする
。

さらに本発明はヒト胎盤抽出物からマトリグルを製造す
る方法を提供することを目的とする。

さらに本発明は腫細胞の転移性能を判定する方法および
転移性種細胞を分離する方法を提供することを目的とす
る。

（問題点を解決するための手段）上記問題点は６０〜８５ｊ４量チのラミニン、５〜３０
重」チのコラーダン■、１〜１０重景％のニドデン、１
〜１ｏｆｆｉｉ％のヘノ９ランスル７エートプロテオグ
リカンおよび１〜５重ｔ％エントアクチンを含む生物学
的活性重合性抽出物からなる基底膜誘導組成物を提供す
ることにより解決し得る。ここで、１生物学的活性”と
は上皮細胞を含む種々の細胞の正常な成長、分化を補助
する能力を意味する。

生理学的条件下で、タイプ■コラーｒン、ラミニン、へ
／４１’ランスルフェートソロチオグリカン、ニドダン
、エンタフチン等の成分がほぼ一定の割合で相互に反応
し、ラメラ構造のゲル、すなわち基底膜の次元と似た構
造のグルを形成することが見出され化６本明細省で記載
した条件下で、これらの成分はマトリックスの再結合の
ために必要となる。これはこのデルの全ての成分が超分
子錯体を形成し、これがマトリックス形成における中間
体となっているものと思われる。本発明でこのグルは叙
述的用語としてマトリグル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）と呼ぶ
ことにする。

この再結合マトリックス（マトリデル）は種々の細胞の
成長と分化を促進する。特に本発明の再結合基底膜グル
は培養において上皮細胞のための良好な基板となる。こ
のマド＋）’ｙ’ルは細胞接着、ノイロン、肝細胞、セ
ルトリ細胞１毛包、甲状腺細胞等の多くの細胞の成長お
よび分化を促進する。

セルトリ細胞をこのゲル中で培養し、のちに動物に戻し
たところ、精子細胞の生存および熟成が良好であった。

本発明の組成物はさらに神経再生（視神経および坐骨神
経）が生体中で促進され、組織再結合が生ずることが見
出された。ヒト胎盤から抽出されたものを用い、マドＩ
Ｊｆルを製造すると、免疫学的相互作用又は拒否がヒト
に対し使用したとき減少することが認められた。

以下１本発明の好ましい具体例について説明する。

物質タイゾ■コラーデン、ラミニンおよびヘノ母ランスルフ
ェートグロテオグリカンをＥＨ８（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔ
ｈＨｏｌｍ　−Ｓｗａｒｍ　）腫（Ｔｌｍｐｌ　ａｔ　
ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　。

２５４　：　９９３３−９９３７　；Ｈａｓａｅｌｌ　
ｅｔ　ａｌ　。

Ｐ１０ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｅをＵＳＡ　　
７７　：　４４９４−４　４　９　８　　：　　１　９
　８　０　　；　　Ｋｌｅｉｎｍａｎ、　　ｅｔ　　ａ
ｌ＋Ｂｉｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ２１　：６１８８−６１
９３：１９８２）から製造した。この肺組織をグロテア
ーゼ抑制剤を含有する３、　４　ＭＮａＣｌ　、０．０
５　Ｍ　トリス−ＨＣｌｔ　、　ｐ）１７．４中で洗浄
したのち、基底膜マトリックスを０．０５　Ｍトリス−
ＨＣｌ　、　ｐＨ７，４中で０．５　Ｍ　ＨａＣｔで抽
出した。

次に、上記Ｔｉｍｐｌ　ｅｔ　ａｌに記載された方法で
ラミニンを０．５　Ｍ　ＮａＣＬ抽出物から分離した。

ニー）７’）豆中毒症動物からの肺組織の残渣′ｊｋＯ
，０５Ｍ　）　＋７スーＨＣ１、ｐＨ７，４中の２．０
Ｍグアニソンで抽出し、さらに０．００５Ｍソチオスレ
イトールを含む同じ緩衝液で抽出し、タイゾ■コラーｒ
ンを可溶化した（　Ｋｌｅｌｎｍａｎ　ａｔ　ａｌ　）
ｏ低比重ヘパランスルフェートプロテオグリカンは上記
腫の６．０Ｍ尿素抽出ｉからイオン交換クロマトグラフ
ィを用い、塩化セシウム比重遠心分離および分子篩コラ
ムクロマトグラフィにより精製した（Ｈａｓ口１１　ｅ
ｔ　ａｌ）。なお、へ・イランはシグマケミカル社から
入手した。

基底膜マトリックスの分画されない抽出物を、塩で洗っ
た組織を等量（ｌ　ｒｎＬ／Ｉｒｎ　）の２Ｍ尿素、０
、０５　Ｍ　）リス−ＨＣｔ　、　ＰＨ＝　７．４で４
℃で一晩処理し、１０．０００Ｇで３０分間遠心分離す
ることによシ得た。この残渣を等量の緩衝液で一度洗っ
た。ついで、この抽出物および洗液を一緒にし、０、０
５　Ｍ　トリス−ＨＣ２に０．１５　Ｍ　ＮａＣ１を溶
かしたもの−＝７．４（ＴＢＳ）で透析し、遠心分離し
て不溶物質の少量を除去した。

この上澄分を少量づつ一２０℃で貯ぞうし、以下の再結
合テストに用いた。公知の定量ＥＬＩ　ＳＡ試験を用い
、この抽出物がラミニン（３，Ｓ　ｒｎ９７ｍｔ　）、
タイプ■コラーデン（０，１ｒｎｉ／ｍｌ　）およびヘ
パランスルフェートプロテオグリカン（０，１ｍｌ／ｍ
Ａ　）を含むことが見い出された。エンタフチン、ニド
ダン、その他の少量成分も含まれていることが見い出さ
れた。コラムクロマトグラフィにおいては抽出物は０．
５　Ｍ　ＮａＣ６，０，０５Ｍ　トリス−１（（Ａ、ｐ
Ｈ７，４を用い透析し、ついで遠心分離して不溶物質を
除去した。

