DE10320602A1

DE10320602A1 - Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von jungen und alten lebenden Zellen

Info

Publication number: DE10320602A1
Application number: DE10320602A
Authority: DE
Inventors: Eric Perrier; Françoise Pivard; Jean-Eric Branka; Valérie ANDRE
Original assignee: Coletica SA
Current assignee: BASF Beauty Care Solutions France SAS
Priority date: 2002-11-19
Filing date: 2003-05-08
Publication date: 2004-06-09
Anticipated expiration: 2023-05-09
Also published as: KR20040044077A; DE10320602B4; KR100752986B1; NL1022659C2; JP2008022863A; GB2395489B; GB2395489A; CH694097A5; GB0303215D0; US20040096816A1; ES2255346A1; FR2847269B1; FR2847269A1; JP2004166685A

Abstract

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter. DOLLAR A Die vorliegende Erfindung betrifft im Wesentlichen ein Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von DOLLAR A (a) lebenden Zellen junger Individuen, DOLLAR A (b) lebenden Zellen alter Individuen, DOLLAR A (c) wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird, DOLLAR A dies erlaubt die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der durch Zellalterung verändert ist. DOLLAR A Die Erfindung umfasst die Verwendung dieses Verfahrens zum Screenen von Wirkstoffen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im wesentlichen ein Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Veränderung (Modifikation) von mindestens einem biologischen Parameter, umfassend die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von

(a) lebenden Zellen junger Individuen,
(b) lebenden Zellen alter Individuen,
(c) wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird,

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung von mindestens einer möglichen wirksamen Substanz, die in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der durch Alterung verändert ist, umzukehren, oder der Veränderung von mindestens einem biologischen Parameter vorzubeugen, der durch Alterung verändert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer wirksamen Substanz, ausgewählt durch dieses Verfahren, zur Herstellung mindestens einer kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Substanz, die im Bereich der Kosmetik oder der Pharmazie wirksam ist und die durch solch ein Verfahren ausgewählt wurde.
Zellen, die als junge Zellen bezeichnet werden, sind entweder Zellen, die aus Biopsien junger Spender stammen, oder Zellen, die nicht so häufig vemehrt wurden, d.h. einer niedrigen Zahl von in vitro-Passagen, oder Zellen, die aus Biopsien stammen, die keiner sehr starken Sonnenstrahlung ausgesetzt waren (Körper, Brust, Bauch, Vorhaut). Zellen, die als gealtert bezeichnet werden, sind entweder Zellen, die aus Biopsien älterer Spender stammen, oder Zellen, die einer erheblichen Zahl von in vitro-Passagen ausgesetzt waren, oder Zellen die aus Biopsien stammen, die von Bereichen stammen, die der Sonne ausgesetzt waren (Nacken, Hand, Gesicht).
Die Analyse durch verschiedene genomische und proteomische Verfahren der Zellmodelle erlaubt es, mögliche therapeutische Targets aufzuzeigen und kosmetische oder pharmazeutische Wirkstoffe auszuwählen, um die Wirkung des Alterns, die so identifiziert wurde, zu verändern. Die Wirksamkeit der kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen mit diesen Wirkstoffen kann durch diese Zellmodelle untersucht werden.
STAND DER TECHNIK:
Jede Zellfunktion, einschliesslich Zellproliferation, Differenzierung und Tod, wird durch eine Vielzahl von Genen und Zellsignalwegen kontrolliert. Die Analyse von Ergebnissen, erzielt durch in vitro-Monolayerzellkulturen, im allgemeinen von Fibroblasten oder Keratinozyten, die von gesunden oder kranken Spendern stammen, oder von Zellinien führen allerdings nicht immer zu entsprechenden Ergebnissen, wie sie in Biopsien erhalten werden.
Tatsächlich ist die Regulation der Zellproliferation und der Stoffwechselsynthesen in Monolayerzellmodellen und einer Biopsie oder einem dreidimensionalen Zellmodell, die dieser sehr nahe kommen, sehr unterschiedlich. In gleicher Weise wurden in dreidimensionalen mehrzelligen Modellen Mechanismen der intrazellulären Regulation gezeigt. Diese sind darin begründet, dass verschiedene Zellarten miteinander in Verbindung stehen oder durch die Anwesenheit von diffundierbaren Faktoren, die z.B. die Regulation der Keratinozyten durch Fibroblasten und umgekehrt (G. Saintigny, M. Bonnard, O. Damour und C. Colombel, Acta Derm. Venerol., Stockholm (1973), 73:175–180, und M. Lacroix, T. Bovy, B.V. Nusgens und C.M. Lapiere, Arch. Dermatol. Res. (1995), 287:659–664) oder die Differenzierung von dendritischen Vorläufern in T-Zellen und in Makrophagen in komplexeren Modellen von immunkompetent rekonstruierter Haut (A. Black: Structure muturation et dynamique d'un modèle de peau reconstruite humaine ("Structure muturation and dynamics of a model of human reconstructed skin"); Thesis 82/2000 UCBL1, Frankreich) erlaubt.
Weiterhin ist es nicht immer möglich, Daten zur Proteinexpression und zur Synthese bei physiologischem oder fotoinduziertem Altern zu finden, oder diese Daten scheinen manchmal widersprüchlich zu dem zu sein, was in vivo mit den in Experimenten verwendeten einfachen Modellen zu beobachten ist.
Das Aufkommen von Technologien, die ursprünglich aus der Proteom- und Genomforschung stammen, wie zweidimensionale Gelelektrophorese, Proteinarrays und DNA-Arrays, erlaubt jetzt den Nachweis einer Vielzahl von Parametern in einer sehr empfindlichen Art und Weise um entsprechend Veränderungen in der Genexpression oder Proteinsynthese von sehr kleinen biologischen Proben aufzuzeigen.
Bis heute wurden diese Technologien für verschiedene Arten von biologischen Proben verwendet, wie humanes Serum oder Kulturmedien von Monolayer-Humanzellen (R.P. Huang, R. Huang, Y. Fan und Y. Lin, Analytical Biochemistry (2001) 294:55–62) oder Monolayerkulturen von verschiedenen Zellarten, wie z.B. Fibroblasten und Melanozyten (A. Gutsmann-Conrad, A.R. Heydari, S. You und A. Richardson, Exp. Cell Res. (1998) 241(2):404–413). Entsprechend wurden auch Experimente mit Keratinozyten von Spendern verschiedenen Alters, die als Monolayer kultiviert wurden (C. Compton, T. Tong, N. Trookman, H. Zhao und D. Roy, J. Invest. Dermatol. (1994) 103(1):127–133), oder von Fibroblasten, die von Spendern verschiedenen Alters stammen, die als Monolayer kultiviert wurden (M.J. Reed, N.S. Ferara und R.B. Vernon, Mechanism of aging and development (2001) 122 (11) :1203–1220) oder von Fibroblasten, die in vitro gealtert wurden (K. Nishio, A. Inoue, H.K. Quiao, A. Mimura, Histochem. Cell Biol. (2001) 116:321–327), untersucht.
Verschiedene Untersuchungen erlaubten die modulierende Rolle von ultravioletter Reizung auf normale oder maligne humane Melanozyten (Zellinie oder Melanozyten, aus Tumorgewebe exprimiert), die als Monolayer kultiviert waren, zu studieren (C. Valery, J.J. Grob und P. Verrando, J. Invest. Dermatol. (2001) 117:1471–1482).
Parallel zu den Entwicklungen der analytischen Techniken wurden verschiedene Modelle für Epidermis ( EP-A1-0 789 074 von L'Oreal) oder für rekonstruiertes Epitel (G. Schmalz, H. Schweikl und K.A. Hiller, Eur. J. Oral Sci. (2000) 108:442–448), aber auch für rekonstruierte Mukosa oder rekonstruierte Haut oder für pigmentierte und/oder immunkompetent rekonstruierte Haut ( EP-0 296 778 von CNRS) erstellt. Diese Modelle werden heutzutage weitverbreitet für pharmakotoxikologische Untersuchungen und für Untersuchungen zur Wirksamkeit von pharmazeutischen und kosmetischen Inhaltsstoffen verwendet. Die verwendeten Analysemethoden sind allerdings im wesentlichen histologische Verfahren, die mit einer Bildanalyse kombiniert werden, sowie eine Analyse der Stoffwechselsynthesen und ihre Regulation durch elektrophoretische Western-Blot, Northern-Blot oder RT-PCR-Analyse. Die Proteinarraytechnik, die DNA-Array-Technik oder insbesondere kombinierte Bestimmungen der Cytokine wurden bei diesen Modellen bisher nicht verwendet.
ZIELE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG:
Ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Studienmodells für Zellstoffwechsel, die die in vivo-Situation von Zellen, die einer Alterung ausgesetzt sind, wiedergibt.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, umfassend die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von

Ein Teil der vorliegenden Erfindung ist die Durchführung einer Untersuchung von Genom- und Proteinprofilen bei vergleichbaren Zellmodellen.
Dieser Vergleich wird einerseits gemacht mit einem Modell, ausgewählt aus

(1) rekonstruiertem Epithel (einschliesslich rekonstruierter Epidermis), pigmentiertem und/oder immunkompetent rekonstruiertem Epithel, Bindegewebematrix (einschliesslich Chorion, einschliesslich Dermis), rekonstruierter Haut oder Mukosa, pigmentierter und/oder immunkompetent rekonstruierter Haut oder Mukosa, pigmentierter und/oder immunkompetent und/oder mit Endothel versetzter und/oder Makrophagen enthaltender rekonstruierter Haut oder Mukosamembranen, Biopsien, und andererseits:
(2) den obigen Modellen oder Zellen, die die obigen Modelle bilden, kultiviert in einem Monolayer oder in Suspension, wobei der Vergleich zwischen jungen und alten Zellen gemacht wird: – junge Zellen sind Zellen, die aus Biopsien von jungen Spendern erhalten werden oder die nicht sehr stark in vitro vermehrt werden oder die aus Biopsien gewonnen werden, die aus Bereichen des Körpers stammen, die nicht der Sonne ausgesetzt sind (Körper, Brust, Bauch, Vorhaut), – gealterte Zellen sind Zellen, die aus Biopsien von älteren Spendern stammen oder die sehr viel in vitro vermehrt wurden oder die aus Biopsien gewonnen werden, die aus Bereichen des Körpers stammen, die der Sonne ausgesetzt waren (Nacken, Gesicht, Hand).

