KR100752986B1 - 어린 생체세포 및 성숙 생체세포에서 적어도 하나의생물학적 지표의 예상변형 동정방법 - Google Patents

어린 생체세포 및 성숙 생체세포에서 적어도 하나의생물학적 지표의 예상변형 동정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것이다. 본 발명은 어린 생체세포, 성숙 생체세포 및 세포 노화로 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 동정할 수 있는 3차원 조직 모델에 사용되는 상기 두 종류의 세포 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 비교함을 포함하는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것이다. 본 발명은 활성원을 선별하기 위해 상기 과정을 사용함을 포함한다.
생물학적 지표, 어린세포, 성숙세포, 세포 노화, 조직 모델, 세포 모델, 변형동정방법.

Description

어린 생체세포 및 성숙 생체세포에서 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법{A method of identifying an eventual modification of at least one biological parameter implementing young and aged living cells}
본 발명은 어린 생체세포, 성숙 생체세포 및 세포 노화로 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 동정할 수 있는 3차원 조직 모델에 사용되는 상기 두 종류의 세포 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 비교분석을 포함함을 특징으로 하는 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 노화 동안 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시키거나 혹은 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 동정하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 적어도 하나의 화장료 및/또는 약학적 조성물을 제조하기 위해 상기 방법에 따라 선별되는 활성물질의 용도에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 화장품 혹은 제약 분야에서 활성이 있고 상기 방법에 따라 선별되는 물질에 관한 것이다.
소위 <<어린세포>>는 청년 기증자에서 채취한 생검이나 혹은 시험관 내에서 패시지(passage) 수가 비교적 작은 것에 해당하는 그다지 증식을 거듭하지 않은 세포 혹은 태양 광선에 그다지 노출되지 않은 생검 즉, 신체, 가슴, 배, 포피에서 취한 세포에서 유래한 세포이며, 소위 <<성숙세포>>는 장년 기증자의 생검이나 혹은 시험관 내에서 패시지 수가 큰 세포 혹은 태양에 노출된 부분 즉, 머리카락, 얼굴, 목, 목덜미에서 취한 생검에서 유래한 세포를 말한다.
따라서, 노화 효과를 조절하기 위해서, 세포 모델에서 다양한 유전자 및 단백질분해 방법에 따른 분석을 통해 잠재적 치료 대상을 확인하고 화장료 혹은 약학적 활성원을 선별할 수 있다. 상기 활성원을 포함하는 화장료 혹은 약학적 제형들의 효능 또한 이들 세포 모델에서 평가할 수 있다.
세포 증식, 분화 및 사멸을 포함하여 모든 세포 기능은 수많은 유전자와 세포 신호 전달경로에 따라 조절된다. 그러나, 단일층 세포 배양, 일반적으로 건강한 기증자 혹은 환자 혹은 세포주 유래의 섬유아세포 혹은 각질화세포에 대한 시험관 내 실험 결과가 생검에서 얻은 것과 완벽하게 일치하는 것은 아니다.
사실, 세포 증식 및 대사적 합성 조절은 단일층 세포 모델과 생검 혹은 대표적인 3차원 세포 모델과는 완전히 다르다. 유사하게, 3차원 다세포 모델에서 세포간 조절 메카니즘이 입증되어 있다. 이는 세포 유형간의 결합이나 혹은 예를 들어 섬유아세포에 의한 각질화세포의 조절 및 그 반대를 가능케하는 확산인자의 유무(Saintigny G., Bonnard M., Damour O. and Colombel C. in Acta Derm Venerol(Stockh) 1993 73:175-180 and Lacroix M., Bovy T., Nusgens B.V. and Lapiere C.M. in Arch Dermatol Res 1995 287: 659-664) 혹은 보다 복잡한 면역강화된 재건 피부 모델에서 수지상돌기의 전구체가 내피세포 및 대식세포로 분화하기 때문이다(A. Black: Structure maturation et dynamique d'un modele de peau reconstruite humaine(<<Structrue maturation and dynamics of a model of human reconsructed skin>>); Thesis 82/2000 UCBL1, France).
게다가, 예를 들어, 생리적 노화 혹은 광유도성 노화로 인한 단백질 발현 및 합성에 대한 자료를 찾기가 쉽지않거나 혹은 때때로 상기 자료들은 실험에 사용하는 단순 모델에 의해 생체 내에서 관찰될 수 있는 것과 모순되기도 한다.
2차원 전기영동, 단백질 배열 및 DNA 배열과 같은 단백질분해 및 유전자 분석 기술들은 현재 매우 민감한 방식으로 다수의 인자들을 검출할 수 있어 결과적으로, 소량의 생물시료를 이용하여 유전자의 발현이나 단백질의 합성에 있어서 변이들을 확인할 수 있다.
지금까지, 이들 기술들은 인간 혈청 혹은 단일층의 인간세포용 배양 배지와 같은 다양한 유형의 생물시료나 혹은 다양한 세포 유형 및 예를 들어, 섬유아세포 및 멜라닌세포의 단일층 배양에 사용되어 왔다(huang R.P., Huang R., Fan Y. and Lin Y., in Analytical Biochemistry(2001, 294:55-62); Gutsmann-Conrad A., Heydari A.R., You S. and Richardson A., in Exp. Cell Res.(1998, 241(2):404-413). 게다가, 다양한 연령의 기증자에서 유래하고 단일층으로 배양된 각질화세포나 혹은 다양한 연령의 기증자에서 유래하고 단일층으로 배양된 섬유아세포 혹은 시험관 내에서 자란 섬유아세포에서 실험들이 실시되었다(Compton C., Tong T., Trookman N., Zhao H. and Roy D., in J. Invest. Dermatol.(1994, 103(1): 127-133; Reed M.J., Ferara N.S. and Vernon R.B., in Mechanisms of ageing and development(2001, 122(11): 1203-1220; Nishio K., Inoue A., Qiao H.K., Mimura A., in histochem Cell Biol(2001, 116:321-327).
또한, 단일층으로 배양된 인간의 정상 혹은 악성 멜라닌세포(세포주 혹은 종양 조직에서 추출한 멜라닌세포)에서 자외선 스트레스의 조절자로서의 역할에 대한 연구들이 실시되었다(Valery C., J.J. and Verrando P., in J. Invest. Dermatol.(2001, 117:1471-1482).
분석 기술들의 발달과 병행하여, 다수의 표피 모델 혹은 재건 상피뿐만 아니라 재건 점막, 재건 피부 혹은 채색화되거나 혹은 면역강화된 재건 피부들이 제조되었다(EP 0 789 074 A1 of I'Oreal, Schmalz G. Schweikl H. and Hiller K.A. in Eur. J. oral Sci.(2000, 108: 442-448; EP 0 296 78 of the CNRS). 오늘날 이들 모델들은 약물독성평가 및 제약 및 화장료 성분의 효능 연구용으로 사용되었다. 그러나, 사용된 분석 방법들은 이미지 분석, 대사적 합성 분석 및 전기영동, 웨스턴 블랏 혹은 RT-PCR 분석에 의한 조절을 병행하는 고전적인 기술들이다. 또한, 단백질 배열 기술 및 DNA 배열 기술 혹은 특히 사이토카인의 복합적 측정을 이들 모델들에 적용하지는 않았다.
따라서, 본 발명의 목적은 세포가 노화되는 동안, 생체 내에서 관찰되는 여건을 반영하여 세포 대사에 대한 연구 모델을 제공하는 것으로 구성된 기술적 문제 를 기대치 않은 방식으로 해결하고자 한다.
본 발명의 목적은 어린생체세포, 성숙생체세포 및 세포 노화로 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 동정할 수 있는 3차원 조직 모델에 사용하는 상기 두 종류의 세포 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 비교함을 포함하는 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상 변형을 동정하는 방법을 제공하는 것으로 구성된 신규한 기술적 문제를 해결하고자 한다.
본 발명의 목적은 세포 모델들의 유전자 및 단백질 프로필을 비교 연구하고자 한다.
다음 (1)에서 선택한 모델들과 (2)에서 선택한 모델들을 서로 비교한다. 즉,
(1) 재건 상피(재건 표피를 포함함), 채색화되거나 면역강화된 재건 상피, 결합 기질(장막, 진피 포함), 재건 피부 혹은 점막, 채색화되거나 면역강화된 재건 피부 혹은 점막, 채색화되거나 혹은 면역강화되거나 내피화되거나 혹은 대식세포를 포함하는 재건 피부 혹은 점막, 생검들과
(2) 상기 모델 혹은 단일층 혹은 현탁상태로 배양된 상기의 다양한 모델 제조용 세포를 비교한다.
어린세포와 성숙세포를 서로 비교한다. 즉,
소위 <<어린세포>> 즉, 연령이 낮은 기증자의 생검에서 추출한 세포 혹은 시험관 내에서 그다지 증폭되지 않은 세포 혹은 태양에 노출되지 않은 신체 부분(신체, 가슴, 배, 포피...) 유래의 생검에서 추출한 세포와
소위 <<성숙세포>> 즉, 연령이 높은 기증자의 생검에서 추출한 세포 혹은 시 험관 내에서 많이 증폭된 세포 혹은 태양에 노출된 신체 부분(목, 얼굴, 손...) 유래의 생검에서 추출한 세포를 서로 비교한다.
상기 단백질분해 혹은 유전자 비교를 통해 노화가 생리적인 것이든 혹은 광-유도성이든간에 노화 동안 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시키거나 혹은 억제하기 위해 작용 표적을 한정할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 활성원 특히, 화장료 혹은 약학적 활성원의 유전자 혹은 전사 혹은 단백질분해 프로필에 대한 효과를 평가할 목적으로 상기의 조직 모델들을 이용할 수 있는 해결책을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 제형 특히, 활성원을 포함하거나 포함하지 않는 화장료 혹은 약제학적 제형의 유전자 혹은 단백질분해 프로필에 대한 효과를 평가할 목적으로 상기 조직 모델을 사용할 수 있는 해결책을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 기술적 문제들을 해결할 수 있다.
본 발명에서 <<유전자 분석>>이란 그들의 기능을 연구하기 위해 생물체의 유전자 전체 중 적어도 한 부분에 대해 연구하고 발명을 완성하는 것을 의미한다.
<<전사 분석>>이란 게놈으로부터 전사되는 RNA 전체 중 적어도 한 부분에 대해 연구하고 발명을 완성하는 것을 의미한다.
<<단백질분해 분석>>이란 발현된 단백질 중 적어도 한 부분에 대해 연구하고 발명을 완성하는 것을 의미한다.
본 발명은 어린 생체세포, 성숙 생체세포 및 세포 노화로 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 동정할 수 있는 3차원 조직 모델에 사용되는 상기 두 종류의 세포 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 비교분석을 포함함을 특징으로 하는 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법을 제공하는 것으로 구성된다.
<<어린세포>>는 청년 기증자의 생검 유래의 세포이거나 혹은 시험관 내 패시지 수가 상대적으로 작은 것에 해당하는 그다지 증식을 거듭하지 않은 세포 혹은 태양광선에 그다지 노출되지 않은 생검(신체, 가슴, 배, 포피 등등) 유래의 세포 중 어느 하나이다.