再結合試験生理学的緩衝液に２Ｍ尿素抽出物を０，０５〜０、１　
ａｔ加えたものを遠心分離管に入れ、これを用いてダル
化をおこなりたｏ　Ｏ，ｌ　５　Ｍ　ＮａＣ２−０，０
５Ｍトリス−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，４中に溶かした精製
成分を抽出物に加え、所定の濃度で培養した。０．１５
ＭＮａＣｊ。

０、０５　Ｍ　）リス−ＨＣ１，ｐｉ−１＝７．４を用
いて最終量を０．５又は１．０　ｍｌとし、各サンプル
を３５℃で１時間培養した。不溶物質を遠心分離で分離
し、−２レフトはサンダル緩衝版に溶かし、還元条件下
で５％又は７．５係アクリルアミド中で電気泳動させた
（　Ｌａｅｒｎｍｌｌ、１９７０　、　Ｎａｔｕｖｅ　
−ロンドン、２２７：６８０−６８２）。各実験は最低
３回繰り返した。

沈でん物中のタンパク質の総量は標準Ｌｏｗｒｙ法によ
シ判定した。ニドダンおよびエンタフチンのグル中の量
はヘレナ濃度計（Ｑｕｉｃｋ　５ｃａｎ　ｌｊｌ、　Ｈ
ａｌｅｎａＬａｂ、　Ｃｏｒｐ、テキサス州、米国）を
用いダルの写真の走査によりラミニンの４０００にバン
ドに存在する物質の総量に関連するものであった。エン
タフチンおよびニドダンはＳＤＳデル中の移行、および
適当な抗体を用いたＷ＠５ｔｅｒｎプロット分析におけ
る交叉反応性（ｃ１０＠ａ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ　）
Ｋより同定された。ゲル中のタイプ■コラーケ９ンは１
４Ｇ−ラベル付キタイゾ■コラーｒンを用い、又、ヘパ
ランスルフェートプロテオグリカンは２　Ｓ−スルフェ
ートラベル付き物質（別の平行実験により比活性が予め
知られたもの）を用いそれぞれ定量した。

回転影付け（ｓｈａｄｏｗｉｎｇ　）０、５　Ｍ　ＮａＣ６ｙ　Ｏ−０５Ｍ　）リス−ＨＣｔ
、　ｐＨニア、４で平衡させた２、　０　Ｍ尿素抽出物
をセファローズ４Ｂコラム上に載せた。このコラムから
溶出させたピーク分画（０，１ｍｌｉ／ｍｌ　）の少量
（３０ｔｔｔ　）を０．１５５Ｍ酢酸アンモニウム、ｐ
Ｈ＝７．４，３ＱＱμｌおよびグリセロール６００μｌ
で希釈した。この混合物を回転影付けをおこなうためマ
イカ上にスプレィし、白金−パラジウムで影付けし、カ
ーざン塗布をおこない、Ｊ加Ｌ１００Ｃｔ子顕微鏡で検
査した。

再結合された成分の超構造（ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ）上述の如くケ゛ルをつくった。すなわち、抽出物
０、２　ｍｌ　を単独で、又はタイゾ■コラーゲンおよ
びヘノ４ランスルフエートグロテオグリカンの存在下で
３５℃で培養した。このケ゛ルを遠心分離によ部分離し
、ついで２．５４グルタアルデヒドで固定し、１　％　
０．０４で処理し、２％酢酸ウラニルでブロックスティ
ン（ｂｌｏｃｋ　５ｔａｉｎ　）をおこない、脱水した
。

このグルはついで電子写真のためｇｐｏｎ　（Ｌａｄｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、バ
ーリントン、米国。

ＶＴ：ＬＸ−１１２レシン）で処理した。薄い部分を酢
酸ウラニルおよびくえん酸鉛でスティンし。

ＪＥＯＬ　Ｉ　ＯＯＣ電子顕微鏡で検査した。ラット腎
細管基底膜の薄い部分をＬａｕｒｉｅ　ｅｔ　ａｌ（Ａ
ｍ、Ｊ、Ａｎａｔ。

１６９：　４６３−４８１　；１９８４）の方法で得た
。

細胞培養８１６Ｃ３細胞を組織培養グラスチック上で直接、又は
グルタミン、抗生物質、２０ｍＭチロシンおよび５チ胎
児ウシ血清を含むＤＭＥＭ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏの変形
イーグル培地、細胞の着色可視化のためフェノールレッ
ドを欠いたもの）およびＦ’１２培地の混合物中で１１
１１Ｉ厚の基底膜グル上で培養した。１週間後、細胞の
写真を採りた。

精製基底膜成分および基底膜の非分画抽出物を用いて基
底膜の集合体を分析した。精製したタイｆ■コラーケン
、ラミニンオヨヒヘノ９ランスルフェートグロテオグリ
カンは生理学的条件下、３５℃で１時間培養したところ
凝集状沈でんが形成された。これに対し、基底膜の尿素
抽出物を生理食塩水を用い透析し、ついで３５℃で１時
間温めたところゲルが形成された。このゲルの成分を遠
心分離により分離し、ＳＤＳ／！ａル電気泳動によシ検
査した。第１Ａ図に示すようにラミニン、エンタフチン
、ニドダンのゲル中の量はタイプ■コラーケ９ンを抽出
物中５０〜６０％になるまで添加するにつれ、それに比
例して増大した。ヘパランスルフェートプロテオグリカ
ンも基底膜成分の沈でん量の増加に寄与した（第１８図
）。

グル中の主成分のグル電気泳動による分離および定量の
結果、添加されたタイゾ■コラーｒン（第１Ａ図）又は
ヘノ９ランスルフエートグロテオグリカン（第１８図）
の存在下ではラミニン、エンタクチン、ニドデノの割合
は一定であった。タイゾ■コラーデン（１５０μｇ）お
よびヘパランスルフェートプロテオグリカン（１０３ｇ
）の双方を抽出物に添加したとき、培養物中８０％まで
のタン・ぐりａをゲル中に導入した。ラミニンのより小
さい鎖がタイグ■コラーｒンの鎖とともに共電気泳動し
、５ＤＳｒル中の可視化を妨げた。