Der proteomische oder genomische Vergleich erlaubt die Definition von Wirkungstargets, um mindestens einen biologischen Parameter, der während der Alterung verändert wird, umzukehren oder dessen Veränderung vorzubeugen, egal ob dieses Altern physiologisch bedingt ist oder fotoinduziert ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung der Verwendung der oben beschriebenen Gewebemodelle zum Zweck einer Untersuchung zur Wirkung eines Wirkstoffs, insbesondere eines kosmetischen oder pharmazeutischen Wirkstoffs, auf das genomische oder transkriptomische oder proteomische Profil.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung der Verwendung der oben beschriebenen Gewebemodelle zum Zweck der Untersuchung der Wirkung von bestimmten kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen, die einen Wirkstoff enthalten oder nicht enthalten, auf das genomische oder proteomische Profil.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
Die vorliegende Erfindung erlaubt die Lösung der oben dargestellten Probleme.
Erfindungsgemäss bedeutet "Genomstudie" das Erstellen einer Aufstellung mindestens eines Teils der Gesamtgene eines Organismus und deren Analyse, um deren Funktion zu untersuchen.
"Transkriptionstudie" bedeutet erfindungsgemäss das Erstellen einer Aufstellung mindestens eines Teils der Gesamt-RNAs, die vom Genom transkribiert wurden, und deren Untersuchung.
"Proteomstudie" bedeutet erfindungsgemäss das Erstellen einer Aufstellung mindestens eines Teils der exprimierten Proteine und deren Untersuchung.
Die Erfindung besteht im wesentlichen aus der Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von

Junge Zellen sind entweder Zellen, die aus Biopsien von jungen Spendern stammen, oder Zellen, die nicht häufig vermehrt wurden, entsprechend einer relativ geringen Zahl an in vitro-Passagen, oder Zellen, die aus Biopsien stammen, die keiner sehr starken Sonneneinstrahlung ausgesetzt waren (Körper, Brust, Bauch, Vorhaut).
Gealterte Zellen sind entweder Zellen, die aus Biopsien von älteren Spendern stammen, oder Zellen, die einer deutlichen Zahl von in vitro-Passagen unterworfen wurden, oder Zellen, die aus Biopsien von Bereichen, die der Sonne sehr stark ausgesetzt waren, stammen (Nacken, Hand, Gesicht).
Mit "Passage" ist die Vermehrung durch Trypsinierung gemeint.
Das Zellgewebemodell wird als ein Gewebemodell – auch als dreidimensionales Modell bezeichnet – definiert, das mit lebenden Zellen ausgesät werden kann, insbesondere mit dem Ziel der Rekonstruktion eines Gewebes eines Lebewesens, insbesondere ist das Gewebemodell definiert als eines, das ein Bindegewebematrixmodell sein kann; dieses wird im Fall der Haut als Dermis und im Fall der Mukosa als Chorion bezeichnet (enthaltend hautsächlich Stromazellen), ein Epithelmodell (hauptsächlich bestehend aus Epithelzellen), ein Epidermismodell (hauptsächlich bestehend aus Keratinozyten), ein Hautmodell (hauptsächlich bestehend aus einer Epidermis und einer Dermis), ein Modell einer Mukosa (bestehend aus einem Epithel und einem Chorion), einem Biopsiemodell (oder Transplantaten), das am Leben erhalten wird, genauso wie Modelle mit Monolayer oder in Suspension, die die in den oben beschriebenen Modellen vorhandenen Zellen verwenden.
In den Zellen können normale, gesunde oder pathologische Zellen verwendet werden oder Zellen, die von Zellinien stammen; diese Zellen können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein.
Gemäss einer Variante dieser letzten Eigenschaft umfasst das dreidimensionale Bindegewebematrix-Kultivierungsmodell (Dermis oder Chorion) einen mit Stromazellen ausgesäten Träger, um rekonstruierte Dermis oder rekonstruiertes Chorion zu bilden.
Die dreidimensionalen Epidermis- oder Epithelzellmodelle umfassen einen Träger, der gegebenenfalls zuvor mit Stromazellen ausgesät wurde, insbesondere Fibroblasten, und anschliessend werden diese Modelle mit Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten ausgesät, um rekonstruiertes Epithel oder Epidermis zu erhalten.
Das dreidimensionale Kultivierungsmodell von rekonstruierter Haut oder Mukosa umfasst einen Matrixträger (dermal oder von Chorion), ausgesät mit Epithelzellen, um eine rekonstruierte Mukosa zu erhalten, oder mit Keratinozyten, um eine rekonstruierte Haut zu erhalten.
Gemäss einer Variante umfasst das verwendete dreidimensionale Kultivierungsmodell ein Modell, in das mindestens eine weitere Zellart, z.B. Epithelzellen (EC) und/oder Lymphozyten und/oder Fettzellen und/oder Hautfortsätze, wie Körperhaar, Haar, Talgdrüsen, eingefügt wurde.
Pigmentzellen, immunkompetente Zellen (Langerhans-Zellen und/oder dendritische Zellen), Nervenzellen usw., können vorteilhaft zu dem epithelialen Bereich zugefügt werden.
Die verschiedenen gewonnenen Zellarten (Fibroblasten, Keratinozyten, Melanozyten usw.) werden getrennt vervielfältigt und können von verschiedenen Spendern separat oder zusammen zur Rekonstruierung der dreidimensionalen Modelle, genauso wie für die Kulturen in Monolayern oder in Suspensionen verwendet werden.
Gemäss einer Variante können die dendritischen Vorläufer (interstitielle Dendritenzellen) spontan differenzieren und mindestens zwei weitere Zellarten initiieren, nämlich Endothelzellen und Makrophagen, wenn die dendritischen Vorläufer in einer dreidimensionalen Umgebung in Epithelial- und Stromazellen kultiviert werden.
Die oben definierten Gewebemodelle werden am Ende der Kultivierung verwendet, um Genom-, Transkriptom- und Proteomanalysen durchzuführen, die insbesondere die Auswahl, Identifizierung und Charakterisierung möglicher Targets zur Umkehrung oder Vorbeugung mindestens eines biologischen Parameters, der während der Alterung verändert ist, egal ob physiologisch oder fotoinduziert, erlaubt.
Die möglichen Targets entsprechen den erfindungsgemäss identifizierten biologischen Parametern, die wieder umgekehrt werden sollen oder deren Modifikation verhindert werden soll.
Nach Definition der Targets können die gleichen Modelle und Nachweisverfahren zum Screenen von kosmetisch oder pharmazeutisch wirksamen Bestandteilen verwendet werden. Zum Nachweis der Wirksamkeit von kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen, die diese Bestandteile enthalten oder nicht enthalten, können die gleichen Modelle und Nachweisverfahren verwendet werden.
Unter den verwendeten Analysetechniken können insbesondere die folgenden genannt werden:

– zur Analyse des Proteomprofils: zweidimensionale Elektrophorese und/oder Proteinarrays und/oder Cytokin-Arrays und/oder kombinierte ELISA-Nachweise,
– zur Analyse des Genomprofils: DNA-Arrays und/oder Multiplex-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-PCR) und/oder Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-PCR),
– zur Analyse des Transkriptomprofils: RNA-Arrays, cDNA-Arrays und/oder Multiplex-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-RT-PCR) und/oder Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und/oder Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-RT-PCR).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
Gemäss einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, umfassend die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von:

Bevorzugt werden sowohl die jungen Zellen als auch die alten Zellen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet.
Bevorzugt ist der bei Alterung veränderte biologische Parameter durch mindestens einen Unterschied im Stoffwechsel der als junge Zellen bezeichneten Zellen und dem Stoffwechsel der als alte Zellen bezeichneten Zellen definiert.
Bevorzugt sind die in Schritt (a) genannten jungen Zellen entweder Zellen, die aus Biopsien von jungen Spendern mit einem Alter von weniger als 40 bis 45 Jahren stammen, oder Zellen, die nicht sehr häufig vermehrt wurden, entsprechend einer geringen Zahl an in vitro-Passagen, oder Zellen aus Biopsien, die keiner sehr starken Sonneneinstrahlung ausgesetzt waren (z.B. Körper, Brust, Bauch, Vorhaut).
Bevorzugt sind die unter Schritt (b) genannten, gealterten Zellen entweder Zellen, die aus Biopsien von älteren Spendern, d.h. mit einem Alter von bevorzugt mehr als 40 bis 45 Jahren, stammen oder Zellen, die einer grossen Zahl von in vitro-Passagen unterworfen wurden, oder Zellen, die aus Biopsien stammen, die von Bereichen entnommen wurden, die der Sonne ausgesetzt waren (z.B. Hand, Gesicht, Nacken, Hals).
Bevorzugt sind die unter Schritt (b) genannten gealterten Zellen junge Zellen, die in ein dreidimensionales Gewebemodell, umfassend ein oder mehrere Zellarten, eingebaut wurden, die künstlich durch Kultivieren über einen längeren Zeitraum, bevorzugt mehr als einen Monat, bevorzugter mehr als zwei Monate, gealtert wurden.
Bevorzugt stammen die jungen Zellen und die gealterten Zellen von mindestens einem Menschen oder von mindestens einem Tier.
Bevorzugt umfasst die Untersuchung mindestens eine Analyse, ausgewählt aus den folgenden Analyseverfahren:

Bevorzugt wird das Gewebemodell kultiviert und/oder unter solchen Bedingungen konserviert, die zumindest teilweise einen Zellstoffwechsel aufrecht erhalten.
Bevorzugt umfasst das Gewebemodell zumindest Fibroblasten oder Keratinozyten.
Bevorzugt umfasst dieses Modell normale,, gesunde oder pathologische Zellen oder Zellen, die von Zellinien stammen, bevorzugt solche Zellen, die von Menschen oder Tieren stammen.
Bevorzugt ist das Gewebemodell aus den folgenden Modellen ausgewählt: ein Modell einer Bindegewebematrixmodell, im Fall der Haut als Dermis bezeichnet und im Fall der Mukosa als Chorion bezeichnet (enthaltend hautsächlich Stromazellen), ein Epithelmodell (hauptsächlich bestehend aus Epithelzellen), ein Epidermismodell (hauptsächlich bestehend aus Keratinozyten), ein Hautmodell (hauptsächlich bestehend aus einer Epidermis und einer Dermis), ein Modell einer Mukosa (bestehend aus einem Epithel und einem Chorion).
Bevorzugt ist das Gewebemodell ein Gewebemodell einer Bindegewebematrix (Dermis oder Chorion), umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran, einer Membran oder einem Film aus Polyglykolsäure. In dieser Gruppe finden sich beispielsweise das Haut-Modell Skin^2TM, das Modell ZK1100 sowie Dermagraft^® und Transcyte^® (Advanced Tissue Sciences);
– mit Zellkultur behandelter Kunststoff (Bildung einer Haut-Folie: M. Mitchell et al., In Vivo Cell Dev. Biol.-Animal (1999) 35: 318–326),
– einem Gel oder einer Membran auf Basis von Hyaluronsäure (Hyalograft^® 3D – Fidia Advances Biopolymers) und/oder auf Kollagen- und/oder auf Fibronectin- und/oder auf Fibrinbasis; zu dieser Gruppe zählt z.B. das Haut-Modell Vitrix^® (Organogenesis);
– einer porösen Membran, die oberflächenbehandelt sein kann, hergestellt aus Kollagen, die ein oder mehrere Glycosaminoglycane und/oder gegebenenfalls Chitosan enthalten kann ( EP-A1-0 296 078 von CNRS, WO 01/911821 und WO 01/92322 von Coletica). In diese Gruppe fällt z.B. das Haut-Modell Mimederm^® (Coletica). Diese Matrixträger umfassen Stromazellen, insbesondere Fibroblasten.