<<성숙세포>>는 장년 기증자의 생검 유래의 세포이거나 혹은 시험관 내 패시지 수가 큰 세포 혹은 태양에 노출된 부분(목, 손, 얼굴 등등) 에서 취한 생검 유래의 세포 중 어느 하나이다.
본 발명에서 패시지란 트립신 처리에 따른 증폭 행동을 의미한다.
조직 세포 모델은 주로 살아있는 생물체의 조직을 재건할 목적으로 사용되는 조직 모델 소위 생체세포로 파종될 수 있는 3차원 모델로 한정한다. 특히, 조직 모델은 결합 기질 모델일 수 있는 것, 상기 모델들에 사용하는 세포를 이용하기 위한 단일층 혹은 현탁상태의 모델뿐만 아니라 소위 피부의 경우에는 진피 및 점막의 경우에는 주로 스트로마세포를 포함하는 장막, 주로 상피세포로 구성된 상피 모델, 주로 각질화세포로 구성된 표피 모델, 상피 및 진피로 구성된 피부 모델, 상피와 장막으로 구성된 점막 모델, 살아있는 상태로 유지되는 생검 혹은 이식체 모델로 한정된다.
이들 모델들은 인간 혹은 동물 유래의 정상세포, 건강세포 혹은 병원성세포 혹은 세포주 유래의 세포로 제조될 수 있다.
상기 특징을 포함한 실시예에 따르면, 결합 기질(진피 혹은 장막)로 된 3차원 배양 모델은 재건 진피 혹은 재건 장막을 만들기 위해 스트로마세포가 파종되어 있는 지지체를 포함한다.
3차원 표피 혹은 상피 배양 모델은 재건 상피 혹은 표피를 얻기 위해, 스트로마세포 특히, 섬유아세포로 미리 파종하고 나서 상피세포 특히 각질화세포로 파종하거나 혹은 그렇지 않은 지지체를 포함한다.
3차원 재건 피부 혹은 점막 배양 모델은 재건 피부를 얻기 위해, 재건 점막 혹은 각질화세포를 얻기 위해, 상피세포가 파종된 기질 지지체(진피 혹은 장막)를 포함한다.
실시예에 따르면, 상기 3차원 배양 모델은 적어도 하나의 세포 유형 즉, 내피세포 및/또는 림프구 및/또는 지방세포 및/또는 세포간 수지상돌기 세포 및/또는 체모, 머리카락, 피지세포와 같은 피부 부속물이 추가로 결합되어 있는 모델을 포함한다.
유리하게는, 색소세포, 면역강화세포(랑게르한스 세포), 신경세포 등등은 상피 부분에 도입될 수 있다.
추출한 다양한 세포 유형(섬유아세포, 각질화세포, 멜라닌세포)들은 각각 증폭되지만 단일층 혹은 현탁 배양뿐만 아니라 3차원 모델의 재건을 위해 몇몇 기증자들로부터 각각 혹은 공동으로 사용될 수 있다.
실시예에 따르면, 수지상돌기의 전구체(세포간 수지상돌기 세포)는 적어도 상피세포와 스트로마세포를 포함하는 3차원 환경 하에서 배양될 때, 자연발생적으로 다를 수 있고 내피세포 및 대식세포와 같은 적어도 2 종류의 세포 유형을 추가로 개시할 수 있다.
상기 조직 모델은 노화가 생리적이든 혹은 광-유도성이든 간에 노화 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시키거나 혹은 억제하기 위해 예상 표적의 선별, 동정 및 특징화할 수 있는 유전자 및/또는 전사 및/또는 단백질분해 분석을 위해 배양 말기에 사용된다.
예상 표적은 생물학적 지표와 결합하여 역전되거나 혹은 변형이 억제되어 본 발명에 따라 동정된다.
표적을 한정한 후, 화장료 혹은 약제학적 활성원의 선별 및 활성물질을 포함하거나 그렇지 않는 화장료 혹은 약제학적 제형의 효능을 입증하는 데 이들과 같은 모델과 검출 방법을 사용할 수 있다.
분석 기술들 중 특히 다음의 기술들이 사용될 수 있다:
단백질분해 프로필을 분석하기 위해서는 2차원 전기영동 및/또는 단백질 배열 및/또는 사이토카인 배열 및/또는 복합 ELISA(combined ELISA)를,
유전자 프로필을 분석하기 위해서는 DNA 배열 및/또는 복합 PCR(PCR-multiplex) 및/또는 PCR 및/또는 실시간-PCR(real time-PCR)을,
전사 프로필을 분석하기 위해서는 RNA 배열, cDNA 배열 및/또는 역전사-복합 PCR(reverse transcription-PCR multipelx) 및/또는 역전사-PCR(RT-PCR) 및/또는 실시간 RT-PCR을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 특징에 따르면, 본 발명은 어린 생체세포, 성숙 생체세포 및 세포 노화로 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 동정할 수 있는 3차원 조직 모델에 사용되는 상기 두 종류의 세포 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 분석을 비교함을 포함하는 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것이다.
유리하게는, 어린세포 및 성숙세포 둘 다 3차원 조직 모델에 사용된다.
유리하게는, 상기 생물학적 지표는 노화 동안 변형되며, 어린세포의 대사와 성숙세포의 대사 간의 적어도 하나의 차이에 따라 한정된다.
유리하게는, 상기 어린세포는 45세 미만의 청년 기증자의 생검이나 혹은 시험관 내에서 패시지(passage) 수가 비교적 작은 것에 해당하는 그다지 증식을 거듭하지 않은 세포 혹은 태양 광선에 그다지 노출되지 않은 생검 즉, 신체, 가슴, 배, 포피에서 취한 세포에서 유래한 세포 중 어느 하나이다.
유리하게는, 상기 성숙세포는 45세 이상의 장년 기증자의 생검이나 혹은 시험관 내에서 패시지 수가 큰 세포 혹은 태양에 노출된 부분 즉, 머리카락, 얼굴, 목, 목덜미에서 취한 생검에서 유래한 세포 중 어느 하나이다.
유리하게는, 상기 성숙세포는 장기간 동안 유리하게는 한 달 이상, 보다 바람직하게는 두 달 이상동안 배양하여 인위적으로 노화시킨 하나 이상의 세포 유형을 포함하는 3차원 조직 모델에 결합되어 있는 어린세포이다.
유리하게는, 상기 어린세포 혹은 성숙세포는 적어도 하나의 인간 혹은 적어 도 하나의 동물에서 유래한 세포이다.
유리하게는, 상기 연구는 다음 분석방법에서 선택되는 분석을 적어도 하나 포함한다:
단백질분해 프로필을 분석하기 위해서는 2차원 전기영동 및/또는 단백질 배열 및/또는 사이토카인 배열 및/또는 복합 ELISA를,
유전자 프로필을 분석하기 위해서는 DNA 배열 및/또는 복합 PCR 및/또는 PCR 및/또는 실시간 PCR을,
전사 프로필을 분석하기 위해서는 RNA 배열, cDNA 배열 및/또는 역전사-복합 PCR 및/또는 역전사-PCR 및/또는 실시간 역전사-PCR을 이용함.
유리하게는, 상기 조직 모델은 적어도 부분적으로는 세포 대사를 유지하는 조건 하에서 배양되거나 보존된다.
유리하게는, 상기 조직 모델은 적어도 섬유아세포 혹은 각질화세포를 포함한다.
유리하게는, 상기 모델은 인간 혹은 동물 유래의 정상세포, 건강세포 혹은 병원성세포 혹은 세포주 유래의 세포를 포함한다.
유리하게는, 상기 조직 모델은 다음 모델로부터 선택된다: 결합 기질 모델, 피부의 경우 소위 진피 및 주로 스트로마세포를 포함하는 점막의 경우 소위 장막, 주로 상피세포로 구성된 상피 모델, 주로 각질화세포로 구성된 표피 모델, 표피와 진피로 구성된 피부 모델, 상피와 장막으로 구성된 점막 모델.
유리하게는, 상기 조직 모델은 바람직하게는 다음에서 선택되는 기질 지지체 를 포함하는 결합 기질 조직 모델(진피 혹은 장막)이다:
반투과성 합성 멤브레인 특히, 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 혹은 테프론 스폰지, 폴리카보네이트 혹은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 혹은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)로 된 반투과성 멤브레인, 반투과성 아노포어(Anopore) 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 혹은 셀룰로우즈 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜산으로된 멤브레인 혹은 필름으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체. 상기 군에는 피부 모델 예를 들어, 스킨 2 TM 모델 ZK1100 및 더마그래프트® 및 트랜스사이트®(어드밴스드 티슈 사이언스 사)가 해당된다;
세포 배양액을 처리한 성형(피부박의 형성: Michel M. et al in In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal(1999, 35: 318-326);
하이알루론산(하이알로그래프트®3D-피디아 어드밴스드 바이오폴리머 사) 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린으로 된 젤 혹은 멤브레인. 상기 군에서 피부 모델 예를 들어 비트릭스®(오가노제네시스)가 해당된다;
하나 이상의 글리코스아미노글리칸 및/또는 키토산을 포함할 수 있는 콜라겐으로 제조된 겉으로 드러나거나 그렇지 않은 다공성 기질(CNRS: EP 0 296 078 A1; 꼴레띠까: WO 01/911821 및 WO 01/92322). 상기 군에는 피부 모델 예를 들어, 미메덤®(꼴레띠까)이 해당된다.
이들 기질 지지체들은 스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함한다.
유리하게는, 상기 조직 모델은 바람직하게는 다음에서 선택되는 기질 지지체를 포함하는 표피 조직 모델 혹은 상피 조직 모델이다:
반투과성 합성 멤브레인 특히, 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 혹은 테프론 스폰지, 폴리카보네이트 혹은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 혹은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)로 된 반투과성 멤브레인, 반투과성 아노포어(Anopore) 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 혹은 셀룰로우즈 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜산으로된 멤브레인 혹은 필름으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체. 상기 군에는 에피덤®, 에피에어웨이®, 에피오쿨라®(마텍사)뿐만 아니라 재건 표피 및 상피 모델(스키네틱®) 이 해당된다;
하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린으로 된 필름 혹은 멤브레인. 상기 군에서 피부 모델 특히, 레이저스킨®(피디안 어드밴스드 바이오폴리머 사), 에피스킨®(로레알 사)이 해당된다.
이들 모델들은 스트로마세포 특히 섬유아세포로 파종되고 나서 상피세포 특히 각질화세포로 파종된다.
유리하게는, 상기 상피 부분에, 상피세포, 색소세포, 면역강화세포, 신경세 포를 추가로 도입한다. 바람직하게는, 상기 면역강화세포는 랑게르한스 세포이다.