デル中のタイプ■コラーデンの量を予測するため、３Ｈ
ラベル付きタイグ■コラーゲン（比活性が予め知られた
もの）を用い、その量に基づいてタイプ■コラーデンの
ｆｌを測定した。同様に、ヘラランスルフェートプロテ
オグリカンも可視化できないため、　　Ｓ−ラベル付き
へ７９ランスルフエートグロテオグリカンを用いた。こ
れらの実験の結果ラミニンはｒル中約６０％（２６４±
５６μｙ）を占め、タイグ■コラーｒンは３０チ（１２
７±７μｇ）’を占メ、ヘバランスルフェートグロテオ
グリカンは２％以下（８±０．７μ、ｐ）、ニドダンは
５チ、エンタフチンは１％以下であることが判明した。

これに対し、抽出物をタイプ■コラーケ９ン、フィブロ
ネクチン又はへ・９ランで補りても沈でんの増加はなく
、特定の相互作用が生じていることを示した（第１ｂ図
）。０．５　Ｍ　ＮａＣ６を用いてプロテオグリカンの
タンパク質核の培養による除去（１晩）をおこなったと
ころ、重合能が失われた。このことはプロテオグリカン
のタン／？り部分が他の成分との結合に係わることを示
すものである。

生理学的条件下ではグル化は２０分以内で完了する（第
２図）。このデル化は温度に依存し、３５℃で最大の重
合が生じる（第３図）。５０℃で相互作用がなくなるこ
とから熱的変性により重要な成分の不活性化がなされる
ことを示した。

グルの安定性について徨々の溶媒を用いてテストした。

グルは冷い水性塩では溶解せず、酸性溶液で若干溶け、
グアニジノ又は尿素溶液で完全に溶けることが認められ
た（表１）。これは各成分が比較的強い非共有結合によ
り連結テれていることを意味する。グアニジン溶解ゲル
を生理学的緩衝液を用いて透析し、タイプ■コラーｒン
の存在下で温めたところ、ゲル状構造が再形成された。

この方法は数回繰り返しても同様の割合でラミニン、ニ
ドデンおよびエンタフチンが沈でんする（各回毎にＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルを判定した。第４図）。タイ
グ■コラーゲンの存在下においては、ゲルの再形成がよ
シ急速となシ、各成分の沈でん量も増大した。

表１溶媒　　　　　　　　　　　溶解度＠）０１５Ｍ　　　
ＮｍＣｌ　　　　　　　　　　　　　　００１５Ｍ　　
ＮａＣＡ　　　　　　　　　　　　００．５Ｍ　　ＨＡ
ｅ　　　　　　　　　　　　４３１．０Ｍ尿素＋ソチオ
スレイトール　４０２．０Ｍ尿素　　　　　　　　　７
３２．０Ｍグアニノン　　　　　　　９７（注）　　０．
５ＭＨＡｃを除き、全ての溶液は０．０５Ｍトリス−Ｈ
ＣｌでｐＩ（７，４に緩衝された。

可溶性は２４℃で２０分間おこない判断した。

撹拌２０分後、溶液を遠心分離し、ベレットは再溶され
、還元剤を用いＳＤＳデル中で電気泳動させた。ベレッ
ト中の各成分の比はＳＤＳグルを走査することによって
おこなわれた。

さらに基底成分の可溶性錯体の存在についての判定をお
こなった。尿素抽出液を透析して尿素を除去し、セファ
ロース４Ｂコラム（０，５ＭＮａＣｔ。

結合性条件）ｔ″通過せたところ、主ピーク中にラミニ
ン、ニドゲン、エンタフチンが溶出した（第５Ａ、５８
図）。この主ピークの物質をブールし、同様の分子篩コ
ラム（４Ｍグアニソン、解離条件）に移したところ、こ
れらの成分はそれらの分子量から予想し得る態様で分離
された（第５Ａ図、第５Ｃ図〕。この結果から、錯体中
にラミニン、ニドｒン、エンタクチンの結合する非共有
結合の強い結合が作用していることが判明した。この物
質の回転影付は電子顕微鏡写真から可溶錯体の存在が認
められた（第５Ａ図）。この錯体は大きいプロテオグリ
カンの存在を示した。このプロテオグリカンはいくつか
のラミ＝ン分子で囲まれているためへパランスルフェー
ト側鎖がつぶれたため大きい球形をなしている。ニドダ
ンおよびエンタフチン分子ははっきシしていないが、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドｒルグル錯体中での存在が知ら
れている（第５Ｂ図）。

タイグ■コラーデンおよびへＡランスルフェートプロテ
オグリカンをともない、あるいともなわない再結合基底
膜の超構造についても検査をおこなった。これらをとも
なわない場合、ゲルは多くの広く分離した薄いフィラメ
ント状の集合体からなるものであった（第６Ａ図）。タ
イプ■コラーゲン、又ハへ７４ランスルフエートソロチ
オクリカン／タイプ■コラーデンを添加したものは相互
に連結した。あるいは合流した薄いシート状のものとな
る（第６８）。この網状物の各部分は腎細管基底膜のラ
ミナデンサのものと似た平均幅のものである（第６Ｃ図
）。しかし、生の基底膜（ラミナデンサ様層が平行に配
列してｈる。たとえばＰＹＳ　＠基底膜（Ｍａｒｔｎｓ
ｚ　−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ　９ｔ　ａｌ、Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　４７　：　２４７−２５７　、１９８
　）又はＲ＊ｉｅｈ＠ｒｔ　Ｏ膜（Ｉｎｏｙ＊　ａｔ　
ａｌ、Ｉ　Ｃａ１１．Ｂｌｏｌ、　９７：１５２４−１
５３７．１９８３））と異なり、そのラミナデンサ様構
造のものは相互に結合しているが、平行な多導層状構造
のものではない。各部分は前述の他の基底膜と同様に５
　ｎｍ中の索のものでありた。