Bevorzugt ist das Gewebemodell ein Epidermis-Gewebemodell oder ein Epithel-Gewebemodell, umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; hierunter fallen die rekonstruierten Epidermis- und Epithelmodelle (Skinethic^®) genauso wie die Modelle EpiDerm^®, EpiAirway^® und EpiOccular^® (Mattek Corporation);
– einem Film oder eine Membran auf Basis von Hyaluronsäure und/oder auf Kollagenbasis und/oder auf Fibronectinbasis und/oder auf Fibrinbasis; hier können insbesondere die Modelle Mimetop^® (Coletica), Laserskin^® (Fidia Advanced Polymers), Episkin^® (L'Oreal) genannt werden.

Diese Modelle werden zuvor mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, und dann mit Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten ausgesät.
Bevorzugt werden in den epithelialen Teil Epithelzellen, Pigmentzellen, immunokompetente Zellen und Nervenzellen zusätzlich zu den Epithelzellen eingefügt, bevorzugt sind die immunkompetenten Zellen Langerhans-Zellen.
Vorteilhafterweise ist das Gewebemodell ein Gewebemodell einer rekonstruierten Haut oder Mukosa, umfassend einen Haut- oder Chorionmatrixträger, bevorzugt ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; dieser inerte Träger enthält Stromazellen, insbesondere Fibroblasten;
– einem Gel auf Basis von Kollagen und/oder Hyaluronsäure und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, umfassend Stromazellen, insbesondere Fibroblasten;
– einer porösen Membran aus Kollagen, die oberflächenbehandelt sein kann und die ein oder mehrere Glycosaminglycane und/oder gegebenenfalls Chitosan enthalten kann; diese poröse Matrizes integrieren Stromazellen, insbesondere Fibroblasten;
– deepidermisierte Dermis oder tote Dermis, die menschlichen oder tierischen Ursprungs sein kann.

Hier können insbesondere die Modelle Mimeskin^® (Coletica), Apligraf^® (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems^® Biotechnologie Vertrieb) sowie Skin^2TM (ZK1200-1300-2000 – Advanced Tissue Science) genannt werden.
Weiterhin existieren Modelle, die zur Gewebetherapie vorgesehen sind, diese können auch Gegenstand dieser Studien sein. Hier können die Modelle Epidex^TM (Modex Therapeutiques), Epibase^® (Laboratoire Genevrier), Epicell^TM (Genzyme), Autoderm^TM und Transderm^TM (Innogenetics) genannt werden.
Der Matrixträger wird dann mit Epithelzellen ausgesät, um eine rekonstruierte Mukosa zu erhalten, oder mit Keratinozyten, um rekonstruierte Haut zu erhalten.
Vorteilhafterweise umfasst das verwendete Gewebemodell ein Modell, in dem mindestens eine weitere Zellart eingefügt wurde, bevorzugt Endothelzellen (EC) und/oder Immunzellen, wie Lymphozyten, Makrophagen, dendritische Zellen und/oder Fettzellen und/oder Hautfortsätze, wie Körperhaar, Haar und Talgdrüsen.
Gemäss einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eines der oben definierten Verfahren zur Durchführung eines Screenens von mindestens einer potentiell wirksamen Substanz, die mindestens einen biologischen Parameter, der, wie oben definiert, während des Alterns verändert ist, umkehren kann.
Vorteilhafterweise umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Screenens mindestens einer potentiell wirksamen Substanz, die in der Lage ist, eine Vorbeugung von oder die Umkehr der Veränderung mindestens eines biologischen Parameters, der während des oben definierten Alterns verändert wird/wurde, bereitzustellen, umfassend:

(A) In-Kontakt-Bringen dieser möglicherweise wirksamen Substanz mit den oben definierten alten Zellen, ausgesät in einem oben definierten Gewebemodell, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann;
(B) Aussäen der oben definierten jungen Zellen in ein oben definiertes Zell- oder Gewebemodell;s
(C) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse zur Durchführung einer Untersuchung zur Wirkung dieser Substanz auf den Zellstoffwechsel der gealterten Zellen;
(D) Vergleichen des Zellstoffwechsels der gealterten Zellen in Anwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz mit dem Stoffwechsel dieser Zellen oder junger Zellen in Abwesenheit dieser Substanz; und
(E) Identifizieren der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Aktivität der möglicherweise aktiven Substanz, genauer umfassend die Identifizierung einer positiven oder negativen Wirkung der Substanz, um einer Veränderung des biologischen Parameters vorzubeugen.

Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der während des Alterns verändert ist, umzukehren, umfassend:

(a) Kultivieren von jungen Zellen, bevorzugt wie oben definiert, als Referenz;
(b) Kultivieren von alten Zellen, bevorzugt wie oben definiert, mit einem veränderten biologischen Parameter im Vergleich zu den jungen Zellen, in Anwesenheit mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz über einen Zeitraum, der ausreicht, diese möglicherweise wirksame Substanz auf den Zellstoffwechsel dieser Zellen wirken zu lassen, um zum Stoffwechsel der jungen Zellen zurückzukehren;
(c) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, der alten Zellen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit einer möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden;
(d) Vergleichen der unter (b) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, von jungen lebenden Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, wie unter (a) beschrieben;
(e) nach Vergleich der in (c) und (d) durchgeführten Analysen, mögliches Identifizieren mindestens einer wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einen biologischen Parameter, der während des Alterns verändert ist, umzukehren.

Gemäss einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einer Modifikation mindestens eines biologischen Parameters, der während des Alterns verändert ist, vorzubeugen, umfassend:

(a) In-Kontakt-Bringen der möglicherweise wirksamen Substanz mit den oben definierten alten Zellen, ausgesät in einem oben definierten Gewebemodell, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann;
(b) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, der mit den Substanzen in Kontakt gebrachten alten Zellen;
(c) Vergleichen der unter (b) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie oben definiert, von lebenden Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, den sogenannten Kontrollzellen;
(d) aufgrund der vergleichenden Analyse gemäss Schritt (c), mögliches Identifizieren mindestens einer wirksamen Verbindung, die der Modifikation mindestens eines biologischen Parameters, der während des Alterns verändert ist, vorbeugt.

Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer wirksamen Substanz, ausgewählt mittels der oben definierten Verfahren, zur Herstellung mindestens einer kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Substanz, die im Bereich der Kosmetik oder Pharmazie wirksam ist und die aus den oben definierten Verfahren ausgewählt wurde.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine wirksame Substanz, die in der Lage ist, einen biologischen Parameter umzukehren, der sich aufgrund von physikalischem, chemischem oder biologischem Reiz als verändert herausstellte, und/oder das Vorbeugen der Veränderung dieses Parameters, der durch vergleichende Studien zwischen Zellmodellen unter Verwendung von sogenannten jungen Zellen und Zellmodellen unter Verwendung von sogenannten alten Zellen identifiziert wurde. Mindestens eines dieser Modelle ist ein Gewebemodell, umfassend mindestens Fibroblasten oder Keratinozyten.
Andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden erläuternden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Beispiele deutlich. Diese Beispiele werden zur besseren Darstellung aufgeführt, begrenzen aber nicht den Umfang der Erfindung. In den Beispielen sind alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen, die Temperatur ist in °C angegeben und der Druck ist atmosphärischer Druck, sofern nicht anders angegeben.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Gewinnung und Kultivierung sogenannter junger oder gealterter Zellen:
Die Zellen, die als junge Zellen bezeichnet werden, sind entweder:

– von jungen Spendern gewonnene Zellen, d.h. gewonnen aus Biopsien, erhalten durch plastische Chirurgie, bevorzugt Vorhaut oder Bauch oder Brust oder gegebenenfalls Vaginal- oder Zahnbreich, die keiner Sonne ausgesetzt waren,
– von jungen Spendern gewonnene Zellen, d.h. Spendern, die weniger als 45 Jahre als waren,
– Zellen die nur sehr wenig passagiert wurden, d.h. weniger als 10 mal für Fibroblasten, weniger als 6 mal für Melanozyten und weniger als 2 mal für Keratinozyten.

Die Zellen, die als alte Zellen bezeichnet werden, sind:

– Zellen, die aus Biopsien von älteren Spendern gewonnen wurden (z.B. von Spendern die älter als 45 Jahre waren), erhalten durch plastische Chirurgie, bevorzugt Bauch oder Brust oder eventuell Vaginal- oder Zahnbereich, die keiner Sonne ausgesetzt waren,
– Zellen, die aus Biopsien von Spendern verschiedenen Alters gewonnen wurden, erhalten durch plastische Chirurgie von Bereichen, die der Sonne ausgesetzt waren (Gesicht, Hals, Hand),
– Zellen, die in einer späten Passage verwendet wurden, d.h. grösser als 10 für Fibroblasten, grösser als 6 für Melanozyten und grösser als 2 für Keratinozyten.