유리하게는, 상기 조직 모델은 바람직하게는 다음에서 선택되는 피부 혹은 장막 기질 지지체를 포함하는 재건 피부 혹은 점막 조직 모델이다:
반투과성 합성 멤브레인 특히, 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 혹은 테프론 스폰지, 폴리카보네이트 혹은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 혹은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)로 된 반투과성 멤브레인, 반투과성 아노포어(Anopore) 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 혹은 셀룰로우즈 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인, 폴리글리콜산으로된 멤브레인 혹은 필름으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체. 상기 군에는 에피덤®, 에피에어웨이®, 에피오쿨라®(마텍사)뿐만 아니라 재건 표피 및 상피 모델(스키네틱®) 이 해당된다;
하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린으로 된 필름 혹은 멤브레인. 상기 군에서 피부 모델 특히, 레이저스킨®(피디안 어드밴스드 바이오폴리머 사), 에피스킨®(로레알 사)이 해당된다.
이들 모델들은 스트로마세포 특히 섬유아세포로 파종되고 나서 상피세포 특히 각질화세포로 파종된다.
유리하게는, 상기 상피 부분에, 상피세포, 색소세포, 면역강화세포, 신경세포를 추가로 도입한다. 바람직하게는, 상기 면역강화세포는 랑게르한스 세포이다.
유리하게는, 상기 조직 모델은 바람직하게는 다음으로부터 선택되는 피부 혹은 장막 기질 지지체를 포함하는 재건 피부 혹은 점막 조직 모델이다:
스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함하며, 반투과성 합성 멤브레인 특히, 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인 혹은 테프론 스폰지, 폴리카보네이트 혹은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 혹은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)로 된 반투과성 멤브레인, 반투과성 아노포어(Anopore) 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 혹은 셀룰로우즈 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체,
스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함하는 하이알루론산 및/또는 콜라겐 및/또는 피브로넥틴 및/또는 피브린으로 된 젤,
스트로마세포 특히 섬유아세포를 포함하며, 글리코스아미노글리칸 및/또는 키토산을 하나 이상 포함할 수 있는 콜라겐으로 제조된 겉으로 드러나거나 혹은 그렇지 않은 다공성 기질,
인간 혹은 동물 유래의 탈표피화된 진피 혹은 죽은 진피.
상기 군에는 모델 스킨 2 TM(ZK1200-1300-2000, 어드밴스드 티슈 사이언스)뿐만 아니라 미메스킨®(꼴레띠까), 아플리그라프®(오가노제네시스), ATS-2000(셀시스템® 바이오테크놀로지 베트리엡)이 해당된다.
게다가, 모델들은 그러한 연구들의 주제일 수 있는 조직 치료에 제공된다. 모델 에피덱스 TM(모덱스 세라퓨티크), 에피베이스®(래보레이토리 제네브리에), 에피셀TM(겐자임), 오토덤TM 및 트랜스덤TM(이노제네틱스)이 해당된다.
기질 지지체는 재건 점막을 얻기 위해 상피세포로 그리고 재건 피부를 얻기 위해 각질화세포로 파종된다.
유리하게는, 상기 조직 모델은 적어도 하나의 세포 유형 바람직하게는 내피세포 및/또는 림프구, 대식세포 수지상돌기 세포와 같은 면역세포 및/또는 지방세포 및/또는 체모, 머리카락, 피지세포와 같은 피부 부속물이 추가로 결합되어 있는 모델을 포함하고 있다.
본 발명의 두 번째 특징에 따르면, 본 발명은 상기와 같이 노화 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 선별하기 위한 방법의 용도에 관한 것이다.
유리하게는, 다음을 포함하는 상기와 같이 노화 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 선별하기 위한 방법:
a) 상기 성숙세포에 잠재적 활성물질을 배치한 다음, 상기 잠재적 활성물질이 작용하기에 충분한 시간 동안 이들을 상기와 같은 세포 모델 혹은 조직 모델에 파종하고,
b) 상기의 어린세포를 세포 모델 혹은 조직 모델에 파종하고,
c) 상기 성숙세포의 세포 대사에 대한 상기 물질의 작용을 연구하기 위해 부 분적으로 혹은 전체적으로 단백질분해 분석 및/또는 전사 분석 및/또는 유전자 분석을 실시하고,
d) 상기 물질이 없는 상태에서 상기 성숙세포 혹은 어린세포의 대사와 잠재적 활성물질이 있는 상태에서 상기 성숙세포의 세포 대사를 비교하고,
e) 주로 노화 동안 변형되는 것으로 동정된 생물학적 지표의 변형을 억제하기 위해 상기 물질의 양성 혹은 음성 효과를 동정하는 것을 포함하여 상기 잠재적 활성물질의 활성 유무를 동정함.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 노화 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질의 동정방법에 관한 것이다:
a) 바람직하게는 상기 어린세포를 배양하여 대조군으로 사용하고,
b) 어린세포의 대사를 회복하기 위해 상기 잠재적 활성물질이 상기 세포의 세포 대사에 작용하기에 충분한 시간 동안 적어도 하나의 잠재적 활성물질이 있는 상태에서 소위 어린세포에 관해서는 변형된 생물학적 지표를 갖는 바람직하게는 상기의 성숙세포를 배양하고,
c) 활성물질이 있거나 혹은 없는 상태에서 배양된 상기 성숙세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 단백질분해 분석 및/또는 전사 분석 및/또는 유전자 분석을 실시하고,
d) a)의 잠재적 활성물질 없이 배양된 바람직하게는 상기에 기재된 살아있는 어린생체세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 단백질분해 분석 및/또는 전사 분석 및/또는 유전자 분석을 실시하여 c) 단계의 분석과 비교하고,
e) 노화로 인해 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 활성물질을 적어도 하나 동정한 후 c)와 d) 단계에서 실시한 분석들을 비교함.
다른 특징에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 노화 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질의 동정방법에 관한 것이다:
a) 상기 잠재적 활성물질을 소위 상기 성숙세포와 접촉하도록 배치하고, 상기 잠재적 활성물질이 작용하기에 충분한 시간 동안 상기 조직 모델에 이들을 파종하고,
b) 이들 물질들이 서로 접촉하도록 배치된 상기 성숙세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 단백질분해 분석 및/또는 전사 분석 및/또는 유전자 분석을 실시하고,
c) 상기 잠재적 활성물질이 없는 상태에서 배양된 바람직하게는 상기 생체세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 실시된 단백질분해 분석 및/또는 전사 분석 및/또는 유전자 분석을 b) 단계에서 실시한 분석과 비교하고,
d) 노화 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 활성물질을 적어도 하나 동정한 후 c) 단계에서 실시한 분석들을 비교함.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 화장료 및/또는 약학적 조성을 제조하기 위해 상기의 방법에 따라 선택된 활성물질을 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 본 발명은 상기의 방법에 따라 선택된 화장품 혹은 제약 분야에서 활성이 있는 물질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 본 발명은 노화 동안 변형되는 것으로 동정되는 생물학적 지표를 역전시키거나 혹은 그것의 변형을 억제할 수 있는 활성물질에 관한 것이다. 상기 지표는 어린세포를 이용하는 세포 모델과 성숙세포를 이용하는 세포 모델들에 실시한 연구들을 비교하여 동정되며, 이들 모델 중 적어도 하나는 섬유아세포 혹은 각질화세포 중 적어도 어느 하나를 포함하고 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점들은 다음의 설명과 실시예를 통해 명백하게 나타날 것이지만 본 발명의 범위를 이에 한정하는 것은 아니다. 실시예는 본 발명의 전반을 구성하고 있으며, 종래 기술에 비해 신규한 특징은 기능과 보편성에 있어 본 발명의 전반을 청구하고 있다. 실시예들에서, 특별히 언급하지 않는다면, 퍼센트는 중량 당 퍼센트를, 온도는 섭씨온도를, 압력은 대기압을 말한다.
[실시예]
실시예 1 : 소위 <<어린 혹은 성숙>> 세포의 추출 및 배양
소위 <<어린세포>>는 다음 중 어느 하나이다:
청년 기증자로부터 추출한 세포 즉, 성형수술로부터 얻은 생검, 바람직하게는 태양에 노출되지 않은 포피 혹은 복부 혹은 유방 혹은 치주 혹은 질에서 추출한 세포,
청년 기증자로부터 추출한 세포 즉, 45세 미만의 기증자,
패시지 수가 작은 세포 즉, 패시지 수가 10 미만인 섬유아세포, 패시지 수가 6 미만인 멜라닌세포 및 패시지 수가 2 미만인 각질화세포.
소위 <<성숙세포>>는 다음 중 어느 하나이다:
장년 기증자의 생검으로부터 추출하거나 성형 수술로부터 얻은 세포 바람직하게는, 태양에 노출되지 않은 배 혹은 유방 혹은 치주 혹은 질에서 얻은 세포 즉, 45세 이상의 기증자로부터 얻은 세포,
다양한 연령의 기증자로부터 얻은 생검으로부터 추출한 세포 및 태양에 노출된 부분(얼굴, 목, 손)의 성형수술로부터 얻은 세포,
패시지 수가 큰 세포 즉, 섬유아세포의 경우 10 이상, 멜라닌세포의 6 이상 및 각질화세포의 경우 2 이상.
상기로부터 얻은 세포 유형은 이식 기술 혹은 효소적 소화 즉, 콜라게나아제에 의한 소화에 따라 추출된 섬유아세포, 효소 특히, 디스파아제 혹은 서모라이신 혹은 트립신-EDTA... 에 의해 진피와 표피로 분리된 후 추출된 각질화세포 혹은 멜라닌세포일 수 있다.
추출 후, 10% 소 혈청, 100 UI/mL의 페니실린, 1 ㎍/mL의 젠타마이신, 1 ㎍/mL의 암포테리신 B가 첨가된 DMEM(Dulabecco's modified Eagle's Medium)/Ham F12 글루타맥스 50/50(v/v) 배지에서 섬유아세포를 증폭하였다. 트립신을 처리하여 컨플루언스 90%에 도달할 때까지 섬유아세포를 증폭하였다.
추출 후, 100 UI/mL의 페니실린, 1 ㎍/mL의 젠타마이신, 1 ㎍/mL의 암포테리신 B가 첨가된 소의 뇌하수체선 추출물을 포함한 K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium-인비트로젠 사) 배지에서 각질화세포를 증폭하였다. 트립신을 처리하여 컨플루언스 90%에 도달할 때까지 각질화세포를 증폭하였다.
추출 후, 100 UI/mL의 페니실린, 1 ㎍/mL의 젠타마이신, 1 ㎍/mL의 암포테리신 B가 첨가된 MMK2(Melanocyte Medium Kit-시그마 사) 배지에서 멜라니세포를 증폭하고 100 ㎍/mL의 제네티신을 3일 동안 처리하여 잔여 각질화세포를 제거하였다. 그 후, 제네티신을 제외하고 상기와 동일한 조성의 배지에서 계속 배양하였다. 트립신을 처리하여 컨플루언스 90%에 도달할 때까지 멜라닌세포를 증폭하였다.
실시예 2 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 진피의 제조 및 RNA, DNA 및 단백질의 추출
실시예 1에 따라 증폭된 3명의 청년 기증자(45세 미만) 및 장년 기증자(45세 이상)로부터 얻은 500,000 개의 섬유아세포를 DMEM-글루타맥스 배지에서 디페닐포스포릴아자이드로 가교결합된 콜라겐으로 구성된 피부 기질에 21일 동안 파종하였다. 이때, 상기 DMEM-글루타맥스 배지에는 10%의 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF(epidermal growth factor), 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B가 첨가되어 있다.