マトリデル（再結合基底＠）は細菌学的ペトリ皿の表面
をコートするのに用いられ、ａ！々の細胞の成長１分化
の基板としてテストされ念。黒色］（Ｂ１６Ｃ３）はこ
の基底膜ゲル上で成長させたとき、組織培養表面と比較
して形態学的に川成り異なった状態水した（第７図）。

この基板上において。

細胞の早期およびより広い着色化が見られた。内皮細胞
はとのゲル上で管状構造が形成し、肝細胞はこのデル基
板上で組織培養板又はタイｆｌコラーゲン上での場合よ
シ長く生存した。生体中において、基底膜デルは末梢神
経再生を促進することが見出された（　Ｍａｄｌｓｏｎ
　ｅｔ　ａｌ　、１９８５　、　Ｅｘｐｔｌ。

Ｎｅｕ１０ｌ、、８８　：　７６７−７７２　）。

これらの研究から再結合基底膜は生物学的に活性であっ
て広範な細胞応答を誘発する。又、これは細胞接着、成
長および分化を各成分について知られているものを超え
る程度に補助、促進し得るから、このグルはこれらの分
子を特異、かつ活性的配置で含んでいる本のと思われる
。

実施例１操作は約１００１の種に基づいておこなわれ、４℃でお
こなわれた。

１、）３．４ＭＮａＣＬ　（３９７Ｎ）　　、０．０５
４νｉ　ト　リ　ス（１２，１，９）、０．００４Ｍ　
ＥＤＴＡ　（３，０ｇ）、０．００２ＭＮＥＭ　（０，
５１１）に水を加え２Ｌとし、ｐＨ＝７．４に調整され
た３、　４　ＮａＣＬ緩衝液２００　ｍｌ中に腫を均質
化する。

２、）１０．００　ＯＲＰＭで１５分遠心分離し、上澄
液を棄てる。

３、）橿残渣（−ａ、　４　Ｍ　ＮａＣＬ緩衝液中）を
均質化する。

４、）１０．００　ＯＲＰＭで１５分遠心分離し、上澄
液を棄てる。

５、）３．４　Ｍ　ＮａＣｔ緩衝液中の腫残渣を均質化
する。

６、）１０．　ＯＯＯＲＰＭで１５分遠心分離し、上澄
液を棄てる。

７、）２　Ｍ尿素（２４０！り、０．０５　Ｍ　）リス
（１２，１、ｉ？　）、０．１５ＭＮａＣｔ（１８，！
ｉ’）に水を加え２ｔにし、−７，４に調整した２Ｍ尿
素緩衝液１００　ｒｎＬ中に；厘を均質化する。

８、）４℃で１晩、撹拌する。

９、）１４．００　ＯＲＰＭで２０分間遠心分離する。

上澄液を貯える。

１０、）２Ｍ尿素緩衝液を腫残渣に加え、均質化する。

１１、）１４．　ＯＯＯＲＰＭで２０分間遠心分離し、
上澄液を貯える・１２、）ｌ起上澄液を一緒にし、トリス−食塩水（０，
０５Ｍトリス１２．１　、ｐ、　０．１５ＭＮａＣ２１
８，０，９に水を加えて２Ｌとし、ｐＨ＝７．４とした
もの）を用いて透析する。

ｌｔ用目盛付きシリンダを用い、トリス−食塩水９００
　ｍｌとクロロホルム　５　ｒｎＬ　（これは滅菌処理
）を加える。

１３、）１２時間透析する一端部のバッグを回転させる
。

１４島析をトリス−食塩水のみに変える。

１５、）トＩＪスー食塩水をさらに１度変えて透析する
。

１６、殿後の透析は培地塩、たとえばＤＭＥＭ又はＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ　−Ｖｏｇｔを用いておこなう。

１７ン寸ツクの内側を滅菌する。バッグの外側はアルコ
ールで滅菌し、止血かん子およびはさみをアルコール中
で洗い、パック中のものを滅菌容器に移す。子分けをお
こなう。コラーゲン■をこの段階で、０．１〜１　ｍｌ
／ｒｎｌの範囲で（重合したグルマトリックスの結持性
、強度をどのようにするかに準じて決定する）、液相に
加えてもよい。高い濃度のゲルはど耐久性が良好である
。

１８）直ちに冷却する。貯そうが必要なときは一２０℃
で低温保存する。グル化について：抽出物を所望の容器
に入れ、３０〜１２０分間重合のために約２４〜３５℃
で温める。３５瓢ペトリ皿については抽出物１　ｍｌ以
下を使用する。それを薄く広げる。

１９？ルを細胞培養基層として使用するため、適当な成
長媒体ａ　１０Ｌを工程（財）で得た重合グルの上に加
え、所望細胞を分散させて培地を培養する。細胞の型に
準じて成長培地を選ぶ。標準成長培地および条件は各細
胞の種類【準じてそれぞれ公知のものである。

ある細胞の種類についての他の成長促進方法は工程（１
枠の重合直前に冷い抽出液中に細胞を接腫し、分散させ
、ついで重合をおこない、工程（至）へ進む方法である
。たとえば毛包、セルトリ細胞等は重合前に分散させた
方が培養を良好におこなうことができる。これに対し、
上皮細胞、外分細葉細胞。

坐骨神経細胞、を髄ノイロン、甲状腺培養等は重合され
たグル上に培養した方が良い。

実施例２組成、生物学的活性において同等のものがＥＨＳマウス
について用いたと同様の方法によりヒト胎盤から得るこ
とができる。しかし、胎盤はＥＩＩＳマウス腫のような
純粋な基底膜からなるものでないので、以下に述べる如
く別の工程を必要とする。

（ａ）、胎盤から索および羊膜を除去する。

（ｂ）　、ついで胎盤を洗い、７ツ化フェニルメチルス
ルホニル；ｎ−エチルマレイミドＥｉＤＴＡ　、　ヘｆ
スタチン等の標準グロテアーゼ抑制剤を含む３．４ＭＮ
ａＣｔ、、０．０５　Ｍ　トリス−ＨＣｔ、ｐＨ；’７
．４からなる溶液中で均質化する。