Die erhaltenen Zelltypen können Fibroblasten sein, gewonnen durch Explantattechniken oder durch enzymatischen Verdau, z.B. mit Kollagenase, Keratinozyten oder Melanozyten, gewonnen nach enzymatischer dermoepidermischer Trennung, insbesondere mit Dispase oder Thermolysin oder Trypsin-EDTA.
Nach Aufreinigung werden die Fibroblasten in DMEM-Medium (Dulbecco's Modified Eagles Medium)/Ham F12 Glutamax 50/50 (V/V), versetzt mit 10 % Kälberserum, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, vermehrt. Die Fibroblasten werden durch Trypsinierung bis zu einer Konfluenz von 90 vermehrt.
Nach Aufreinigung werden die Keratinozyten in K-SFM-Medium (Keratinozyten-Serum-freies Medium – Invitrogen) mit Extrakt aus Rinderhirnanhangdrüse, versetzt mit Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, vermehrt. Die Keratinozyten werden durch Trypsinierung bis zu einer Konfluenz von 90 % vermehrt.
Nach Aufreinigung werden die Melanozyten, in MMK2-Medium (Melanocyte Medium Kit – Sigma), versetzt mit Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, Amphotericin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Geneticin mit einer Konzentration von 100 μg/ml, für 3 Tage vermehrt, um verbliebene Keratinozyten zu eliminieren. Die Kultur wird dann, mit Ausnahme des Geneticins, im gleichen Medium fortgesetzt. Die Melanozyten werden durch Trypsinierung bei einer erhaltenen Konfluenz von 90 % vermehrt.
BEISPIEL 2
Herstellung von rekonstruierter Dermis, sogenannter junger und alter rekonstruierter Dermis, und Gewinnung der RNA, der DNA oder der Proteine:
500.000 Fibroblasten, die aus einem Pool von drei jungen Spendern (weniger als 45 Jahre alt) und alten Spendern (älter als 45 Jahre) vermehrt wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden auf einem dermalen Substrat aus Kollagen, vernetzt mit Diphenylphosphorylazid, in einem DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10 % Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, für einen Zeitraum von 21 Tagen ausgesät.
Am Ende des Experiments wurde die rekonstruierte Dermis mit Hilfe eines Biopulverisators in flüssigem Stickstoff zermahlen. Das Zermahlene wurde in Tri Reagent^® (T9424 Sigma, St. Louis, USA) aufgenommen und dann mit Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C befanden sich die RNAs in der oberen Schicht, die DNAs in der unteren Schicht und die Proteine an der Grenzfläche.
BEISPIEL 3
Herstellung von rekonstruierter junger und gealterter Epidermis und Extraktion der RNA, der DNA und der Proteine:
4 × 10⁶ Keratinozyten, sogenannte junge Keratinozyten (Spender jünger als 35 Jahre) und gealterte Keratinozyten (Spender im Alter von mehr als 55 Jahren), wurden wie in Beispiel 1 bis zur Passage 1 (1. Vermehrung durch Trypsinierung) vermehrt und in Boyden-Kammereinsätze (Membrandurchlässigkeit: 0,4 μm, Durchmesser: 25 mm) ausgesät.
Diese Kammern wurden zuvor mit Nährfibroblasten-Unterschichten ausgesät, versetzt mit DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3/1 V/V)-Kulturmedium mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Kultivierungszeitraum von 3 bis 8 Tagen eingetaucht.
Die Keratinocytenkulturen wurden für 12 bis 18 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Tauchkultur, mit der Ausnahme, dass Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin nicht anwesend waren, an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht.
Am Ende des Experiments wurde die rekonstruierte Epidermis, die in den Einsätzen vorhanden war, abgekratzt, gesammelt und dann in Tri Reagent^® (Sigma) aufgenommen und mit Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C befinden sich die RNAs in der oberen Schicht, die DNAs in der unteren Schicht und die Proteine an der Grenzfläche
BEISPIEL 4
Herstellung von rekonstruiertem jungen und gealterten mukosalen Zahnfleischepithel und Extraktion der RNA, der DNA und der Proteine:
1 bis 2 × 10⁶ Epithelzellen der Zahnfleischmukosa, sogenannte junge Epithelzellen (Passage 1, 1. Amplifikation durch Trypsinierung) und gealterte Epithelzellen (Passage 4, vierte Amplifikation durch Trypsinierung), wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen, in Boyden-Kammereinsätzen ausgesät (Membranporosität: 0,4 μm, Durchmesser: 10 mm) mit DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3/1 V/V)-Kulturmedium, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Zeitraum von 3 bis 8 Tagen einer Immersionskultur unterworfen.
Die Epithelzellkulturen wurden für 12 bis 18 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit der Ausnahme, dass der Prozentsatz an Kälberserum um 10 bis 1 % erniedrigt war, in Immersion gehalten.
Am Ende des Experiments wurden die rekonstruierten Epithelien in Tri Reagent^® (Sigma) aufgenommen und mit Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugieren bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C befanden sich die RNAs in der oberen Schicht, die DNAs in der unteren Schicht und die Proteine im Grenzbereich.
BEISPIEL 5
Dreidimensionales mehrzelliges Modell rekonstruierter sogenannter junger und alter Haut und Extraktion der RNA, der DNA und der Proteine:
400.000 sogenannte junge Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von weniger als 35 Jahren) und sogenannte alte Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von mehr als 55 Jahren) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben bis zur Passage 5 vermehrt (5. Vermehrung durch Trypsinierung) und dann auf zwei dermalen Substraten, die auf oberflächenbehandelten Schwämmen basieren, ausgesät.
Kurz dargestellt, wurden die dermalen Substrate wie folgt hergestellt:

– Trocknen eines 0,75 %-igen Kollagengels bei 25°C, um einen Film zu bilden,
– Auftragen des Kollagenfilms auf 0,75 %-iges Kollagengel,
– Lyophilisieren für 24 Stunden und Vernetzen mit DPPA (50 μl/g Diphenylphosphorylazid auf Kollagen in Dimethylformamid als Lösungsmittel und dann Boratpuffer, pH 8,9)
– nach Spülen mit entmineralisiertem Wasser wurden die oberflächenbehandelten dermalen Substrate wieder lyophilisiert.

Das zur Kultivierung der Fibroblasten verwendete Medium ist ein DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und mit Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml. Zum Erhalt rekonstruierter Dermis wird eine Kultivierungszeit von 14 Tagen benötigt.
Anschliessend wurden 400.000 sogenannte junge Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von weniger als 35 Jahren) und sogenannte alte Fibroblasten (Pool von 3 Spendern mit einem Alter von mehr als 55 Jahren), die wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und bis zur Passage 2 (2. Vermehrung durch Trypsinierung) vermehrt wurden, auf äquivalente dermale Oberflächen auf der Filmseite in einem DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3/1 V/V)-Kulturmedium ausgesät, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Zeitraum von 7 Tagen einer Immersionskultur unterworfen.
Die Kulturen wurden für weitere 14 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit der Ausnahme, dass Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin nicht anwesend waren, an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht.
Am Ende des Experiments wurde die rekonstruierte Haut in Tri Reagent^® (Sigma) aufgenommen, in flüssigem Stickstoff mit Hilfe eines Biopulverisators vermahlen und dann mit Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugieren bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C befanden sich die RNAs in der oberen Schicht, die DNAs in der unteren Schicht und die Proteine im Grenzbereich.
BEISPIEL 6
Dreidimensionales mehrzelliges Modell von sogenannter junger und alter rekonstruierter Haut, enthaltend Populationen von Langerhans-Zellen, interstitiellen dendritischen Zellen, Makrophagen und Endothelzellen, und anschliessende Extraktion der RNA, der DNA und der Proteine:

– Generierung von nicht-differenzierten und unreifen dendritischen Zellen, die in der Lage sind, sich selbst zu entwickeln, bevorzugt zur Differenzierung in Langerhans-Zellen:

Peripheres zirkulierendes Blut wurde als venöse Blutprobe von ein oder mehreren humanen Spendern in Vacutainern, ausgerüstet mit den üblichen Antigerinnungsmitteln, wie Lithiumheparin, gesammelt.
Die Trennung der Monozyten (CD14⁺) aus diesem zirkulierenden Blut kann gemäss dem Protokoll von Geissmann et al., J. Exp. Med., Bd. 187, Nr. 6, 16. März 1998, Seiten 961–966, veröffentlicht von The Rockefeller University Press, vorteilhaft auf folgende Art und Weise durchgeführt werden:

– Nach Zentrifugieren auf einem Ficoll^®-Gradienten (Natriumdiatrizoat/Polysaccharose-Dichte: 1.077; Lymphoprep Abcys 1053980), wurden die mononuklearen Zellen des zirkulierenden Blutes gewonnen und indirekt mit einem Antikörpercocktail (im wesentlichen Anti-CD3, Anti-CD7 und Anti-CD19, Anti-CD45RA, Anti-CD56, Anti-IgE), gekoppelt mit magnetischen Kügelchen, markiert.
– Nach der Passage durch eine magnetische Säule wurden nur nicht-magnetisch-markierte Monozyten eluiert.

Die CD14⁺-Monozyten können aus dem Eluat gemäss irgendeinem physikalischen Trennungsverfahren, wie sie dem Fachmann bekannt sind, z.B. durch Sedimentation oder Zentrifugieren, gewonnen werden, und können so für die anschliessenden Kulturen benützt werden.
Die CD14⁺-Monozyten werden dann in einem Verhältnis von etwa 1 Million pro Milliliter in einem RPI 1640-Kulturmedium (Rosewell Park Memorial Institute), versetzt mit 10 % Kälberserum, das frei von Zusätzen ist und anfänglich zwei Cytokine enthält, nämlich das Cytokin GM-CSF in einem Verhältnis von 400 IU/ml und das Cytokin TGFβl in einem Verhältnis von 10 ng/ml, kultiviert.
Die Kultivierung wird bei 37°C in feuchter Atmosphäre, enthaltend 5 % CO₂, durchgeführt.
Das Kulturmedium ist anfänglich mit einem dritten Cytokin, nämlich Cytokin IL-13 in einem Verhältnis von 10 ng/ml, versetzt. Nach maximal 2-tägiger Kultivierung wurde das gleiche Kulturmedium ohne IL-13 bis zum 6. Tag der Kultur zugegeben. Am 6. Tag der Kultivierung wurden nicht-differenzierte unreife dendritische Zellen generiert, die in der Lage sind, sich selbst zu verändern, bevorzugt zur Differenzierung in Langerhans-Zellen:

– etwa 60 bis 80 % der in vitro generierten dendritischen Zellen exprimieren intrazellulär Langerin sowie CCR6, dem spezifischen Rezeptor für MIP-3α,
– die in vitro generierten dendritischen Zellen sind stark chemotaktisch gegenüber MIP-3α, was die Funktionalität des CCR6-Rezeptors zeigt,
– die in vitro generierten dendritischen Zellen sind unreif, da sie die Marker der Reifung, nämlich CD83, DC-LAMP und CCR7, nicht exprimieren.
– Das dreidimensionale Modell wurde dann gemäss dem folgenden Protokoll hergestellt:

2 × 10⁵ Fibroblasten wurden von der dritten bis zur zehnten Passage (10 Vermehrungen nach Trypsinierung) wie in Beispiel 1 beschrieben vermehrt und dann auf dem dermalen Substrat, basierend auf Kollagen-Glycosaminglycan-Chitosan, in einem DMEM-Glutamax-Kulturmedium, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, mit Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml für 21 Tage ausgesät. Die Kultivierung wurde für 1 Woche in dem oben beschriebenen Medium ohne EGF fortgesetzt.
Anschliessend wurden 2 × 10⁵ Keratinozyten von Passage 0 bis zur Passage 2 (2. Vermehrung nach Trypsinierung) gemäss Beispiel 1 vermehrt und 1 bis 3 × 10⁵ undifferenzierte in vitro generierte dendritische Zellen auf die dermalen Äquivalente in einem DMEM-Glutamax/Ham F-12-Kulturmedium (Verhältnis 3/1 V/V) ausgesät, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Zeitraum von 7 Tagen einer Immersionskultur unterworfen.
Anschliessend wurde die Kultur an die Luft-Flüssig-Grenze verbracht und dort für 21 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit Ausnahme von Kälberserum, Hydrokortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin, kultiviert.
Unter diesen Bedingungen befinden sich die Langerhans-Zellen in der Epidermis und die interstitiellen dendritischen Zellen, die Macrophagen und die Endothelzellen in der Dermis.
Am Ende des Experiments wurde die immunkompetent rekonstruierte Haut in Tri Reagent^® (Sigma) aufgenommen, in flüssigem Stickstoff mit Hilfe eines Biopulverisators zermahlen und dann mit Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugieren bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C befanden sich die RNAs in der oberen Schicht, die DNAs in der unteren Schicht und die Proteine im Grenzbereich.
BEISPIEL 7
Aufreinigung der RNA, der DNA und der Proteine aus den oben beschriebenen Zellmodellen:
Die RNAs wurden in einer Menge von 1 μg/μl nach Präzipitation mit 2-Propanol in Wasser gelöst, 15 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert, der Rest mit 80 % Ethanol gewaschen, getrocknet, mit DNAase behandelt (AMBION) und die Absorption bei 260/280 nm gemessen.
Die DNAs wurden durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 Minuten bei 4°C nach Entfernen der oberen Schicht, enthaltend die RNAs, mit Ethanol präzipitiert. Der Überstand wurde aufbewahrt. Dieser enthält die Proteinfraktion. Der Rest, enthaltend die DNA, wurde durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 5 Minuten bei 4°C mit 0,1 M Citratpufer, 10 % Ethanol und 75 % Ethanol gewaschen und anschliessend für 5 bis 10 Minuten im Vakuum getrocknet und schliesslich in 8 mM Natriumhydroxid gelöst. Es folgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g, um Unlösliches zu entfernen, und die Lösung wurde auf eine Konzentration an DNA von 0,3 μg/μl nach Auslesen der Absorption bei 260 nm eingestellt.
Die in dem ethanolischen Extrakt enthaltenen Proteine (Überstand) wurden mit Isopropanol nach Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4°C präzipitiert, dreimal mit 0,3 mol Guanidin·HCl in 95 % Ethanol gewaschen und jeweils bei 7.500 × g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Rest wurde dann unter Vakuum für 5 bis 10 Minuten getrocknet und in 1 % SDS gelöst.
BEISPIEL 8
Untersuchung der Wirksamkeit eines Antialterungskomplexes auf junge und gealterte rekonstruierte Haut:
Rekonstruierte Haut wurde gemäss Beispiel 5 hergestellt. Ein Antialterungskomplex aus drei wirksamen Bestandteilen, einschliesslich Basalin^® (modifiziertes Malzprotein, Coletica, Lyon), das die Rekonstruktion der Basalmembran stimuliert, wurden zu dem Immersionskulturmedium in einer Konzentration von 2,25 % und für einen Zeitraum von 14 Tagen hinzugegeben oder nicht zugegeben (nicht behandelte Kontrolle).
Immunhistochemische Studien:
Nach 14-tägiger Kultivierung wurden die Kontrollrekonstruierte Haut und die behandelte rekonstruierte Haut in flüssigem Stickstoff eingefroren und Cryoschnitte wurden mit Hilfe eines Kryotoms (Cryostat, Microm 500 M) hergestellt.
Das Vorkommen von Gesamtlaminin, von 5-Laminin, von Kollagen IV und von Kollagen VII wurde mittels immunhistochemischer Techniken bestimmt. Für die Laminine war es NCL-LAMININ, für Kollagen IV NCL-COLL-IV und für Kollagen VII NCL-COLL-VII. Der für 5-Laminin verwendete Antikörper war Kalinin/Laminin (33. Alle diese Antikörper waren an Diaminobenzidin (DAB) als Nachweismittel gebunden.
Alle notwendigen Schritte zum Nachweis der untersuchten Moleküle (Antikörper-Molekülbindung, Waschen, Nachweis) wurden mit Hilfe eines Immunhistochemie-Roboters (Nexes, Ventana) durchgeführt.
Aufnahmen der Schnitte von rekonstruierter Haut wurden für jeden Antikörper mit Hilfe eines Axiophot-Mikroskops (Zeiss) (40-fache Vergrösserung) gemacht und erlauben den Nachweis einer organisierten Basalmembran guter Qualität.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass das Modell für eine rekonstruierte Haut alle Marker der Untersuchung aufzeigen: für Gesamtlaminin, Laminin 5, Typ IV-Kollagen und Typ VII-Kollagen. Die Markierung ist im Fall von mit dem Antialterungskomplex behandelter, rekonstruierter Haut intensiver.
Die histologische Analyse erlaubt allerdings nicht das Aufzeigen eines wirklichen Unterschieds zwischen der jungen Haut und der alten Haut.
Dot-Blot-Experimente:
In einem ersten Schritt wurden die Kollagene aus den Hautrekonstruktionen nach Verdau mit Pepsin (20 mg/g Trockenprobe) in 0,5 N Essigsäuremedium für 48 Stunden bei 4°C extrahiert.
Nach Zentrifugation für 30 Minuten bei 15.000 × g wurde das Typ I-Kollagen durch Präzipitation in 0,7 M NaCl für 2 Stunden bei 4°C und Zentrifugation bei 13.000 U/min entfernt.
Das Typ IV-Kollagen im Überstand wurde mit 1,2 M NaCl über Nacht bei 4°C präzipitiert und dann durch Zentrifugation bei 13.000 U/min gesammelt.
Das Typ VII-Kollagen im Überstand wurde mit einer TCA/Aceton/DTT-Mischung (Biorad) für 2 Stunden bei 4°C und 45 Minuten bei –20°C präzipitiert, durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 13.000 U/min gesammelt und anschliessend in DTT/Aceton durch Zentrifugation gewaschen.
Die Proben mit den verschiedenen Arten an Kollagen wurden mit TBS-Puffer aufgenommen und dann auf Nitrocellulosemembranen gebracht. Nach Sättigung mit TBS- Puffer, enthaltend 3 % Rinderserumalbumin, für 30 Minuten wurde die Membran in TBS-Puffer gewaschen und dann für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur und unter Rühren der Lösung mit dem primären Antikörper inkubiert. Nach Waschen in TBS-Puffer mit 0,05 % Tween^® 20 (ICI) wurde die Membran mit dem sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur und unter Schütteln inkubiert. Das Signal wurde dann unter Verwendung des Amplification and Tracing Kit Opti-4CN-Substratkits (Biorad) gemäss den Anweisungen des Herstellers verstärkt. Die Quantifizierung der Banden durch Bildanalyse erlaubt nicht den Nachweis einer signifikanten Wirkung des Antialterungswirkstoffs auf die Synthese von Kollagen IV und VII (Problem der Empfindlichkeit).
Quantitative Echtzeit-PCR-Versuche:
Die Quantifizierung der mRNAs, codierend für Actin, Kollagen IV und Kollagen VII, für die rekonstruierten Modelle wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR-Technik bestimmt. Dafür wurden Primer, die die Vermehrung der spezifischen Fragmente von Kollagen IV (231 Basenpaare) und VII (763 Basenpaare) ermöglichen, und Primer für Actinsequenzen (541 Basenpaare) verwendet.
Die Extraktion der RNAs aus den behandelten und nicht-behandelten rekonstruierten Häuten wurde gemäss dem Protokoll von Beispiel 7 durchgeführt.
Die RT-PCR-Reaktion (reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion) wurde mittels Echtzeit-RT-PCR mit Hilfe des Opticon-Systems (MJ Research) durchgeführt.
Die in die Vertiefung eingebrachte Reaktionsmischung (50 μl) für jede Probe war wie folgt:

– 10 μl RNA mit einer Konzentration von 5 ng/μl,.
– es wurden Primer mit verschiedenen Markern verwendet,
– Reaktionsmischung: Qiagen – 25 μl 2 × QuantiTect SYBR Green RT-PCR-Mastermix, enthaltend 5 mM MgCl₂ + 0,5 μl QuantiTect RT-Mix (der Marker SYBR Green I wechselwirkt mit Doppelstrang-DNA während des Verlängerungsschrittes)

Die RT-PCR-Bedingungen sind wie folgt:

– Reverse Transkription: 30 Minuten bei 50°C,
– PCR-Reaktion: 15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 56°C und 30 Sekunden bei 72°C, 50 Zyklen

Die Abwesenheit einer Kontamination und die Reinheit der amplifizierten Produkte wurden durch die Schmelzkurven der amplifizierten PCR-Produkte verifiziert. Die Produkte mit einem Doppelpeak oder einem abnormalen Schmelzpunkt wurden eliminiert.
Analyse und Berechnungsverfahren:
Die Aufnahme der Fluoreszenz in amplifizierter DNA wurde kontinuierlich während der PCR-Zyklen untersucht. Dieses System erlaubt es, Fluoreszenz-Messkurven als Funktion der Anzahl an PCR-Zyklen zu erhalten und somit die relative Menge der amplifizierten DNA zu bestimmen.
Um die vorhandene Zellpopulation in der rekonstruierten Haut zu berücksichtigen, wurden alle Ergebnisse auf das Signal des Actins, das als "Hauskeeping"-Gen verwendet wurde, bezogen.
Gemäss den Experimenten wurde der Grenzwert der Messung des C(T) (= Zyklusgrenzwert) für T auf zwischen 0,05 und 0,01 bestimmt, und anschliessend wurden entsprechende Messeinheiten für jedes Gen gemäss der folgenden Formel berechnet: Sgene <<x>> = 107 × (1/2)C(T)gene<<x>> C(T)gene<<x>> bezeichnet die C(T)-Messwertgrenze (Zyklusgrenzwert) des Gens <<x>>
Die Werte der Gene wurden auf das Signal von Actin durch die folgende Berechnung des Verhältnisses rückbezogen:
R = Sgene<<x>>/Sactin
Die Verhältnisse wurden zwischen den behandelten und den unbehandelten Proben verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass der Antialterungskomplex die Expression der mRNAs, codierend für Typ IV-Kollagen (+ 65 % p < 0,05) und Typ VII-Kollagen (+ 63 % p < 0,05), in dem gealterten rekonstruierten Hautmodell signifikant erhöht.
BEISPIEL 9
Analyse von Monolayern, rekonstruierter junger und alter Dermis und Hautmodelle mittels DNA-Array:
Derselbe Stamm an Zellen und die gleiche Passage wurden verwendet, um die drei Zellmodelle herzustellen.