실험 말기에, 재건 진피에 액체 질소를 넣고 생분쇄기로 분쇄하였다. 상기 분쇄물을 트리 시약(Tri reagent®, T9424 시그마)에 넣고 나서, 클로로포름으로 추출하였다. 4℃, 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리한 후, 상층부에는 RNA, 하층부에는 DNA 그리고 중간부에는 단백질이 나타났다.
실시예 3 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 표피의 제조 및 RNA, DNA 및 단백질의 추출
실시예 1에 따라 패시지가 1이 될때 까지 증폭한(트립신 처리 후 첫 번째 증폭) 소위 <<어린>> 각질화세포(35세 미만의 기증자) 및 <<성숙>> 각질화세포(55세 이상의 기증자)에서 얻은 4 x 106 각질화세포를 섬유아세포 층 아래에 영양분을 미리 파종한 보이덴 챔버 유형의 인서트(Boyden chamber-type inserts, 멤브레인의 구멍 사이즈는 0.4 ㎛, 직경 25 mm)에 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율: 3/1 v/v) 배양배지에서 3일 내지 8일 동안 파종하였다. 이때, 상기 DMEM-글루타맥스/Ham F-12 배양배지에는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF(epidermal growth factor), 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다.
그 후, 각질화세포의 배양액을 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우물린을 제외하고 액체배양에 사용된 것과 동일한 배양 배지에 넣고 에어-리퀴드 인터페이스(air-liquid interface)에 12일 내지 18일 동안 두었다.
실험 말기에, 인서트에 나타나는 재건 표피를 긁어낸 다음 수집하여 트리 시약에 넣고, 클로로포름으로 추출하였다. 4℃, 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리 한 후, 상층부에는 RNA, 하층부에는 DNA 그리고 중간부에는 단백질이 나타났다.
실시예 4 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 치주점막상피 및 RNA, DNA 및 단백질의 추출
실시예 1에 따라 추출된 소위 <<어린>> 상피세포(패시지 1, 트립신 처리 후 첫 번째 증폭) 및 <<성숙>> 상피세포(패시지 4, 트립신 처리 후 네 번째 증폭)로부터 얻은 치주 점막의 1 ~ 2 x 106 개의 상피세포를 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율: 3/1 v/v) 배양배지에서 보이덴 챔버 유형의 인서트(멤브레인의 구멍 크기는 0.4㎛, 직경은 10 mm)에 3일 내지 8일 동안 파종하였다. 이때, 상기 DMEM-글루타맥스/Ham F-12 배양배지에는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF(epidermal growth factor), 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다.
그 후, 상피세포의 배양액을 소 혈청을 1% 만 포함하는 액체배양에 사용된 것과 동일한 배양 배지에 넣고 12일 내지 18일 동안 액체배양하였다.
실험 말기에, 인서트에 나타나는 재건 상피를 트리 시약에 넣고, 클로로포름으로 추출하였다. 4℃, 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리한 후, 상층부에는 RNA, 하층부에는 DNA 그리고 중간부에는 단백질이 나타났다.
실시예 5 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 피부의 3차원 다세포 모델 및 RNA, DNA 및 단백질의 추출
실시예 1에 따라 추출되고 패시지 5까지 증폭된 소위 <<어린>> 섬유아세포(35세 미만의 기증자 3명) 및 <<성숙>> 섬유아세포(55세 이상의 기증자 3명)로부터 얻은 400,000개의 섬유아세포를 표면이 콜라겐 스폰지로 된 피부 기질에 파종하였다.
간단히 말해, 피부 기질은 다음의 프로토콜에 따라 제조하였다:
0.75%의 콜라겐 젤을 25℃에서 건조하여 필름을 형성하고,
0.75%의 콜라겐 젤에 상기 콜라겐 필름을 침적하고,
24시간 동안 동결건조한 다음 DPPA(디페닐포스포릴아자이드, 디메틸포름아마이드에 50 ㎕/g의 콜라겐을 넣은 다음 pH 8.9의 붕산염 완충액에 녹음)로 가교결합시키고,
무기물을 제거한 물로 씻은 후, 겉으로 드러난 피부 기질을 다시 한 번 동결건조시켰다.
섬유아세포의 배양 배지로는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 하스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM-글루타맥스 배지를 사용하였으며, 14일 동안 배양하였다.
그 후, 실시예 1에 따라 추출되고 패시지 2(트립신 처리 후 두 번째 증폭)까지 증폭된 소위 <<어린>> 각질화세포(35세 미만의 기증자 3명) 및 <<성숙>> 각질화세포(55세 이상의 기증자 3명)에서 얻은 400,000 개의 각질화세포를 DMEM-글루타맥 스/Ham F-12(비율: 3/1 v/v) 배양 배지에서 피부 등가물에 7일 간 파종하였다. 이때, 상기 DMEM-글루타맥스/Ham F-12 배양 배지에는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF(epidermal growth factor), 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다.
그 후, 상기 배양액을 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우밀린을 제외하고 액체배양에 사용한 것과 동일한 배양 배지에 첨가하고 21일 동안 에어-리퀴드 인터페이스에 두었다.
실험 말기에, 재건 피부를 트리 시약에 넣은 후, 액체 질소를 넣고 생분쇄기에서 분쇄한 후 클로로포름으로 추출하였다. 4℃, 12,000 x g에서 15분 간 원심분리한 후, RNA는 상층부에서, DNA는 하층부에서, 단백질은 중간부분에서 발견되었다.
실시예 6 : 랑게르한스 세포, 세포간 수지상돌기 세포, 대식세포 및 내피세포 군을 포함하는 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 피부의 3차원 다세포 모델 및 RNA, DNA 및 단백질 추출
◆ 랑게르한스 세포의 분화 경로에서 우선적으로 스스로 순응할 수 있는 미분화 및 미성숙 수지상돌기 세포의 생성:
한 명 이상의 인간 기증자의 정맥혈에서 말초순환 혈을 얻은 후 리튬-헤파린 과 같은 일반적인 항응고제가 첨가된 배큐테이너(vacutainer)에 담았다.
Geissmann 등의 프로토콜(in J. EXP. MED. vol 187, No. 6, 16 March 1998, pages 961-966 published by The Rockefeller University Press)에 따라 다음의 방법으로 상기 순환 혈에서 CD14+ 단핵세포를 분리할 수 있다:
- 피콜 제제(Ficoll®, 디아트리조에이트/다당류 밀도 1.077; 림포프렙 에이비시스 1053980)를 첨가하여 원심분리한 후, 순환 혈의 단핵세포를 회복시키고 마그네틱 비드가 결합되어 있는 항체 칵테일(antibody cocktail, 주로 항-CD3 혹은 디퍼렌시에이션 3의 항-에프클러스터(anti-fCluster of Differentiation 3), 항-CD7, 항-CD19, 항-CD45RA, 항-CD56 혹은 디퍼렌시에이션 항-IgE의 클러스터 혹은 항-이뮤노글로불린 E)로 간접적으로 표지하였다(labelling).
- 마그네틱 컬럼에 통과시킨 후, 컬럼에 붙지 않는 단핵세포만 용출하였다.
당업자에게 잘 알려져 있는 물리적 분리 방법 주로, 침전 혹은 원심분리에 따라 진행하여 얻은 용출물에서 CD14+ 단핵세포를 회복한 다음 이후 배양을 위해 상기와 같이 용출하였다.
그 후, CD14+ 단핵세포를 보체를 제거한 우태반 혈청 10%, 2개의 사이토카인 즉, 사이토카인 400 UI/mL GM-CSF 및 10 ng/mL TGFβ1이 첨가된 RPMI 1640 배양배지에서 약 1 x 106/mL 의 속도로 배양하였다.
상기 배양은 37℃, 5% CO2를 포함한 습기 조건에서 실시하였다. 배양 배지 에는 세 번째 사이토카인 즉, 사이토카인 IL-13 10 ng/mL을 첨가하였다. 배양 2일이 되기 전에, 배양 6일 째까지 IL-13을 포함하지 않은 상기와 같은 배양 배지를 첨가하였다. 6일 째에, 미분화된 미성숙 수지상돌기 세포는 랑게르한스 세포의 분화 경로에서 우선적으로 스스로 순응할 수 있게 되었다:
- 시험관 내에서 생성되는 약 60 내지 80%의 수지상돌기 세포는 세포 내에서 랑게린과 MIP-3α의 특이 수용체인 CCR6를 발현시킨다;
- 시험관 내에서 생성되는 수지상돌기 세포는 MIP-3α에 의해 화학적으로 강하게 끌리며, 이는 수용체 CCR6의 기능성을 입증하는 것이다;
- 시험관 내에서 생성되는 수지상돌기 세포는 성숙 표지자인 CD83, DC-LAMP 및 CCR7을 발현하지 않기 때문에 미성숙 상태이다.
◆ 3차원 모델은 다음 프로토콜에 따라 제조하였다:
실시예 1에 따라 패시지 3 내지 10(트립신 처리 후 열 번째까지 증폭)까지 증폭된 2 x 105개의 섬유아세포를 DMEM-글루타맥스 배양 배지에서 콜라겐-글리코스아미노글리칸-키토산으로 된 피부 기질에 21일 간 파종하였다. 상기 DMEM-글루타맥스 배양 배지에는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF(epidermal growth factor), 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B 및 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다. EGF를 제외한 상기 배지에서 일주일 간 추가로 배양하였다.
그 후, 실시예 1에 따라 패시지 0 내지 2(트립신 처리 후 두 번째까지 증폭)까지 증폭된 2 x 105 개의 각질화세포와 시험관 내에서 생성되는 1 ~ 3 x 105개의 미분화된 수지상돌기 세포를 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율: 3/1 v/v) 배양 배지에서 피부 등가물에 7일 간 파종하였다. 상기 DMEM-글루타맥스/Ham F-12 배양 배지에는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다.
그 후, 상기 배양액을 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오티로닌 및 우밀린을 제외하고 상기와 같은 액체배양에 사용된 배양 배지에서 21일 간 에어-리퀴드 인터페이스에 두었다.
이들 조건 하에서, 랑게르한스 세포는 표피에 위치하게 되고, 세포간 수지상돌기 세포, 대식세포 및 내피세포는 진피안에 위치하였다.
실험 말기에, 면역강화 재건 피부를 트리 시약에 넣은 다음 액체 질소를 넣고 생분쇄기에서 분쇄한 후 클로로포름으로 추출하였다. 4℃, 12,000 x g에서 15분 간 원심분리한 후, RNA는 상층부에, DNA는 하층부에, 단백질은 중간부분에 나타났다.
실시예 7 : 상기 세포 모델의 RNA, DNA 및 단백질의 정제
RNA를 2-프로판올로 침전시킨 후 1 ㎍/㎕의 비율로 물에 녹인 다음, 12,000 x g에서 15분 간 원심분리하고 80% 에탄올로 찌꺼기를 씻고, 건조시키고, DNAses(암비온 사)를 처리한 다음, 260/280 nm에서 흡광도를 읽었다.