（ｃ）、組織残渣を０．５　ＭＮａＣ！、０．０５　Ｍ
　トリス−Ｈｅ／＝、　ｐＨ：　７．４からなる液の等
ｔ　（１／ｒｒＬ　）で４℃で１晩抽出する。

（ｄ）、緩衝液で抽出したのちの組織を同一の緩衝液の
等量で洗い、これを抽出物と一緒にする。

（ａ）、組織残渣ｔ″２．０　Ｍ尿素、０．０５　Ｍ　
）リス−ＨＣ１，ｐｋ１７．４からなる液の等量（ｇ／
ｒｎＬ　）と４℃で１晩抽出する。

（ｆ）　、　　０．５　Ｍ　ＮａＣｔ抽出物と、２．０
Ｍ尿素抽出物を０．０２．Ｍりん酸ナトリウム、ｐＨ７
，４で４℃で１晩透析し、透析したサンプルを０．１５
　Ｍ　ＮａＣＬを含む０、０２　Ｍ　、ｉ５ん酸す）　
ＩＪウム緩衝液で平衡させたヘノ９リンセフアロースコ
ラムを用い別々にクロマトグラフィをおこなった。この
結合された物質を１、０　Ｍ　ＮａＣ１で溶出し、透析
し、イーグルの最少必須培地とした。

ヘパリンセファロースクロマトグラフィの前後の胎盤抽
出物をその純度について比較し友。そのために、０．５
　Ｍ　ＮａＣｔおよび２．０Ｍ尿素抽出物、およびヘパ
リンコラムからの結合物質を水を用いて透析し、親油化
し、ＳＯＳポリアクリルアミドｒルグル電気泳動させた
。これらサンプルをタン・ぐり含量についてのグロフイ
ールを測定スるためＣｏｏｍａｓｇｉａブルーで着色し
、ニトロセルロースに移したのち、抗−ラミニン抗体と
免疫反応させた。　゛その結果、基底膜の主成分である
ラミニンが、マウス基底膜製剤と同様に、ヘパリンアフ
イニティクロマトグラフイの後、そのままの状態で胎盤
抽出物中に存在することが確認された（第８図）。

胎盤ラミニンはＭｒ＝４００，０００およびＭｒ　＝２
００，０００成分の連鎖を含有していた。

この物質の生物学的活性を神経軸索突起について、ＮＧ
１０８−１５神経芽細胞ト神経膠腫混成細胞を用いてテ
ストした。これらの細胞は抽出物およびへ・母リン結合
物質に対して急速（２時間以内）に応答した。すなわち
、長い神経軸索突起の成長をおこないながら応答した（
第９図）。テストすべき物質をイーグルの最少必須培地
（血清。

その他の培地を欠くもの）に新しく解離した細胞ととも
に加えた。組織培養プラスチック上で２時間培養したの
ち、胎盤物質に露出した細胞中に拡張した形成プロセス
が認められた。すなわち、胎盤物質は神経軸索突起発達
を刺激する点において、マウス；１物質とほぼ同等の活
性を示した。

全て腫細胞を転移させるため、血液流に導入し。

ついで離れた部位で流出させ成長させる。したがって腫
細胞は内皮基底膜に対し、付着し、分解し、通過して転
移する必要がある。これらは腫細胞転移に重要なことで
ある。これらのＭ要な工程を測測定るための特異な試験
管内テスト法を考案した。

この方法は迅速で、定量的で、再現性で、非転移性と転
移性の細胞とを区別し得る。この方法はマウス再結合基
底膜を用いる。

抜孔フィルタをプライドウエルポイデン（Ｂｏｙｄｅｎ
）チャンバー内に配置した。下方室には誘引剤としてフ
ィブロブラスト培地又はラミニンを設けた。

マウス（ネズミ）基底膜抽出物５０μｌをこのフィルタ
（上部室に設けたもの）の上に置き、３７℃で重合させ
た。イーグルの最少必須培地又は他の適当な培地中の細
胞を上方ウェルに加え、チャンバー全体を３７℃で、９
５％空気、５％ＣＯ２中で５時間培養した。この間に転
移性細胞をマ）　ＩＪフックス付着させ、マトリックス
を分解させ、その中およびフィルタ孔内を通過させた。

この方法を第１０図に示す。マ）　ＩＪフックス侵入し
た細胞数はフィルタ孔の下面で定量することができた。

たとえば細胞をＤｉｆｑｕｉｃｋ　（Ｈａｖｅｌｃｏ）
で着色したのち、顕微鏡で算定する。その他、細胞を放
射能ラベル化した場合はシンチレーションカウンターで
直接測定することができる。

生体中で非転移性の細胞はマトリックスを侵入しない。

すなわち、１フィールド当り５個以下の細胞がフィルタ
、の下面に見られたにすぎない。これに対し、生体中で
転移性の細胞は高いフィールド当Ｄｌｏ個以上の細胞が
フィルタの下面に見られる。公知の転移性の細胞株（１
０以上のネズミおよびヒトａａ胞）をテストし、その結
果、＃ｌ胞の接着能１分解能および移行能（再結合基底
膜）と、転移性との間に直接的関係が存在することが見
出された（表１１）。　　　　　　１１“表■ ＮＩＨ３Ｔ３フィブロプラスト　　　　　不町　　不可
ＮＩＨ３Ｔ３　（ＲＡＳで感染）　　　　　　可　　　
　可ＮＩＨ３Ｔ３　（ＭＯＳで感染）　　　　　　　可
　　　　可ＮＩＨ３Ｔ３　　（ｓｓｖで感染）回訓Ｎｌ
ｌｌ３Ｔ３　　（Ｍ〜ｆＳＶ　テ感染）回訓Ｂ１６Ｆｌ
　　　黒色１匝　　　　　　　　　可　　　　可Ｂ１６
Ｆ１０　　　　　＃　　　　　　　　　　　　　　　町
　　　　　町Ｂ１６ＢＬ６　　　　　ｕ　　　　　　　
　　　　　　　　可　　　　　可Ｂ１６Ｂｒ２　　　１
　　　　　　　　　　　　　　　町　　　　　町に−１
７３５７Ｃｌｌ０　　　　不可　　不可に−１７３５１
１Ｃｌｌ０　　　　　　　　可　　　　　町ＭＣ−１８
０類表皮ガン　　　　　　　　可　　　　可Ａ−２０４
横絞筋肉腫　　　　　　　可　　　　可ＰＡ−１奇形種
　　　　　　　　　　可　　　　可ＰＣ−３前立線ガン
　　　　　　　　可　　　　町ＭＡＬＭｇ　３ｍ　　黒
色種　　　　　　　　可　　　　可５Ｗ６２０　　結腸
腺腫　　　　　　　　可　　　　町ＭＣＦ　−７胸部ガ
ン　　　　　　　不町　　　不可ＭＣＦ　−７胸部ガン
および　　　　　　ｏｊ’　　　　　ｉ：ｉＪエストラ
ゾオール細胞はＢｏｙｄｓｎチャンバー試験において５時間おこ
なった。フィルタの下面に５細胞／フイールド以下現わ
れたものは非転移性（不可）とし、同じく１０細胞、／
フィールド以上の細胞株は転移性（可）とした。腫瘍を
生体中で形成し得る細胞株の機能については公知である
。