– Fibroblasten (Pool von drei Spendern im Alter von weniger als 35 Jahren und mehr als 55 Jahren) wurden wie in Beispiel 1 gewonnen und zur Konfluenz in Monolayer in DMEM/Ham F-12-Glutamax 50/50 V/V-Medium, versetzt mit 10 % Kälberserum, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, kultiviert. Diese wurden dann in Tri Reagent^® (Sigma) gesammelt.
– Die als junge und alte rekonstruierte Dermis bezeichnete rekonstruierte Dermis wurde hergestellt durch aussäen von 400.000 Fibroblasten, die aus einem Pool von mindestens drei Spendern im Alter von weniger als 35 Jahren und mehr als 55 Jahren stammen, die gemäss Protokoll von Beispiel 1 gewonnen, voneinander getrennt und amplifiziert wurden, auf oberflächenbehandelten Kollagenmatrizes, die mit Diphenylphosphorylazid vernetzt waren. Die rekonstruierte Dermis wurde 15 Tage in DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10% Kälberserum, Ascorbinsäure mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml ausgesät. Die rekonstruierte Dermis wurde in Tri Reagent^® (Sigma) gesammelt.
– Die rekonstruierte Haut, die als junge und gealterte rekonstruierte Haut bezeichnet wird, wurde hergestellt durch aussäen von 400.000 Fibroblasten, die aus einem Pool von mindestens drei Spendern im Alter von weniger als 35 Jahren und mehr als 55 Jahren stammen die gemäss Protokoll von Beispiel 1 gewonnen, voneinander getrennt und vermehrt wurden, auf oberflächenbehandelten Kollagenmatrizes, die mit Diphenylphosphorylazid vernetzt waren. Die so hergestellte rekonstruierte Dermis wurde für 15 Tage in DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10 Kälberserum, Ascorbinsäure mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, kultiviert. Die Keratinozyten wurden in einem Verhältnis von 400.000 pro rekonstruierter Dermis ausgesät, diese stammen aus dem gleichen Pool von Spendern und wurden gewonnen und getrennt voneinander vermehrt, gemäss dem Protokoll, beschrieben in Beispiel 1. Die Kultur wurde für 1 Woche in Proliferationsmedium, hergestellt aus DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3:1 V/V), versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isoprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml fortgesetzt. Die rekonstruierten Häute wurden dann herausgenommen und für weitere 2 Wochen in dem gleichen Medium mit Ausnahme von Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin, kultiviert. Die rekonstruierten Häute wurden in Tri Reagent^® (Sigma) gesammelt.

cDNA-Array:

– Kurz zusammengefasst wurden die RNAs der Proben gewonnen (nach Vermahlen in Flüssigstickstoff mit Hilfe eines Biopolymerisators für die dreidimensionalen Modelle) und gemäss den Herstellerprotokollen des Tri Reagent^® (gesamte Entfernung der DNA) aufgereinigt.
– Die auf gereinigten RNAs wurden qualitativ und quantitativ analysiert.
– Als nächstes folge die Aufreinigung der gepoolten Messenger-RNAs (mRNAs) durch Hybridisierung der Poly(A)-Enden der mRNAs mit biotinylierten Oligo(dT)-Primern und selektives Einfangen durch Streptavidinkügelchen gemäss Protokoll von Atlas Pure (Clontech). Die DNA-Proben, die mehrfach mit ³³P markiert waren, wurden durch reverse Transkription der an Poly(dT)-Kügelchen gebundenen mRNAs mit Hilfe eines Primerpools, spezifisch zu den Sequenzen der immobilisierten Arrays, in Anwesenheit von [α³³]-dATP hergestellt. Die markierten Sonden wurden dann durch Ausschluss-Säulenchromatografie aufgereinigt und die Qualität und Menge der markierten Proben wurden durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.
– Die kommerziellen Atlas-Membranen wurden vorbehandelt und dann wurden die an jede Membran immobilisierten cDNAs mit den entsprechenden markierten Sonden (68°C, über Nacht) hybridisiert; die Filter wurden vor Durchführung der Analyse gewaschen.
– Die Analyse erfolgte mittels Autoradiografie und die Quantifizierung der Radioaktivität des Spots wurde mit Hilfe des Phosphorimagercyclone (Packard Instrument; 3-stündige und dann 72-stündige Aufnahme) und QuantArray-Software von Packard durchgeführt.
– Die Identifizierung der interessierenden Gene unter den verschiedenen experimentellen Bedingungen geschah wie folgt: Junge Spender gegenüber älteren Spendern. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der Veränderung zwischen den älteren und jüngeren Modellen, bei Monolayer, einzellig dreidimensional und mehrzellig dreidimensional dargestellt.