4℃, 2,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 DNA를 침전시키고, RNA를 포함하는 상층부를 제거한 후 에탄올을 처리하였다. 단백질 분획을 포함하는 상등액을 모았다. DNA를 포함하는 찌꺼기에 10% 에탄올에 녹인 0.1 M 시트르산염 완충액을 처리한 다음 4℃, 2,000 x g에서 5분 간 원심분리한 후 75% 에탄올을 처리하고 진공상태에서 5 - 10 간 건조시킨 후, 8 mM 수산화나트륨에서 녹였다. 불용물질을 제거하기 위해 12,000 x g에서 10분 간 원심분리한 후, 260 nm에서 흡광도를 읽은 다음 DNA 농도를 0.3 ㎍/㎕로 조정하였다.
에탄올 추출물(상등액)에서 얻은 단백질을 이소프로판올로 침전시키고 4℃, 12,000 x g에서 10분 간 원심분리한 다음 95% 에탄올에 녹인 0.3 M 구아니딘 HCl를 처리하여 7,500 x g에서 5분 간 원심분리하고 이를 3번 반복 실시하였다. 그 후, 찌꺼기를 진공상태 하에서 5 ~ 10분 간 건조시킨 다음 1% SDS로 녹였다.
실시예 8 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 피부에 대한 노화방지 복합체의 효능 연구
실시예 5에 따라 재건 피부를 제조하였다. 기저 막의 재건을 촉진하는 바셀린®(꼴레띠까 사의 맥아 단백질의 변형품)을 포함하여 3개의 활성물질로 구성된 노화방지 복합체를 액체배양 배지에 14일 동안 2.25%의 농도로 첨가하거나 혹은 첨가하지 않았다(대조군).
면역조직학적 연구
배양 14일 후, <<대조군>> 재건 피부 및 <<처리군>> 재건 피부를 액체질소로 얼린 다음 크리오마이크로파트(크리오스타트, 마이크롬 500 M)를 이용하여 냉동절단하였다.
면역조직학적 기술에 따라 총 라미닌, 5-라미닌, 콜라겐 IV 및 콜라겐 VII를 추적하였다. 라미닌에 대해서는 NCL-LAMININ을, 콜라겐 IV에 대해서는 NCL-COLL-IV를, 콜라겐 VII에 대해서는 NCL-COLL-VII를 사용하였다. 5-라미닌에 대해서는 칼리닌/라미닌 β3 항체를 사용하였다. 상기 항체들은 추적용 제제로서 디아미노벤지딘(DAB)이 결합되어 있다.
본 연구에서 물질들을 확인하는 데 사용된 과정들(항체-분자 간의 결합, 세척, 추적...)은 면역조직학 로봇(넥세스, 벤타나)에 의해 실시되었다.
재건 피부를 절단하여 만든 슬라이드는 악시오포트(Axiophot, 스위스, 40배 확대)를 이용하여 각 항체 용으로 제조하였으며 품질이 좋고 조직화된 기저 막을 확인할 수 있다.
본 연구 결과, 재건 피부 모델은 총 라미닌, 라미닌 5, 콜라겐 IV 및 VII를 모두 나타냈다. 노화 방지 복합체를 처리한 재건 피부에서 보다 강하게 표지가 나타났다. 그러나, 조직학적 분석 결과 어린 피부와 성숙 피부 간의 실제 차이는 나타나지 않았다.
닷-블랏 실험
제 1 단계로, 재건 피부에 0.5 N 아세트산 배지에서 4℃에서 48시간 동안 시 료 건중량 당 20 mg/g의 펩신을 처리한 후, 콜라겐을 추출하였다.
15,000 x g에서 30분 간 원심분리한 후, 4℃에서 2시간 동안 0.7 M NaCl를 처리하여 침전시켜 콜라겐 I을 제거한 다음 13,000 rpm에서 원심분리하였다.
상등액에 1.2 M NaCl를 처리하여 4℃에서 밤새도록 침전시킨 후 13,000 rpm에서 원심분리하여 콜라겐 IV를 얻었다.
상등액에 TCA/아세톤/DTT 혼합액(바이오래드 사)을 처리하여 4℃에서 2시간 그리고 -20℃에서 45분 동안 침전시킨 후, 13,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 콜라겐 VII를 수집한 다음 DTT/아세톤을 처리하여 원심분리하였다.
콜라겐 각 타입들을 포함하고 있는 시료들을 TBS 완충액에 넣고 나서, 니트로셀룰로우즈 멤브레인에 옮겼다. 3% 소의 혈청 알부민을 포함하는 TBS 완충액으로 30분 동안 포화시킨 후, TBS 완충액으로 멤브레인을 씻고 나서 1시간 동안 실온에서 배양한 후 일차 항체를 포함하는 용액에 넣고 교반하였다. 0.05% Tween® 20(ICI)을 포함하는 TBS 완충액으로 씻은 후, 멤브레인을 2차 항체에서 1시간 동안 실온에서 교반하면서 배양하였다. 그 후, 증폭 및 추적 키트 옵티-4CN(Opti-4CN) 기질 키트(바이오래드 사)를 이용하여 다음의 설명서에 따라 시그널을 증폭시켰다. 밴드에 대한 이미지 분석 결과, 콜라겐 IV 및 VII의 합성에 대한 노화 방지 활성물질의 유의성 있는 효과는 나타나지 않았다(민감도의 문제).
실시간 정량용 PCR 실험
실시간 정량용 PCR 기술에 따라 재건 모델에서 액틴, 콜라겐 IV 및 VII를 코 딩하는 mRNA를 정량화하였다. 이를 위하여, 콜라겐 IV(231 bp) 및 VII(763 bp) 특이 단편을 증폭할 수 있는 프라이머 및 액틴(541 bp)에 대한 프라이머는 다음과 같다:
센스 콜라겐 IV: 5'-GTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGC-3'
안티센스 콜라겐 IV: 5'-GAATATCCGATCCACAAACTCCGCC-3'
센스 콜라겐 VII: 5'-GCCACAGGATACAGGGTTTC-3'
안티센스 콜라겐 VII: 5'-CACCACACGTAGTTCAATGC-3'
센스 액틴: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'
안티센스 액틴: 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'
실시예 7의 프로토콜에 따라 다음과 같이 처리군 재건 피부 및 미처리군 재건 피부로부터 RNA를 추출하였다.
<<옵티콘, Opticon>> 시스템(MJ 리서치 사)을 이용하여 실시간 RT-PCR에 따라 RT-PCR 반응(Reverse Transcription Polymerase Chain reactions)을 실시하였다.
저장용기에 도입한 반응 혼합액(50 ㎕)은 각 시료에 대해 다음과 같다:
5 ng/㎕ 의 RNA 10 ㎕,
각 프라이머,
역전사 효소 및 DNA 폴리머라아제, 표지 제제 SYBR 그린 I(합성 단계 동안 DNA 이중 가닥에 삽입되는 플루오로포어) 및 MgCl2를 포함하는 반응 혼합액(퀴아젠 사).
RT-PCR의 조건은 다음과 같다:
역전사: 50℃에서 30분,
PCR 반응: 94℃ 15초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 50 사이클.
증폭된 산물의 오염 여부 및 순도는 PCR 증폭 산물의 용해 곡선으로 확인하였다. 상기 산물 중 이중 피크 혹은 비정상적 녹는점을 나타내는 산물은 제거하였다.
분석 및 계산 방법:
PCR 사이클 동안 증폭된 DNA에서 형광강도를 계속적으로 측정하였다. 본 시스템은 PCR 사이클 수에 대한 형강광도 측정 곡선을 얻을 수 있어, 증폭된 DNA의 상대 정량을 평가할 수 있다.
재건 피부에 나타나는 세포 군의 수를 세기 위해, 모든 결과들은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로서, <<액틴>> 시그널로 고려하였다.
실험 시, C(T)(threshold cycle)의 측정 한계치는 T를 0.05 ~ 0.01까지로 고정하고 나서, 임의 측정 단위는 다음 식에 따라 각 유전자에 대해 계산하였다:
S유전자 <<x>> = 107 x (1/2) C(T) 유전자<<x>>
C(T) 유전자 <<x>>는 유전자 <<x>>의 C(T)의 측정 한계치를 의미한다.
특정 유전자 값은 비율로 계산하여 <<액틴>> 시그널로 고려하였다:
R=S유전자<<x>>/S액틴
처리 시료 및 미처리 시료 간의 상기 비율을 비교하였다.
상기에서 얻은 결과로부터, 노화방지 복합체는 성숙 재건 피부 모델에서 콜라겐 IV(+65% p<0.05), VII(+63% p<0.05)를 코딩하는 mRNA의 발현을 유의성 있게 증가시킴을 확인하였다.
실시예 9 : 단일층, 재건 진피 및 재건 피부의 DNA 배열 분석, 소위 <<어린 및 성숙>> 모델 간의 비교
3개의 세포 모델을 제조 시 동일한 패시지의 동일한 세포 스톡을 사용하였다.
ㆍ 실시예 1에 따라 추출된 섬유아세포(35세 미만의 기증자 및 55세 이상의 기증자 3명)를 DMEM/Ham F12 글루타맥스 50/50(v/v) 배지에서 컨플루언스가 될때 까지 단일층으로 배양하였다. 이때, 상기 DMEM/Ham F12 글루타맥스 배지에는 10% 소 혈청, 100 UI/mL 페니실린, 20 ㎍/mL 젠타마이신, 1 ㎍/mL 암포테리신 B가 첨가되어 있다. 트리 시약으로 매트(mat)를 수집하였다.
ㆍ 디페닐포스포릴아자이드로 가교결합시킨 겉으로 드러난 콜라겐 기질에 400,000 개의 섬유아세포(실시예 1의 프로토콜에 따라 각각 추출 및 증폭되며, 35세 미만 기증자 및 55세 이상의 기증자 중 적어도 3명으로부터 유래함)를 파종하여 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 진피인 재건 진피를 제조하였다. 재건 진피를 10% 소 혈청, 1 mM 아스코르브산, 10 ng/mL EGF, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM-글루타맥스 배지에서 15일 간 배양하였다. 트리 시약으로 재건 진피를 수집하였다.
ㆍ 디페닐포스포릴아자이드로 가교결합시킨 겉으로 드러난 콜라겐 기질에 400,000 개의 섬유아세포(실시예 1의 프로토콜에 따라 각각 추출 및 증폭되며, 35세 미만 기증자 및 55세 이상의 기증자 중 적어도 3명으로부터 유래함)를 파종하여 소위 <<어린 및 성숙 재건 피부>>인 재건 피부를 제조하였다. 재건 진피를 10% 소 혈청, 1 mM 아스코르브산, 10 ng/mL EGF, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM-글루타맥스 배지에서 15일 간 배양하였다. 각질화세포(같은 기증자 군에서 유래하며 실시예 1의 프로토콜에 따라 각각 추출 및 증폭됨)를 재건 진피 당 400,000 개의 비율로 파종하였다. 재건 진피를 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율: 3/1 v/v)으로 제조된 증식 배지에서 일주일 동안 계속 배양하였다. 그 후, 재건 피부가 나타나며 이를 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우물린을 제외하고 상기와 같은 조성으로 된 배지에서 추가로 2 주 동안 배양하였다. 트리 시약으로 재건 피부를 수집하였다.
cDNA 배열:
간단히 말해, 3차원 모델에 액체 질소를 넣고 생분쇄기로 분쇄한 후 시료의 RNA를 추출하고 트리 시약(DNA를 완전히 제거)의 프로토콜에 따라 정제하였다.