転移性細胞の選択大きい転移性細胞はその接着能、分解能および移行能（
再結合基底膜に対して）に基づいて純粋な形で選択し、
得ることができる。ネズミ基底膜抽出物を組織培養皿（
０，５ｒｎｋ−径）上に置き、３７℃で３０分間重合し
た。これら細胞は滅菌状態で完全培地に成長できるよう
にして載せた。２日後、転移性細胞が付着し、分解を経
て、マ）　ＩＪフックス中移行しプラスチック皿の表面
に現われた。これを第１１図に示す。この表面の転移性
細胞を再結合基底膜ゲルを除去したのち回収した。

非転移性細胞はこの方法が適応されず、極めて稀れにマ
トリダル中又はグラスチック皿上に２日後に細胞ｆｃ認
めることができた（表ｍ）。転移性細胞はこのマトリッ
クスに対し、付着し、分解作用を示し、さらにその中を
移行し多量に培養皿表面に発現する。この選ばれた細胞
、すなわちこのマ）　ＩＪフックス通過移行した細胞１
腫瘍細胞移行試験（Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｉｎｖａｓ
ｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ　）で再テストしたところ、よ）均
質で移行密度の大きい細胞が認められた。

表■ 選択されなかった細胞Ｃｌｌ０（非転移性）　　　　　２±１Ｃ１３（低転移
性）　　　　　　６±１Ｍ２　　　　（高転移性）　　
　　　１６±１選択された細胞Ｃｌｌ０　　　　　　　　１９士１Ｍ２　　　　　　　　　　　　１９±３なお、全ての細
胞はＭ、Ｄ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ病院（Ｈｏ、ｕｓｔｏ
ｎｓテキサス州、米国）から入手した。選ばれた細胞は
親株でマドＩ））ｆｋを化学的侵蝕し、分離し、成長し
た。その移行能金再テストしたところ、よシ強い移行能
を示した。上記データはマド＋）ｌ’ル士Ｓ、Ｄ、を移
行した細胞凝集体の集を表わしている。