Beim Vergleich der Proteine der extrazellulären Matrix ist aus dem Beispiel zu erkennen, dass die Menge an RNA, codierend für den Vorläufer von Fibronectin, in den Monolayern (× 2,1) und der als gealterte rekonstruierte Dermis bezeichneten Dermis (× 1,8) im Vergleich zu den jungen Modellen erhöht war. Im Gegensatz dazu war die Menge an RNA in dem gealterten rekonstruierten Hautmodell (1,75) im Vergleich zu junger rekonstruierter Haut deutlich erniedrigt. Die erhaltenen Ergebnisse in dem rekonstruierten Hautmodell bestätigen die erhaltenen Ergebnisse durch immunhistochemische Analysen der Hautproben von Spendern verschiedenen Alters. Die erhaltenen Ergebnisse mit den Monolayern, die eine Erhöhung der RNAs für die Vorläufer des Fibronectins zeigen, sind in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Studien, erhalten durch Analyse der mRNAs, die ebenfalls eine Zunahme der Messenger-RNA in Abhängigkeit vom Alter des Spenders, aber auch von der Zahl der Passagen der kultivierten Fibroblasten in Monolayern zeigt. Diese Ergebnisse zeigen die Tatsache, dass Ergebnisse vom verwendeten Zellmodell abhängig sein können und dass die Monolayermodelle oder die unizellulären dreidimensionalen Modelle nicht zur Vorhersage verwendet werden können, da sie nicht die Interaktion zwischen den verschiedenen Zellarten berücksichtigen.
Weiterhin war es möglich zu zeigen, dass verschiedene andere Gene eine unterschiedliche Expression in Fibroblasten-Monolayern, rekonstruierter Dermis und rekonstruierter Haut haben und dass die Expressionsniveaus dieser Gene nicht immer äquivalent in diesen drei unterschiedlichen Modellen sind. Die folgenden Ergebnisse können beispielhaft dargestellt werden (die Ergebnisse sind ausgedrückt im Verhältnis alt/jung in Prozent).
TABELLE 1
Die erfindungsgemässen Verfahren erlauben daher einen besseren Vergleich der Synthese von verschiedenen Molekülen während der Alterung der Haut und erlauben ein Screenen von Wirkstoffen, die die Veränderung während des Alterns begrenzen oder dieser vorbeugen.
BEISPIEL 10
Northern-Blot-Analyse von mRNAs, codierend für Fibronectin in jungen und alten rekonstruierten Hautmodellen:
Die rekonstruierte Haut, die als junge und gealterte rekonstruierte Haut bezeichnet wird, wurde hergestellt durch aussäen von 400.000 Fibroblasten, die aus einem Pool von mindestens drei Spendern im Alter von weniger als 35 Jahren und mehr als 55 Jahren stammen, gewonnen und getrennt voneinander vermehrt, gemäss Protokoll, beschrieben in Beispiel 1, auf oberflächenbehandelten Kollagenmatrizes, die mit Diphenylphosphorylazid vernetzt waren. Die so hergestellte rekonstruierte Dermis wurde für 15 Tage in DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10 Kälberserum, Ascorbinsäure mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, kultiviert. Die Keratinozyten wurden in einem Verhältnis von 400.000 pro rekonstruierter Dermis ausgesät, diese stammen aus dem gleichen Pool von Spendern und wurden gewonnen und getrennt voneinander vermehrt, gemäss dem Protokoll, beschrieben in Beispiel 1. Die Kultur wurde für 1 Woche in Proliferationsmedium, hergestellt aus DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3:1 V/V), versetzt mit 10 Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isoprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml fortgesetzt. Die rekonstruierten Häute wurden dann herausgenommen und für weitere 2 Wochen in dem gleichen Medium mit Ausnahme von Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin, kultiviert. Die rekonstruierten Häute wurden in Tri Reagent^® (Sigma) gesammelt.
Die Gesamt-RNAs wurden gemäss dem in Beispiel 7 beschriebenen Protokoll gewonnen. Nach Quantifizierung der RNAs mittels Densitometrie bei 260 nm wurden die Lösungen auf 1 μg/μl RNA eingestellt. 3 bis 10 μg jeder Probe wurden dann auf ein Agarose/Formaldehyd-Gel zur Auftrennung gebracht. Die RNAs wurden mittels Kapillarkräften auf Hybond-N-Nylon-Membranen (Amersham) über Nacht transferiert. Die RNAs wurden an die Nylon durch Erwärmen auf 80°C für 90 Minuten kovalent gebunden. Die Membranen wurden dann für 20 Minuten bei 68°C in 8 ml ExpressHyb (Clontech) vorhybridisiert, bei 0,1 mg/ml und hybridisiert für 1 Nacht bei 68°C in Anwesenheit der markierten Proben. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden die Membranen viermal für 30 Minuten bei 68°C mit zweimal SSC, enthaltend 1 % SDS, gewaschen und anschliessend bei 68°C mit 0,1 × SSC, enthaltend 0,5 % SDS, und schiesslich 1 mal mit 2 × SSC. Das direkte Zählen der Radioaktivität der Spots mit Hilfe eines Phosphoimager (Packard Instruments) erlaubt die Quantifizierung der RNAs. Die Ergebnisse sind ausgedrückt in Prozent Expression in bezug auf das Actinsignal. Die quantitative Analyse mittels Northern-Blot der mRNAs, codierend für Fibronectin, erlaubt das Aufzeigen der Abnahme (Faktor 2) der mRNAs in den sogenannten gealterten rekonstruierten Hautmodellen im Vergleich zu den jungen rekonstruierten Hautmodellen.
BEISPIEL 11
Analyse von Typ VII-Kollagen mittels Western-Blot in jungen und gealterten rekonstruierten Hautmodellen:
Die junge und alte rekonstruierte Dermis wurde hergestellt durch Aussäen von 400.000 jungen (Passage 2, 2. Amplifikation nach Trypsinierung) und alten (Passage 12, 12. Amplifikation durch Trypsinierung), extrahiert und getrennt voneinander vermehrt gemäss dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll) auf Kollagen-GAG-Chitosan-Matrizes ausgesät und für 15 Tage kultiviert in DMEM-Glutamax-Medium, versetzt mit 10 % Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 2 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml. Die jungen Keratinozyten der Passage P1 und die alten Keratinozyten der Passage P3 wurden gewonnen und getrennt voneinander vermehrt, gemäss Protokoll, beschrieben in Beispiel 1, und wurden dann mit einer Menge von 400.000 pro rekonstruierter Dermis ausgesät. Die Kultur wurde für 1 Woche in Proliferationsmedium, hergestellt aus DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3:1 V/V), versetzt mit 10 Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isoprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml fortgesetzt. Die rekonstruierten Häute wurden dann herausgenommen und für weitere 2 Wochen in dem gleichen Medium mit Ausnahme von Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin, kultiviert.
Typ VII-Kollagen wurde gemäss dem Protokoll beschrieben in Beispiel 8 gewonnen und in Elektrophoresepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 6,8, 10 % Glycerin, 2 % SDS, 5 % Mercaptoethanol) gelöst. Die Proben wurden auf 95°C für 5 Minuten erwärmt. Die Grössenfraktionierung wurde auf einem 5 % SDS-PAGE durchgeführt. Dann folgte ein Transfer auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran. Eine Kontrolle mit aufgereinigtem Kollagen VII wurde parallel zu den extrahierten Proben gemacht, genauso wie ein Standard für das Molekulargewicht.
Nach Transfer wurden die Membranen für 1 Stunde im Bloting-Puffer (15 nM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 % Tween 20, 3 % BSA, pH 7,4) inkubiert. Der erste Antikollagen Typ VII-Antikörper (polyklonal, Kaninchen 1:1.000) wurde in einer 1 % Lösung PBS/BSA gegeben. nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Membranen mit dem Blockierungspuffer gewaschen und mit dem zweiten markierten HRP-konjugierten Antikörper gegen Kaninchen-IgG für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Membranen mit einer Lösung von 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid entwickelt. Im Fall einer schwachen Markierung kann ein Amplifikationskit (Biorad) verwendet werden und dann das Tracingkit Opti-4CN-Substratkit (Biorad).
Nach dem Entwickeln wurde die Membran einige Minuten mit Wasser gewaschen und dann auf einem absorbierenden Papier getrocknet.
Die Analyse der Intensität der Banden durch Bildanalyse erlaubt den Nachweis einer signifikanten Abnahme des Typ VII-Kollagengehalts bei Extrakten von verschiedenen gealterten Proben.
BEISPIEL 12
Analyse von Monolayer-Keratinozyten im Vergleich zu rekonstruierter junger und alter Epidermis mittels DNA-Array:
Dieselben Zellen in der gleichen Passage wurden zur Herstellung der drei Zellmodelle verwendet.
Keratinozyten (Pool von drei Spendern in einem Alter von weniger als 35 Jahren und in einem Alter von mehr als 55 Jahren) wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gewonnen und wurden in Monolayer zur Konfluenz kultiviert in K-SFM-Medium (Gibco), Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml. Diese wurden dann in Tri Reagent^® (Sigma) gesammelt.
Rekonstruierte Epidermis wurde hergestellt mit einer Menge von 4 × 10⁶ Keratinozyten (Pool von drei Spendern mit einem Alter von weniger als 35 Jahren und einem Alter von mehr als 55 Jahren) vermehrt wie in Beispiel 1 beschrieben bis zur Passage 1 (1. Amplifikation durch Trypsinierung) und wurden ausgesät in Boyden-Kammereinsätzen (Membranporosität: 0,4 μm, Durchmesser: 25 mm), diese wurden vorher mit einer Nährunterschicht aus Fibroblasten ausgesät, in DMEM-Glutamax/Ham F-12 (Verhältnis 3:1 V/V) Kulturmedium, versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, und für einen Zeitraum von 3 bis 8 Tagen in Immersionskultur.
Die Keratinozytenkulturen wurden dann an die Luft-Flüssigkeits-Grenze verbracht für 12 bis 18 Tage im gleichen Kulturmedium wie für die Immersionskultur, mit Ausnahme von Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthyronin und Umulin.
Am Ende des Experiments wurden die Keratinozyten-Monolayer und die rekonstruierte Epidermis in den Einsätzen abgekratzt, gesammelt und in Tri Reagent^® (Sigma) aufgenommen und mit Chloroform extrahiert. Nach Zentrifugation bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4°C befanden sich die RNAs in der oberen Schicht, die DNAs in der unteren Schicht und die Proteine im Grenzbereich.
Die cDNA-Arrays wurden wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden (RE: relative Expressionseinheit: TABELLE 2
TABELLE 3
Die erfindungsgemässen Verfahren erlauben somit ein besseres Verständnis zur Synthese der verschiedenen Moleküle während der epidermalen Alterung und erlauben somit das Screenen von Wirkstoffen, die Veränderungen, beobachtet bei der Alterung der Epidermis, entgegenwirken oder diesen vorbeugen.
BEISPIEL 13
Test zur Wirksamkeit eines kosmetischen Wirkstoffs, der topisch auf junge und gealterte rekonstruierte Haut aufgetragen wird:
600.000 junge Fibroblasten (gewonnen aus Brustbiopsie) und gealterte Fibroblasten (gewonnen aus einer Gesichtsbiopsie, erhalten nach Gesichtslifting), wurden bis zur Passage 6 vermehrt wie in Beispiel 1 beschrieben und dann auf einem dermalen Substrat auf Basis von Kollagen-Glycosaminglycan-Chitosan ausgesät, in einem DMEM-Glutamax-Kulturmedium, versetzt mit 10 % Hyclone-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM, EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml, für einen Zeitraum von 21 Tagen.
Anschliessend wurden 600.000 Keratinozyten von jungen Keratinozyten (gewonnen aus Brustbiopsie) und gealterten Keratinozyten (gewonnen aus Gesichtsbiopsie nach Gesichtslifting) wie in Beispiel 1 vermehrt und dann in Passage 1 auf dermale Äquivalente ausgesät in DMEM-Glutamax/Ham F-12-Kulturproliferationsmedium (Verhältnis 3:1 V/V), versetzt mit 10 % Hyclone II-Kälberserum, Ascorbinsäure-2-phosphat mit einer Endkonzentration von 1 mM/l, EGF mit einer Endkonzentration von 10 ng/ml, Hydrocortison mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Umulin mit einer Endkonzentration von 0,12 IU/ml, Isuprel mit einer Endkonzentration von 0,4 μg/ml, Triiodthyronin mit einer Endkonzentration von 2 × 10^–9 M, Adenin mit einer Endkonzentration von 24,3 μg/ml, Penicillin mit einer Endkonzentration von 100 IU/ml, Amphotericin B mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml und Gentamycin mit einer Endkonzentration von 20 μg/ml für einen Zeitraum von 5 Tagen in Immersionskultur.
Die Kulturen wurden dann an die Luft-Flüssigkeits-Grenze verbracht für 14 Tage in einem Differenzierungsmedium, bestehend aus dem für die Immersionskultur verwendeten Kulturmedium, mit Ausnahme von Kälberserum, Hydrocortison, Isuprel, Triiodthryonin und Umulin.
8 μl eines Placebos einer kosmetischen Formulierung und einer kosmetischen Formulierung, enthaltend 3 % Wirkstoff, wurden dann auf die als junge und alte rekonstruierte Haut bezeichnete rekonstruierte Haut aufgebracht. Nach 2 Tagen Kultur im Differenzierungsmedium wurden die kosmetischen Formulierungen sehr vorsichtig von den rekonstruierten Häuten entfernt und durch die gleiche Menge an frischer Formulierung ersetzt. Dieses wurde 7 mal wiederholt, d.h. für 14 weitere Tage Kultur. Am Ende des Experiments wurden die kosmetischen Formulierungen sehr vorsichtig von der rekonstruierten Haut entfernt und die rekonstruierte Haut mit PBS gewaschen und dann in Tri Reagent^® (Sigma) gegeben. Die Wirksamkeit der Behandlung mit dem kosmetischen Wirkstoff in der Formulierung wurde mittels cDNA-Arrayverfahren gemäss Protokoll, beschrieben in Beispiel 9, untersucht.
BEISPIEL 14
Test der Wirksamkeit eines kosmetischen Wirkstoffs, der systemisch in jungen und alten rekonstruierten Dermismodellen aufgetragen wurde:
In Beispiel 12 wurde gezeigt, dass der Fibronectingehalt in Modellen von gealterten Zellen im Vergleich zu Modellen mit jungen Zellen erniedrigt war (Abnahme von 43 %).
Rekonstruierte Dermis wurde wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellt. Deliner^® (Maisextrakt, Coletica, Lyon) wurde in 2 % in Kulturmedium verwendet, dieses wurde jeden zweiten Tag ausgetauscht. Die Kulturmedien wurden gesammelt und der Fibronectingehalt wurde mittels Dot-Blot wie in Beispiel 8 beschrieben quantifiziert, gefolgt von einer Bildanalyse. Die Zunahme des Fibronectingehalts ist 25 %. Deliner^® ist daher tatsächlich in der Lage, die Abnahme der Synthese von Fibronectin aufgrund der Alterung zu verhindern.