정제한 RNA를 정성적으로 및 정량적으로 분석하였다.
다음 단계에 따라 바이오틴화된 oligo(dT) 프라이머와 mRNA의 poly(A) 말단을 하이브리디제이션하여 mRNA를 정제하고 아틀라스 퓨어(클론테크 사)의 프로토콜에 따라 스트렙트아비딘 비드를 이용하여 선택적으로 포획하였다. [α33P]-dATP를 첨가한 상태에서 배열 시 고정되어 있는 특이 염기서열을 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 poly(dT)의 비드에 결합된 mRNA의 역전사에 의해 33P로 표지된 DNA 프로브를 제조하였다. 익스클루전 컬럼 크로마토그래피(Exclusion column chromatography)를 사용하여 표지된 프로브를 정제하고 리퀴드 신틸레이션 카운팅(Liquid Scintillation Counting)을 실시하여 프로브의 품질과 등량을 평가하였다.
커스텀 아틀라스(Custom ATLAS) 멤브레인을 미리 처리한 다음 각 멤브레인에 고정되어 있는 cDNA와 표지된 해당 프로브를 하이브리디제이션시켰다(68℃에서 밤새도록). 그 후, 분석하기 전에 필터를 세척하였다.
방사능사진술에 의한 분석 및 사이클론 포스포이미저(팩커드 인스트루먼트; 3시간 후 72 시간 동안 포착) 및 퀀트어레이(팩커드 소프트웨어)를 이용하여 스팟 방사능을 정량화하였다.
실험 조건을 달리하여 특정 유전자를 동정하였다: 청년 기증자 대 장년 기증 자. 그 결과는 단일층 조건, 3차원 단세포 조건 및 3차원 다세포 조건 하에서 성숙 모델과 어린 모델 간의 변이를 퍼센트로 나타내었다.
만약 세포외 기질의 단백질을 주목할 경우, 예를 들어 단일층(x 2.1) 및 재건 진피(x 1.8) 소위 <<어린>> 모델과 비교하여 소위 <<성숙 재건 진피>>에서 피브로넥틴 전구체를 코딩하는 RNA의 양이 증가함을 입증할 수 있었다. 반대로, 재건 피부 모델 소위 <<성숙 재건 피부 모델>>에서, RNA 함량은 재건 피부 모델 소위 <<어린 재건 피부 모델>>에 대해 명백히 감소하였다(1.75). 재건 피부 모델에서 얻은 결과는 다양한 연령의 기증자로부터 피부 시료에 대한 면역조직학적 분석에 의해 얻은 결과들을 완전히 확증하였다. 피브로넥틴 전구체의 RNA의 증가를 나타내는 단일층에서 얻은 결과들은 기증자의 연령뿐만 아니라 단일층으로 배양된 섬유아세포의 패시지 수와 관련하여 mRNA의 증가를 나타내는 mRNA 분석에서 얻은 결과들에 일치한다. 이들 결과들은 사용한 세포 모델에 달려있으며, 단일층 모델 혹은 3차원 단세포 모델은 세포 유형 간의 상호작용과는 관련이 없기 때문에 총체적으로 예견할 수 있는 것은 아니다.
더욱이, 많은 다른 유전자들은 섬유아세포의 단일층, 재건 진피 및 재건 피부에 따라 다른 발현을 가지며 이들 유전자의 발현 수준이 3개의 다른 모델에서 항상 똑같은 것은 아니다. 다음 결과들은 실시예에서 인용될 수 있다(결과는 성숙/어린 세포의 비를 퍼센트로 나타낸 것임):
유전자 섬유아세포 단일층 재건 진피 재건 피부
사이토케라틴 1 118 178 85
알파-2-PRAP & LRPAP 1 292 95 81
유천포창 항원 1 nd nd 232
연골성 특이 프로테오글리칸 코어 단백질, 어그리칸 코어 단백질 전구체, CS 프로테오글리칸 코어 단백질 1 129 155 53
CD44 항원 전구체, ECMIII, LHR, 하이알루론네이트 수용체, HS 프로테오글리칸, 에피칸 77 33 89
CD59 글리코프로테인 전구체, 멤브레인 어택 c< 95 40 83
CD9 항원, P24, 백혈구항원 MIC3, 이동관련단백질 40 124 102
프로콜라겐 3 알파 1 서브유닛 전구체 46 120 46
콜라겐 6 알파 1 서브유닛 285 92 64
콜라겐 6 알파 2 서브유닛 154 99 80
콜라겐 16 알파 1 서브유닛 전구체 139 48 79
엘라스틴 전구체 36 nd nd
내피 플라스미노겐 활성제 억제제 1 전구체 95 252 87
피브로넥틴 전구체 209 177 57
하이알루로난 신타아제 2 109 282 189
인볼루크린 nd nd 260
LRP1, 알파 2 마크로글로불린 수용체, 아폴리포프로테인 E 수용체, CD91 항원 226 187 65
루미칸 전구체, 카라탄 설페이트 프로테오글리칸, LDC 95 21 109
MMP11, 스트로멜리신 3 189 217 63
MMP16 전구체, 멤브레인 타입 매트릭스 메탈로프로티나아제 3, MMP-X2 129 201 135
MMP3, 스트로멜리신 1 전구체 7 117 143
TIMP1, EPA, 섬유아세포 콜라게나아제 억제제 40 49 74
TIMP3, 마이토젠 유도 유전자 5 49 210 173
PAI-2, 단핵세포 ARG-세르핀, 우로키나아제 억제제 nd 88 333
SPARC, 오스테오넥틴, BM40 65 135 50
뼈 유래 성장 인자 1 213 141 93
시스테인이 풍부한 섬유아세포 성장 인자 수용체, 골지체 막 시알로글리코프로테인 MG160 101 124 49
TIS11B 단백질, BRF1, EGF 반응인자 1 237 165 78
신경교 유래의 축삭 촉진 인자 49 137 53
유전자 섬유아세포 단일층 재건 진피 재건 피부
GCP2, 중성구 촉진 펩티드 ENA-178 nd nd 562
성장 억제 인자, 메탈로티오네인 III 66 148 161
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 3 전구체 131 291 91
IL1 알파 전구체, 헤마토포이에틴 1 nd nd 161
IL1 수용체 길항 단백질 전구체 nd 88 156
IL1 수용체 타입 II 전구체 nd nd 512
IL12 베타 서브유닛 전구체 137 173 81
IL3 전구체, MCS 이자, MCGF, P-세포 촉진 인자, 조혈생장인자 114 180 75
IL6 전구체, BSF2, IFN 베타 2, 하이브리도마 생장인자 86 293 84
IL8 전구체, MDNCF, NAP1, LYNAP, 단백질 3-10C nd 121 737
KGF, FGF7 65 150 50
MIF, GIF 35 193 121
칼그라눌린, 백혈구 L1 중쇄, S100A9, MRP14 nd nd 1981
칼그라눌린 A, MRP8, 백혈구 L1 연쇄, S100A8 nd nd 4593
MCP1, MCAF, SCYA2 94 174 289
팍실린 154 160 71
태반 성장 인자 1 & 2 90 188 388
PDFGA 서브유닛 전구체 nd nd 397
PDGF 수용체 알파 서브유닛 49 118 50
플레이오트로핀 전구체, 골아세포 특이 인자 1, HBNF1, HB-GAM, HB-GF8 84 143 49
티로신 카이네아제 수용체 관련 유전자 122 159 80
ρ-관련 GTP-결합 단백질 132 88 188
티모신 베타 10, PTMB10 44 139 138
TNF 유도성 단백질, 하이알루론네이트 결합 단백질 nd nd 482
VEGF B 전구체, 혈관투과인자 105 230 114
자이신 2 152 75 114
HSP-90, HSP84, HSPCB 97 40 107
HSP3, HSP17, HSPL27 97 168 95
세포질 SOD1 88 47 120
SOD2 88 47 120
메탈로티오네인 IH, MO0, MT1l, MT2, MT1L, MT1R 53 127 150
따라서, 본 발명의 방법은 피부 노화 동안 다양한 물질의 합성을 보다 잘 이해할 수 있도록 하며 노화 동안 관찰되는 변형을 한정하거나 혹은 억제할 수 있는 활성원을 선별할 수 있는 효과가 있다.
실시예 10 : 소위 <<어린 및 성숙 재건 피부>> 모델에서 피브로넥틴을 코딩하는 mRNA의 노던 블랏 분석
콜라겐-GAG-키토산 기질에 400,000 개의 섬유아세포(실시예 1의 프로토콜에 따라 각각 추출 및 증폭되며 35세 미만의 기증자 및 55세 이상의 기증자 중 적어도 3명에서 유래함)를 파종하고 DMEM-글루타맥스 배지에서 15일 간 배양하여 어린 및 성숙 재건 피부를 제조하였다. 이때, DMEM-글루타맥스 배지에는 10% 소 혈청, 1 mM 아스코르브산, 10 ng/mL EGF, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다. 실시예 1의 프로토콜에 따라 각각 추출 및 증폭된 같은 기증자 군에서 유래한 각질화세포를 재건 진피 당 400,000 개의 비율로 파종하고 이를 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율: 3/1 v/v)으로 제조된 증식 배지에서 일주일 동안 계속 배양하였다. 그 후, 재건 피부가 나타나며 이를 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우물린을 제외하고 상기와 같은 조성의 배지에서 추가로 2주 동안 배양하였다. 트리 시약으로 시료들을 수집하였다.
실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 총 RNA를 추출하였다. 260 nm에서 밀도계측법(densitometry)에 따라 RNA를 정량한 후, 1 ㎍/mL 농도의 RNA가 되도록 조정하였다. 그 후, 3 ~ 10 ㎍의 각 시료를 분리하기 위해 아가로우즈/포름알데히드 젤에 배치한 다음, 모세관을 사용하여 하이본드-N-나일론(아머샴 사) 멤브레인에 RNA를 밤새도록 트랜스퍼하였다. 80℃에서 90분 동안 가열하여 RNA를 나일론에 공유결합시켰다. 멤브레인을 0.1 mg/mL이 되도록 8 mL의 엑스프레스하이브(Expresshyb, 클론테크 사)에 넣고 68℃에서 20분 간 미리 하이브리디제이션시킨 다음, 표지한 프로브를 첨가하여 68℃에서 밤새도록 하이브리디제이션시켰다. 배양 말기에, 1% SDS를 포함하는 2 x SSC 용액으로 멤브레인을 68℃에서 30분 간 4회 세척한 다음, 0.5% SDS를 포함하는 0.1 x SSC 용액으로 68℃에서 한 번 세척하고 마지막으로 2 x SSC 용액으로 세척하였다. 포스포이미저(팩커드 인스트루먼츠)를 이용하여 스팟의 방사능을 직접 카운팅함으로써 RNA를 정량할 수 있다. 그 결과는 액틴 시그널과 비교하여 발현 정도를 퍼센트로 나타냈다. 피브로넥틴을 코딩하는 mRNA에 대한 노던 블랏 정량 분석 결과, 소위 <<어린>> 재건 피부 모델과 비교하여 소위 <<성숙>> 재건 피부 모델에서는 mRNA가 감소하였다.