【図面の簡単な説明】

第１図は基底膜抽出物からの基底膜成分のグル化に対す
るタイプ■コラーｒン、ヘパランスルフェートプロテオ
グリカンおよびヘノ千ランの影響を示す図であって、抽
出物１００μｌに対し、各成分を加え、Ｏ，１５ＭＮａ
ＣＬ、０．０５　Ｍ　）リス−ＨＣＬ　ｔｐ）１７．４
中、３５℃で１時間培養したものである。各サンプルはついで遠心分離され、不溶物質はサンプル
緩衝液中に溶かし次。又、各サンプルの等１１℃５％ア
クリルアミド中で電気泳動させ念。グルの濃度測定走査
によシイレット化され友タンパク質の定量をおこなった
。仏）はグル中の化タンパク量に対するタイプ■コラー
ゲンの影響を示し、Φ）はグル中の化タンパク量に対す
るタイプ■コラーゲン、ヘパランスルフェートプロテオ
グリカン、ヘノ々ランの量的影響を示している。第２図は基底膜抽出物のグル化に対するタイプ■コラー
ゲンの添加および時間的影響を示している。条件は第１
図と同様である。タイプ■コラーｒン（５０Ｍｇ）の存
在下（・）、非存在下（○）での比較がなされている。第３図は基底膜抽出物のグル化と温度との関係金示す図
である。これは第２図の凡例通りタイグ■コラーｒン（
５０μμ）の存在下でおこなわれた。第４図はグルの溶解後の基底膜の再ゲル化能を示す図で
ある。１全抽出”と記載された最初の線は出発物質の組
成を示している。“第１のグル”はタイプ■コラーｒン
の存在下で形成されたグル中の成分金示している。タイ
プ■コラーゲンの非存在下で形成されたグル中の物質ｉ
２．０Ｍグラニシン中に２０分で溶解し、Ｏ］　５　Ｍ
ＮａＣＬ、０．０５　Ｍトリス−ＨＣｔ、　ｄ（＝　７
．４を用い透析し、タイプ■コラーゲンの存在下又は非
存在下で再グル化した（２回目のグル）。このサイクル
をさらに２回縁シ返した（第３回、第４回目のケ゛ル）
。又、グルの等量を５％アクリルアミドダル中で電気泳
動させた。第５図は２．０Ｍ尿累抽出液のセファロース４Ｂコラム
クロマトグラフイを示している。全抽出物の２ｍｔ（２
Ｍ尿素、　０．１５　Ｍ　ＮａＣ４，０，０５Ｍ　）リ
スＨＣ１，ｐＨ＝７．４＜解離性）　、　又１ｄ　Ｏ，
５Ｍ　ＮａＣ１゜０．０５Ｍ）リス−ＨＣ２，ｐＨ＝　
７．４　（結合性）に平衡させた）を相応する緩衝液で
平衡させたセファロース４Ｂコラム（２Ｘ６０ｃＩｎ）
に導入した（Ａ）。０３）は結合性のものについて、（Ｑは解離性のものに
ついてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した結果を
示す。さらに結合性条件でコラムから溶出された物質を
回転影付けにより電子顕微鏡で検査した体）。ピーク分
画の最も共通する錯体は中央のへパランスルフェートプ
ロテオグリカンと周辺のラミニン分子である。゛エンタ
フチンおよびニドダンは小分子であって見えないが存在
することが知られている。第６図は再結合グルと真正の基底膜の電子顕微鏡写真図
である。（４）はタイプ■コラーゲン又はヘパランスル
フェートプロテオグリカンの非存在下で形成されたグル
を示す。＠）はタイプ■コラーｒン、ヘノ臂うンスルフ
ェートフロテオクリカンノ存在下で形成されたグルを示
す。グルの端部が上部にある。このグルは鋼状ｔなし、
その構造は巾が生の基底膜のラミナデンサと似ている。厚さは多少変化している。（ｃ）は腎細管（１００＃ｍ
ラットからのもの）基底膜で、ラミナルシダとラミナデ
ンサとからなっている。ラミナデンサの延長部は細胞膜
に接している（矢線先端）。Ｂａｒ＝２００μｍＸ　４
７．５００　。第７図は基底膜のＢ１６Ｃ３メラニン形成の形態学およ
び分化に対する影響を示し１いる。０．１５ＭＮａＣＬ
　、　０．０５　Ｍ　）リス−ＨＣＬ　、　ｐ）ｉ＝　
７．４中のＥＨ８−腫の滅菌２Ｍ尿素抽出物をベトリ皿
表面に３７℃、３０分でグル化させ、同数の細胞をｙル
（左）上、又は対照組織培養プラスチック皿に載せた。２０ｍ１ｉチロシン、グンタミシン、グルタミンおよび
５％胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で１週間培養させた
のち、細胞の写真を取りたものであゃ、（Ａ）は細胞に
よるメラニン形成の評価および形態を示し、小）は皿を
直接見た図である。端のグルは偏向させて、細胞がそれ
に接していることを示している。第８図はヘパリンアフィニティクロマトグラフィののち
の胎盤の２．０Ｍ尿素抽出物のＣｏｏｍａｓａｉｅブル
ースナインであってラミニンの純度を示している。第９図はノイロンプロセス形成に対するヒト胎盤マトリ
グルの影響、丁なわち神経軸索突起を強く促進すること
を示している。第１０図はマトリグルを用いた腫細胞転移性テストを示
す図。第１１図はマトリグルを用いた転移性細胞選択を示す図
である。出願人代理人　弁理士　鈴・江　武　彦図面の浄書（内
容に変更なし）ケ゛ルイしに対するタイア■フラープ°ンの１１−０　
１　５　１０２５５０１００μ９タイア■フラーデ゛シ糸カ。ＦＩＧ、鎮添ｍｔ、μ９ＦＩＧ、ＩｂＬｆ′ル化量（’／、）す゛°ル化装　（’１０”）Ｗ　　　　呻　　　−−− １綜天シ理屹王由品物の４ド子曹子醋公Ａ件介Ｉ！！ｕｔ＃離条許・　　″、　　　　　ツ　　　・２、Ａ、ヘノＶリンアフィニティク０マトグ）フイかリアクリル
アミドデルＦＩＧ、８手　続　７市　、Ｌ−Ｅ　　書（方式）　　　　　７１
．・１１件の表示特願昭６１−２０３５３４号２、発明の名称細胞培養組成物およびその用途３、補正をする者 π件との関係　　特許出願人名称　アメリカ合衆国４、代理人住所　東京都千代田区霞が関３丁目７番２号　ＵＢＥビ
ルリｔ・、・　：適正な願書（代表者の氏名）、委任状およびその訳文。明細書１図面、代表者資格証明書、補正の内容（１）委任状およびその訳文並びに適正な願書は別紙の
通り（２）明細書の浄８（内容に変更なし）（３）明細
書第５３頁第２行目に於て「第１Ｕ５！Ｊは・・・」と
あるを「第１ａ図および第１ｂ図はともに・・・」と訂
正する。（４）明細書第頁第４行目ないし第１５行目に於て［（
Ａ）はゲル中の総タンパク量に対するタイプ■コラーゲ
ンの影響を示し、（Ｂ）は・・・」とあるを「このうち
第１ａ図はゲル中の総タンパク量に対するタイプ■コラ
ーゲンの影響を示した生物の形態の写真、第１ｂ図は・
・・」と訂正する。（５）明細書第５４頁第１５行目に於て「・・・を示す
図である。」とあるを　「・・・を示す生物の形態の写
真である。」と訂正する。（６）明細書第５５頁第１５行目ないし第５６頁第８行
目に於て「第５図は・・・を示している。・・・に導入