Claims

Verfahren zur Identifizierung einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst: die vergleichende Proteom- und/oder vergleichende Transkriptom- und/oder vergleichende Genomanalyse von (a) jungen lebenden Zellen, (b) gealterten lebenden Zellen, (c) wobei mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet wird, dies erlaubt die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der aufgrund von Zellalterung verändert ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die jungen Zellen als auch die alten Zellen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet werden.
Verfahren gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der biologische Parameter, der während der Zellalterung verändert wird, definiert ist durch mindestens einen Unterschied im Stoffwechsel der sogenannten jungen Zellen und im Stoffwechsel der sogenannten alten Zellen.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die jungen Zellen von Schritt (a) gemäss Anspruch 1 entweder Zellen sind, die aus Biopsien von jungen Spendern mit einem Alter von weniger als 40 bis 45 Jahren, oder aus Zellen, die nicht so häufig vermehrt wurden, entsprechend einer geringen Zahl von in vitro-Passagen, oder aus Zellen, die aus Biopsien, die keiner sehr starken Sonnenstrahlung ausgesetzt waren, stammen.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die alten Zellen von Schritt (b) gemäss Anspruch 1 entweder Zellen sind, die aus Biopsien von älteren Spendern stammen, Spender, die älter aus 40 bis 45 Jahre sind, oder Zellen, die einer deutlichen Zahl von in vitro-Passagen unterworfen wurden, oder Zellen, die aus Biopsien von Bereichen stammen, die der Sonne ausgesetzt waren.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die alten Zellen von Schritt (b) gemäss Anspruch 1 junge Zellen sind, die in ein dreidimensionales Gewebemodell integriert wurden, umfassend ein oder mehrere Zellarten, die künstlich durch eine längere Kultivierung gealtert wurden, vorteilhafterweise mehr als einer einmonatigen, besonders vorteilhaft mehr als einer zweimonatigen Kultivierung.
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die jungen und die alten Zellen Zellen von mindestens einem Menschen oder von mindestens einem Tier sind.
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Experiment mindestens eine Analyse, ausgewählt aus den folgenden Analyseverfahren, umfasst: – zur Analyse des Proteomprofils: zweidimensionale Elektrophorese und/oder Proteinarrays und/oder Cytokin-Arrays und/oder kombinierte ELISA-Nachweise, – zur Analyse des Genomprofils: DNA-Arrays und/oder Multiplex-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-PCR) und/oder Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-PCR), – zur Analyse des Transkriptomprofils: RNA-Arrays, cDNA-Arrays und/oder Multiplex-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (Multiplex-RT-PCR) und/oder Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) und/oder Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerasekettenreaktion (Echtzeit-RT-PCR).
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell kultiviert und/oder unter Bedingungen aufbewahrt wird, die zumindest teilweise einen Zellstoffwechsel aufrecht erhalten.
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell zumindest Fibroblasten oder Keratinozyten umfasst.
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Modell umfasst: normale, gesunde oder pathologische Zellen oder Zellen, die aus Zellinien stammen, wobei die Zellen bevorzugt humanen oder tierischen Ursprungs sind.
Verfahren gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ausgewählt ist aus den folgenden Modellen: ein Modell einer Bindegewebematrixmodell, im Fall der Haut als Dermis bezeichnet und im Fall der mukosalen Membran als Chorion bezeichnet (enthaltend hautsächlich Stromazellen), ein Epithelmodell (hauptsächlich bestehend aus Epithelzellen), ein Epidermismodell (hauptsächlich bestehend aus Keratinozyten), ein Hautmodell (hauptsächlich bestehend aus einer Epidermis und einer Dermis), ein Modell einer mukosalen Membran (bestehend aus einem Epithel und einem Chorion).
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ein Gewebemodell eines Bindegewebes ist (Dermis oder Chorion), umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus: – einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus mit Zellkultur behandeltem Plastik, einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore^®-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM^®-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; dieser inerte Träger enthält Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; – einem Gel oder einer Membran auf Basis von Hyaluronsäure und/oder Kollagen und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, umfassend Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; – einer porösen Kollagenmatrix, die ein oder mehrere Glycosaminoglycane und/oder gegebenenfalls Chitosan enthalten kann, wobei diese porösen Membranen Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, aufweisen können.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ein Epidermis-Gewebemodell oder ein Epithel-Gewebemodell ist, umfassend einen Matrixträger, bevorzugt ausgewählt aus: – einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore^®-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM^®-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran, dieser inerte Träger, wird zuvor mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, und dann mit Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten ausgesät; – ein Film oder eine Membran, basierend auf Hyaluronsäure und/oder Kollagen und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, zuvor ausgesät mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, und dann Epithelzellen und insbesondere Keratinozyten.
Verfahren gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass im epithelialen Teil Epithelzellen, Pigmentzellen, immunkompetente Zellen und Nervenzellen eingeführt sind, bevorzugt sind die immunkompetenten Zellen Langerhans-Zellen.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Gewebemodell ein rekonstruiertes Haut- oder mucosales Membrangewebemodell ist, umfassend einen dermalen oder Chorion-Matrixträger, ausgewählt aus: – einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer halbdurchlässigen synthetischen Membran, insbesondere einer halbdurchlässigen Nitrocellulosemembran, einer halbdurchlässigen Nylonmembran, einer Teflonmembran oder einem Teflonschwamm, einer halbdurchlässigen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen, Polyethylenterephthalat (PET), einer halbdurchlässigen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester (HAFT)-Membran, einer halbdurchlässigen Biopore-CM-Membran, einer halbdurchlässigen Polyestermembran; dieser inerte Träger enthält Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; – einem Gel auf Basis von Kollagen und/oder Hyaluronsäure und/oder Fibronectin und/oder Fibrin, umfassend Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; – einer porösen Membran aus Kollagen, die oberflächenbehandelt sein kann und die ein oder mehrere Glycosaminglycane und/oder gegebenenfalls Chitosan enthalten kann; diese poröse Matrizes enthalten Stromazellen, insbesondere Fibroblasten; – deepidermisierte Dermis oder tote Dermis, die menschlichen oder tierischen Ursprungs sein kann; dieser Matrixträger wird dann mit Epithelzellen ausgesät, um eine rekonstruierte mucosale Membran zu erhalten, oder mit Keratinozyten, um rekonstruierte Haut zu erhalten.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Gewebemodell ein Modell umfasst, in das mindestens ein weiterer Zelltyp eingeführt ist, bevorzugt Endothelzellen (EC) und/oder Immunzellen und/oder Adiposezellen und/oder Hautfortsätze
Verwendung eines Verfahrens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Durchführung eines Screenens mindestens eines möglichen Wirkstoffs, der in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der während des Alterns modifiziert wurde, wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert, umzukehren.
Verfahren gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (A) In-Kontakt-Bringen dieser möglicherweise wirksamen Substanz mit den gealterten Zellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert, ausgesät in einem Gewebemodell, wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann; (B) aussäen junger Zellen gemäss einem der Ansprüche 1 bis 17, in einem Gewebemodell gemäss einem der Ansprüche 1 bis 17; (C) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse zur Durchführung einer Wirkungsanalyse dieser Substanz auf den Zellstoffwechsel der gealterten Zellen; (D) Vergleichen des Zellstoffwechsels dieser gealterten Zellen in Anwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz mit dem Stoffwechsel dieser Zellen oder junger Zellen in Abwesenheit dieser Substanz, sogenannte Kontrollzellen; und (E) Identifizieren der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Aktivität der möglicherweise aktiven Substanz, insbesondere umfassend die Identifizierung einer positiven oder negativen Wirkung der Substanz, um einer Veränderung des biologischen Parameters vorzubeugen, der beim Altern verändert wird.
Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, mindestens einen biologischen Parameter, der während des Alterns verändert wird, umzukehren, umfassend: (a) Kultivieren von jungen Zellen, bevorzugt jungen Zellen wie in den Ansprüchen 5 bis 7 definiert, als Referenz; (b) Kultivieren von alten Zellen, bevorzugt wie in den Ansprüchen 5 bis 7 definiert, mit einem in bezug auf junge Zellen veränderten biologischen Parameter in Anwesenheit mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz über einen Zeitraum, der ausreicht, diese möglicherweise wirksame Substanz auf den Zellstoffwechsel dieser Zellen wirken zu lassen, um zum Stoffwechsel der jungen Zellen zurückzukehren; (c) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie in Anspruch 8 definiert, der in An- und Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultivierten alten Zellen; (d) Vergleichen der unter (c) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie in Anspruch 8 definiert, von lebenden jungen Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, wie unter (a) beschrieben; (e) gefolgt von dem Vergleich der in (c) und (d) durchgeführten Analysen, dabei möglicherweise mindestens eine wirksame Substanz identifizierend, die in der Lage ist, einen biologischen Parameter, der während eines Alterns verändert wird, umzukehren.
Verfahren zur Identifizierung mindestens einer möglicherweise wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einer Veränderung von mindestens einem biologischen Parameter, der während des Alterns verändert wird, vorzubeugen, umfassend: (a) In-Kontakt-Bringen dieser möglicherweise wirksamen Substanz mit den alten Zellen, wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert, ausgesät in einem Gewebemodell, wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert, über einen ausreichenden Zeitraum, so dass die möglicherweise wirksame Substanz wirken kann; (b) teilweise oder komplette Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie in Anspruch 8 definiert, der alten Zellen, die mit den Substanzen in Kontakt gebracht wurden; (c) Vergleich der in (b) durchgeführten Analyse mit der teilweisen oder kompletten Proteomanalyse und/oder Transkriptomanalyse und/oder Genomanalyse, bevorzugt wie in Anspruch 8 definiert, von lebenden Zellen, die in Abwesenheit der möglicherweise wirksamen Substanz kultiviert wurden, sogenannte Kontrollzellen; (d) gefolgt vom Vergleich die in (c) durchgeführten Analysen und möglicherweise Identifizieren mindestens einer wirksamen Substanz, die in der Lage ist, einer Veränderung mindestens eines biologischen Parameters, verändert während des Alterns, vorzubeugen.
Verwendung einer wirksamen Substanz, ausgewählt nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 18 bis 21, zur Herstellung mindestens einer kosmetischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung.
Substanz, die im Bereich von Kosmetika oder Pharmazeutika wirksam ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie nach einem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 18 bis 21 ausgewählt wurde.
Wirkstoff, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, einen biologischen Parameter, der als verändert bei Altern identifiziert wurde, umzukehren und/oder der Modifikation vorzubeugen; dieser Parameter wurde identifiziert durch vergleichende Studien zwischen Zellmodellen unter Verwendung von jungen Zellen und Zellmodellen mit alten Zellen, wobei mindestens eines dieser Modelle ein Gewebemodell, umfassend entweder Fibroblasten oder Keratinozyten, ist.