실시예 11 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 피부 모델에서 콜라겐 VII의 웨스턴 블랏 분석
실시예 1의 프로토콜에 따라 각각 추출 및 증폭된 400,000 개의 패시지 2의 <<어린>> 세포(트립신 처리 후 두 번 증폭) 및 패시지 12의 <<성숙>> 세포(트립신 처리 후 열두 번 증폭)를 콜라겐-GAG-키토산 기질에 파종하고 DMEM-글루타맥스 배지에서 15일 동안 배양하여 <<어린 및 성숙>> 재건 진피를 제조하였다. 이때, DMEM-글루타맥스 배지에는 10% 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B 및 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다. 실시예 1의 프로토콜에 따라 패시지 1의 <<어린>> 각질화세포 및 패시지 3의 <<성숙>> 각질화세포를 각각 추출하고 증폭한 후, 재건 진피 당 400,000 개의 비율로 파종한 다음, 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율: 3/1 v/v)으로 제조된 증식 배지에서 일주일 동안 계속 배양하였다. 그 후, 재건 피부가 나타나며 이를 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우물린을 제외하고 상기와 같은 조성의 배지에서 추가로 2주 동안 배양하였다.
실시예 8의 프로토콜에 따라 콜라겐 VII를 추출하고 전기영동 완충액(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 10% 글리세롤, 2% SDS, 5% 머캅토에탄올)으로 녹였다. 95℃에서 5분 간 상기 시료를 가열하였다. 5% SDS-PAGE에서 크기에 따른 분획을 실시하고 폴리비닐아이덴 플루오라이드 멤브레인에 트랜스퍼하였다. 정제한 콜라겐 VII에 대한 대조군은 분자량에 대한 표준물질뿐만 아니라 추출 시료와 동시에 제조하였다.
트랜스퍼 후, 멤브레인을 블럭 완충액(15 nM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0.5% Tween 20, 3% BSA, pH 7.4)에서 한 시간동안 배양하였다. 콜라겐 VII에 대한 일차 항체(폴리클로날 래빗 1/1000)를 1% PBS/BSA 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 후, 블럭 완충액으로 멤브레인을 씻고 안티 래빗 IgG가 결합된 2차 항체(Horseradish peroxidase, HRP)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 씻은 후, 멤브레인을 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 용액으로 현상하였다. 약하게 표지한 경우, 증폭 키트(바이오래드 사)를 사용한 후 추적 키트 옵티-4CN 기질 기트(바이오래드 사)를 사용할 수 있다.
추적 후, 멤브레인을 물로 몇분 동안 씻은 후 흡수지로 건조시켰다.
이미지 분석에 따라 밴드의 강도 분석을 실시한 결과, 다양한 연령의 시료 추출물에서 얻은 콜라겐 VII의 함량이 유의성 있게 감소함을 입증하였다.
실시예 12 : 단일층의 각질화세포의 DNA 배열 분석 및 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 표피 모델과의 비교
3 개의 세포 모델을 제조 시 동일한 패시지의 동일한 세포 스톡을 사용하였다.
실시예 1에 따라 추출된 35세 미만의 기증자 및 55세 이상의 기증자 중 3명에서 유래한 각질화세포를 K-SFM(기브코 사) 배지에서 컨플루언스가 될때 까지 단일층으로 배양하였다.
DMEM-글루타맥스/Ham F-12 (비율: 3/1, v/v) 배양 배지에서 섬유아세포 층 아래에 영양물질로 미리 파종한 보이덴 챔버 유형의 인서트(멤브레인의 구멍 크기 0.4 ㎛ 및 직경 25 mm)에 실시예 1에 따라 35세 미만 기증자 및 55세 이상 기증자 중 3명에서 유래한 패시지 1까지 증폭한 소위 <<어린>> 각질화세포를 4 x 106 개의 비율로 파종하고 3일 내지 8일 동안 액체 배양하여 재건 표피를 제조하였다. 이 때, DMEM-글루타맥스/Ham F-12 배양 배지에는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B, 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다.
각질화세포 배양액을 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우물린을 제외하고 액체 배양용 배지와 동일한 배지에서 12일 내지 18일 동안 에어-리퀴드 인터페이스에 두었다.
실험 말기에, 인서트에서 보이는 각질화세포 단일층과 재건 표피를 긁어낸 후 수집하여 트리 시약에 넣고 클로로포름으로 추출하였다. 4℃, 12,000 x g에서 15분 간 원심분리한 후, RNA는 상층부에, DNA는 하층부에, 단백질은 중간부분에 나타났다.
실시예 9에 따라 cDNA 배열을 제조하였다. 그 결과는 다음에 나타내었다(RE=relative unit of expression):
단일층의 각질화세포 어린 RE 성숙 RE A/Y %
단백질/유전자 명
안티키모트립신-알파-1(AACT;ACT) 3.0 10.5 351
사이토케라틴 18(CYK18;CK18) 타입 I 세포골격성 18 케라틴(KRT18;K18) 7.4 3.0 41
S100 칼슘 결합 단백질 A4; 태반의 칼슘 결합 단백질; 칼바스쿨린;MTS1 단백질 6.5 17.8 273
S100 칼슘 결합 단백질 A7; 프소리아신 10.3 3.1 30
트로포마이오신, 골격 근육, 알파 서브유닛 9.0 27.5 305
비멘틴(VIM) 20.2 41.0 203
피브로넥틴(FN) 18.3 53.4 291
내피성 플라스미노겐 활성제 억제제, 타입 1(PAI1; PLANH1) 10.7 32.4 302
신데칸-4; 암피글리칸; 리오도칸 코어 단백질 11.3 22.7 200
조직 메탈로프로티네아제 1 억제제(TIMP1); 적혈구 강화 활성(EPA); 섬유아세포 콜라게나아제 억제제 3.7 9.1 247
스테로이드 5-알파 리덕타아제 1(SRD5A1); 3-옥소-5-알파 스테로이드 4 디하이드로게나아제 1 3.8 8.0 212
뼈 유래의 성장 인자 1(BPGF1) 4.8 12.7 265
양이온 독립 만노우즈-6-포스페이트 수용체(CI man-6-P receptor; CI-MPR); 인슐린 유사 성장 인자 II 수용체(IGFR II) 3.8 8.2 218
전사인자 SREB1; 스테롤 조절 요소와 결합한 전사 인자 1; SREBP1 6.9 3.3 49
관상 내피 성장인자(VEGF); 관투과 인자(VPF) 6.7 3.0 45
칼모듈린 유사 피부 단백질(CLSP) 24.8 6.1 25
단일층의 각질화세포 어린 RE 성숙 RE A/Y %
단백질/유전자 명
안티키모트립신 알파 1(AACT;ACT) 106.4 37.3 35
칼슘 결합 단백질 p22; 칼슘 결합 단백질 CHP 3.0 7.2 238
코르네오데스모신(CDSN); S 단백질 3.0 6.8 6.8
사이토케라틴 10(K10); 골격성 10 케라틴 타입 I 28.6 82.5 289
사이토케라틴 19(K19; CK19); 골격성 19 케라틴 타입 II 46.1 3.0 7
사이토케라틴 6B(CK 6B; KRT6B; K6B); 골격성 6B 케라틴 타입 II 16.8 33.9 202
사이토케라틴 7(K7;CK7); 골격성 7 케라틴 타입 II 131.3 9.7 7
데스모콜린 2A/2B(DSC2); 접착반 당단백질 II/III 3.0 15.7 524
데스모글레인 1(DSG1); 접착반 당단백질 1(DG1) 3.0 16.1 537
데스모글레인 3(DSG3); 130 kDa 심상성천포창 항원(PVA) 16.2 35.5 219
데스모플라킨 I & II(DSP; DPI & DPII) 23.0 53.7 233
인테그린 알파 6(ITGA6); VLA6; CD49F 항원 7.4 15.9 215
리보뉴클라아제/안지오게닌 억제자(RAI; RNH); 태반 리보뉴클라아제 억제제 5.1 14.4 284
트로포마이오신, 골격 근육, 알파 서브유닛 21.1 8.0 38
골 프로테오글리칸 II(PGS2); 데코린(DCN) 5.0 10.7 213
세포 기질 접합 조절자(CMAR;CAR) 8.7 3.1 35
콜라겐 1 알파 1 서브유닛(COL1A1) 6.0 3.0 50
피브로넥틴(FN) 12.4 5.3 43
단일층의 각질화세포 어린 RE 성숙 RE A/Y %
단백질/유전자 명
하이알루로난 신타아제 3(HAS-3) 3.0 6.8 228
라미닌 베타 2 서브유닛(라미닌 B2; LAMB2); S-라미닌 7.0 27.0 387
매트릭스 메탈로프로티나아제 1(MMP1); 장내 콜라게나아제(CLG); 섬유아세포 콜라게나아제 3.0 52.2 1739
매트릭스 메탈로프로티나아제 11(MMP11); 스트로멜리신 3 8.9 23.7 266
매트릭스 메탈로프로티나아제 2(MMP2); 72kDa 젤라티나아제 A; 72kDa 콜라게나아제 IV(CLG4A); TBE-1 3.0 9.4 314
매트릭스 메탈로프로티나아제 3(MMP3); 스트로멜리신 1(STMY1;SL1); 트랜신 1 8.1 82.6 1023
매트릭스 메탈로프로티나아제 7(MMP7); 매트릴리신 16.9 3.0 18
태반 플라스미노겐 활성자 억제자 타입 2(PAI-2; PLANH2); 단핵세포 ARG-세르핀; 우로키나아제 억제제 3.0 12.9 429
조직 타입 플라스미노겐 활성제(T-plasminogen activator;TPA) 11.5 3.0 26
테나신(TN); 헥사브라키온(HXB); 사이토탁틴; 뉴로넥틴;GMEM; 마이오텐디너스 항원(miotendinous antigen); 신경교종-결합 세포외 매트릭스 항원 4.0 18.9 476
조직 메탈로프로티나아제 1 억제제(TIMP1); 백혈구 강화 활성(EPA); 섬유아세포 콜라게나아제 억제제 13.5 34.6 257
3-하이드록시-3-메틸글루타릴-조효소 A 리덕타아제9HMG-CoA reductase;HMGCR) 3.0 14.4 481
태반 알칼라인 포스파타아제 타입 3 8.4 17.7 210
사이토크롬 P450 리덕타아제 5.2 10.4 202
지방산 신타아제(FAS) 6.3 14.0 222
락테이트 디하이드로게나아제 M 체인 10.6 22.0 206
오르니틴 디카복실라아제(ODC) 4.1 24.6 604
S-아데노실메티오닌 신세타아제 감마 형(EC2.5.1.6); 메티오닌 아데노실트랜스퍼라아제; ADOMET 합성효소; MAT-II 3.0 8.7 291
섬유아세포 성장인자 8(FGF8); 안드로겐 유도 성장인자(AIGF); HBGF8 3.3 15.3 467
인슐린 유도 단백질 1 3.0 25.4 847
인터루킨-1-수용체 길항 단백질(IL-1RA; IRAP) 5.8 19.4 335