した（Ａ）、（Ｂ）は結合性のものについて、（ｃ）は
・・・を示す、ざらに・・・した（Ａ）。」とあるを「
第５Ａ図、第５Ｂ図および第５Ｃ図は・ｍ−を示してい
る。このうち、第５Ａ図は・拳・に導入した場合を示し、第
５Ａ図の下部の図は吸光度を示す線図、上部の図はその
ピーク部分における生物の形態の写真である。第５Ｂ図
は結合性のものについての生物の形態の写真、第５Ｃ図
は・や・を示す生物の形態の写真である。なお、ここに
おいて、・・・した、」と訂正する。（７）明細書第５７頁第４行目ないし第５行目に於て「
第６図は再結合ゲルと真正の基底膜の電子顕微鏡写真図
である。（Ａ）は・・・」とあるを「第６図は再結合ゲルと真正
の基底膜を電子顕微鏡で拡大した生物の形態を示す写真
である。このうち、（Ａ）は・・・」と訂正する。（８）明細書第５８頁第５行目に於て「第７図は・・・
」とあるを「第７Ａ図および第７Ｂ図は・・・」と訂正
する。（３）明細書第５９頁第１行目ないし第４行目に於て「
（Ａ）は細胞によるメラニン形成の評価および形態を示
し。（Ｂ）は皿を直接見た図である。」とあるを「このうち
第７Ａ図は細胞によるメラニン形成の評価および形態を
示した生物の形態を示す写真、第７Ｂ図は血中のものを
直接見た生物の形態を示す写真である。」と訂正する。（１０）明細書同頁第９行目に於て　「拳・・の純度を
示している。」とあるを「・・・の純度を示す生物の形
態を示す写真である。」と訂正する。（１１）明細書第頁第２行目に於て「・・・を示してい
る。」とあるを「・・・示す生物の形態を示す写真であ
る。」と訂正する。（１２）図面の浄書　（内容に変更なし）（１３）代表
者資格証明書の原木については、特願昭８０−４０９７
５号にて、昭和８０年８月３日提出のものを援用する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）６０〜８５重量％のラミニン、５〜３０重量％の
コラーゲンIV、１〜１０重量％のニドゲン、１〜１０重
量％のヘパランスルフェートプロテオグリカンおよび１
〜５重量％のエントアクチンを含む抽出物からなる細胞
培養組成物であって、加熱により重合し、細胞成長およ
び分化を促進し得るものであることを特徴とする組成物
。
（２）該抽出物はエンゲルブレス−ホルム−スワルム腫
（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）から
得られるものである特許請求の範囲第１項記載の組成物
。
（３）該抽出物がヒト胎盤から得られるものである特許
請求の範囲第１項記載の組成物。
（４）該組成物が重合の結果、三次元マトリックスを形
成するものである特許請求の範囲第３項記載の組成物。
（５）細胞成長促進は試験管内および生体内でおこなう
ことができるものである特許請求の範囲第４項記載の組
成物。
（６）該組成物が上皮細胞の成長および分化を補助し得
るものである特許請求の範囲第５項記載の組成物。
（７）該組成物が神経軸索突起の成長および分化を補助
し得るものである特許請求の範囲第５項記載の組成物。
（８）エンゲルブレス−ホルム−スワルム腫から下記方
法で得られ、細胞の成長および分化を促進し得る生物学
的活性抽出物；すなわち、４℃の温度下で、（ａ）上記腫を適当な第１の緩衝液中で多数回均質化し
、各均質工程ののち可溶分画を廃棄して不要成分を除去
する工程と；（ｂ）適当な尿素緩衝液中で残留する腫を抽出し、これ
を１６〜１８時間撹拌する工程と；（ｃ）工程（ｂ）からの抽出物を分離し、貯え、これを
工程（ｂ）を繰り返す毎におこなう工程と；（ｄ）工程
（ｃ）からの抽出物を総て一緒にして適当な滅菌緩衝液
を用いて、かつ、この緩衝液を何回も変えながら透析す
る工程と；（ｅ）得られた透析液を培養されるべき細胞に接腫する
前又は後に、該透析液を重合して、細胞培養のための基
層として利用する工程とを具備してなる方法からなるも
の。
（９）第１の緩衝液がｐＨ＝７．４の３．４ＭＮａＣｌ
緩衝液である特許請求の範囲第８項記載の抽出物。
（１０）尿素緩衝液がｐＨ＝７．４の２Ｍ尿素緩衝液で
ある特許請求の範囲第８項記載の抽出物。
（１１）滅菌緩衝液がクロロホルムを滅菌量含むイーグ
ルの最少必須培地である特許請求の範囲第８項記載の抽
出物。
（１２）透析液を２４〜３５℃で重合する特許請求の範
囲第８項記載の抽出物。
（１３）上皮細胞の成長と分化を補助し得る特許請求の
範囲第８項記載の抽出物。
（１４）神経軸索細胞の成長および分化を補助し得る特
許請求の範囲第８項記載の抽出物。
（１５）ヒト胎盤から下記方法で得られ、細胞の成長お
よび分化を促進し得る生物学的活性抽出物；すなわち、
４℃の温度下で、（ａ）上記腫を適当な第１の緩衝液中で多数回均質化し
、各均質工程ののち可溶分画を廃棄して不要成分を除去
する工程と；（ｂ）適当な尿素緩衝液中で残留する腫を抽出し、これ
を１６〜１８時間撹拌する工程と；（ｃ）工程（ｂ）からの抽出物を分離し、貯え、これを
工程（ｂ）を繰り返す毎におこなう工程と；（ｄ）工程
（ｃ）からの抽出物を総て一緒にして、これをヘパラン
アフィニティーコラムへ移し、吸着、ついで生理学的濃
度より大きい濃度の塩溶液で結合物質を溶出する工程と
；（ｅ）適当な滅菌緩衝液を用いて、かつ、この緩衝液を
何回も変えながら透析する工程と；（ｆ）得られた透析液を培養されるべき細胞に接腫する
前又は後に、該透析液を重合して、細胞培養のための基
層として利用する工程とを具備してなる方法からなるも
の。
（１６）腫細胞の転移性能を判定する方法であって、（
ａ）特許請求の範囲第１項記載の腫抽出物５０μｌない
し１００μｌを懸濁させた核孔フィルタ上に載置させて
、該抽出物を重合させる工程と；（ｂ）緩衝された媒体中で、検査されるべき腫細胞の懸
濁された単一細胞層を上記重合層上に置き、該細胞を３
７℃、５時間、上記の重合された抽出物に付着させ、か
つその中を移行させる工程と；（ｃ）核孔フィルタの反
対側表面上に移行した細胞の存在を判定する工程とから
なるもの。
（１７）移行性腫細胞を単離する方法であって、（ａ）
特許請求の範囲第１項記載の腫抽出物１〜２ｍｌを組織
培養皿上に載せ、該抽出物を重合化させる工程と；（ｂ）緩衝媒体中で、この重合された層上に懸濁腫細胞
の単一細胞層を載せる工程と；（ｃ）この培養皿を３７℃で４８時間、培養に供する工
程と；（ｄ）この培養皿から重合されたマトリックスを除去す
る工程と：（ｅ）この培養皿に付着した細胞を成長媒体中で成長さ
せる工程とを具備してなるもの。