인터루킨-6(IL-6); B-세포 촉진인자 2(BSF2); 인터페론 베타-2(IFNB2); 하이브리도마 성장인자 3.0 29.7 992
인터루킨-8(IL-8); 단핵세포 유도 중성구 주화성 인자(MDNCF); T-세포 주화성 인자; 중성구 활성화 단백질 1(NAP1); 림프구 유래 중성구 활성화 인자(LYNAP); 단백질 3-10C 3.8 44.6 1171
대식세포 억제성 사이토카인 1(MIC1) 49.9 14.6 29
라스 동형유전자 구성원 C(RHOC; ARHC); ARH9; H9 15.3 7.6 50
라스 관련 C3 보툴리누스 독소 기질 1(RAC1); RAS-유사 단백질 TC25 5.5 13.6 249
ρ-GDP 분해 억제자 2(RHO GDI2; RHO-GDI β); LY-GDI; ARHGDIB;GDID4 12.8 3.0 23
ρ-관련 GTP 결합 단백질 RhoE; Rho8; ARHE 7.0 22.5 321
전사인자 AP-1; c-jun 프로토-온코진; 조류육종바이러스 17 온코진 호몰로그 11.2 35.7 318
전사인자 C/EBP 알파(CEBPA); CCAAT/알파와 결합하는 인핸서 단백질 3.0 6.8 228
전사인자 NF-κ-B p100; 핵 인자NF-κ-B p100 서브유닛; 핵 인자 NF-κ-B p52 서브유닛;H2TF1; 온코진 lyt-10 3.0 6.9 231
단일층의 각질화세포 어린 RE 성숙 RE A/Y %
단백질/유전자 명
관 내 성장인자(VEGF); 관투과 인자(VPF0 3.0 14.0 467
표피 지방산 결합 단백질 5(FABP5; EFABP); 건선 결합 지방산 결합 단백질 호몰로그(PAFABP) 3.0 9.8 327
겔솔린; 액틴 탈중합 효소(ADF); 브레빈 18.4 9.1 50
세린 팔미토일 트랜스퍼라아제 3.9 7.8 203
스몰 프롤린 풍부 단백질 1B(코르니핀) 147.3 314.8 214
글루타티온 페록시다아제(GSHPX1; GPX1) 36.8 15.5 42
HSP70.1; 70 kDa 히트 쇼크 단백질 1(HSPA1) 13.9 41.1 297
HSPA9B; 미토콘드리아 스트레스-70 단백질; 75 kDa 글루코우즈 조절 단백질(GRP75); 펩티드 결합 단백질 74(PBP74); 모탈린(MOT) 3.7 8.7 238
따라서, 본 발명 방법은 표피 노화 동안 다양한 물질들의 합성을 보다 잘 이해할 수 있도록 하며, 표피 노화 동안 관찰되는 변형을 억제하거나 혹은 한정할 수 있는 활성원을 선별할 수 있다.
실시예 13 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 피부에 국소적으로 사용하는 화장료 활성물질의 효능 검사
DMEM-글루타맥스 배양 배지에서, 실시예 1에 따라 추출하여 패시지 6까지 증폭시킨 소위 <<어린>> 섬유아세포(가슴 생검에서 추출함) 및 <<성숙>> 섬유아세포(얼굴 리프팅 후 얻은 얼굴 생검에서 추출함) 600,000 개를 콜라겐-글리코스아미노글리칸-키토산으로 된 피부 기질에 21일 동안 파종하였다. 이때, DMEM-글루타맥스 배양 배지에는 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B 및 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가되어 있다.
그 후, 600,000 개의 각질화세포 소위 <<어린>> 각질화세포(가슴 생검에서 추출함) 및 <<성숙>> 각질화세포(얼굴 리프팅 후 얻은 얼굴 생검에서 추출함)를 실 시예 1에 따라 팩시지 1까지 증폭하고 10% 하이클론 II 소 혈청, 1 mM 아스코르브산-2-포스페이트, 10 ng/mL EGF, 0.4 ㎍/mL 하이드로코르티손, 0.12 UI/mL 우물린, 0.4 ㎍/mL 이수프렐, 2 x 10-9 M 트리아이오도티로닌, 24.3 ㎍/mL 아데닌, 100 UI/mL 페니실린, 1 ㎍/mL 암포테리신 B 및 20 ㎍/mL 젠타마이신이 첨가된 DMEM-글루타맥스/Ham F-12(비율: 3/1, v/v) 배양 증식 배지에서 피부 등가물에 5일 간 파종하였다.
그 후, 배양물을 소 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리아이오도티로닌 및 우물린을 제외하고 액체배양에 사용된 것과 같은 조성으로 된 분화용 배지에서 14일 동안 에어-리퀴드 인터페이스에 두었다.
화장료 위약 제형 및 활성물질을 3% 포함하는 화장료 제형 8 ㎕를 재건 피부 소위 <<어린 및 성숙 재건 피부>>에 처리하였다. 분화 배지에서 2일 후, 재건 피부에서 화장료 제형을 조심스럽게 제거하고 동량의 새 제형으로 대체하였다. 상기 과정을 7번 반복하였다. 즉, 추가로 14일 간 배양하였다. 실험 말기에, 재건 피부에서 화장료 제형을 조심스럽게 제거하고, PBS로 상기 재건 피부를 씻은 다음 트리 시약에 넣었다. 화장료 활성물질을 포함한 제형의 처리 효능은 실시예 9의 프로토콜에 따라 <<cDNA 배열>>로 평가하였다.
실시예 14 : 소위 <<어린 및 성숙>> 재건 진피 모델에서 전신투여한 화장료 활성물질의 효능 검사
실시예 12에서, 성숙세포를 이용한 모델과 비교하여 소위 성숙세포를 이용한 모델에서 피브로넥틴의 함량이 감소함을 입증하였다(43% 감소).
재건 진피는 실시예 9에 따라 제조하였다. 델리너®(Deliner®, 옥수수 추출물, 꼴레띠까 사)를 배양 배지에 2%로 첨가하고 이틀마다 바꿔주었다. 배양 배지를 모은 다음, 실시예 8에 기재된 닷 블랏후 이미지 분석을 실시하여 피브로넥틴의 함량을 정량하였다. 피브로넥틴의 함량은 25% 증가하였다. 따라서, 실제로 델리너®는 노화로 인한 피브로넥틴의 합성 감소를 억제할 수 있다.
본 발명은 적어도 하나의 생물학적 지표의 예상변형 동정방법에 관한 것으로, 본 발명은 어린 생체세포, 성숙 생체세포 및 세포 노화로 변형되는 적어도 하나의 생물학적 지표를 동정할 수 있는 3차원 조직 모델에 사용되는 상기 두 종류의 세포 중 적어도 하나에 대한 단백질분해 및/또는 전사 및/또는 유전자 비교분석을 포함한다. 또한, 본 발명은 노화 동안 변형된 적어도 하나의 생물학적 지표를 역전시키거나 억제할 수 있는 적어도 하나의 잠재적 활성물질을 선별하기 위한 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Claims (24)

  1. 적어도 한 종류의 세포는 3차원 조직 모델로 사용되는 어린 생체피부세포와 성숙 생체피부세포에 대한 전사 또는 유전자 분석을 비교하여 피부세포 노화로 변형되는 하나 이상의 생물학적 지표를 동정할 수 있는 것을 특징으로 하는 하나 이상의 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 어린피부세포 및 성숙피부세포는 둘 다 3차원 조직 모델에 사용됨을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  3. 제 1항에 있어서, 세포 노화 동안 변형되는 상기 생물학적 지표는 어린피부세포 및 성숙피부세포의 대사 간의 하나이상의 차이로 인해 한정됨을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어린세포는 45세 미만의 청년 기증자의 생검에서 유래한 피부세포, 시험관 내에서 패시지(passage) 수가 10 미만인 섬유아세포, 시험관 내에서 패시지(passage) 수가 6 미만인 멜라닌세포, 시험관 내에서 패시지(passage) 수가 2 미만인 각질화세포 혹은 태양 광선에 노출되지 않은 생검 즉, 신체, 가슴, 배, 포피에서 취한 피부세포에서 유래함을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙세포는 45세 이상의 장년 기증자의 생검에서 유래한 피부세포, 시험관 내에서 패시지 수가 10 이상인 섬유아세포, 시험관 내에서 패시지 수가 6 이상인 멜라닌세포, 시험관 내에서 패시지 수가 2 이상인 각질화세포, 또는 태양에 노출된 부분 즉, 머리카락, 얼굴, 목, 목덜미에서 취한 생검에서 유래한 피부세포임을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙세포는 한 달 동안 인위적으로 노화된 하나 이상의 세포 유형을 포함하는 3차원 조직 모델 내에 포함된 어린 피부세포임을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 어린세포 혹은 소위 성숙세포는 한명 이상의 인간 혹은 하나 이상의 동물에서 유래한 세포임을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 분석은 다음의 분석방법으로부터 선택되는 하나 이상의 분석을 포함함을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법:
    DNA 배열, 중합효소연쇄반응-복합형(PCR-multiplex), PCR 또는 실시간 PCR(real time-PCR)을 포함한 유전자 프로필 분석용 분석,
    RNA 배열, cDNA 배열, 역전사-중합효소연쇄반응-복합형 PCR(RT-PCR multiplex), 역전사-PCR 또는 실시간 역전사-PCR을 포함한 전사 프로필 분석용 분석.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 조직 모델은 세포 대사를 유지하는 조건 하에서 배양되거나 혹은 보존됨을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 조직 모델은 각질화세포를 포함함을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  11. 제 1항 또는 제 10항에 있어서, 상기 모델은 정상, 건강 혹은 병원성 인간 또는 동물 피부세포 혹은 세포주에서 유래한 인간 또는 동물 피부세포임을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 조직 모델은 결합 기질 모델, 피부의 경우 진피, 스트로마세포를 포함하는 점막의 경우 장막, 상피세포로 구성된 상피 모델, 각질화세포로 구성된 표피 모델, 표피와 진피로 구성된 피부 모델, 상피와 장막으로 구성된 점막 모델로부터 선택됨을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 조직 모델은 다음에서 선택되는 기질 지지체를 포함하는 결합 기질로 된 조직 모델임을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법:
    반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인, 테프론 스폰지, 폴리카보네이트 반투과성 멤브레인, 폴리에틸렌 반투과성 멤브레인, 폴리프로필렌 반투과성 멤브레인, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 반투과성 멤브레인, 반투과성 아노포어(AnoporeTM) 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 멤브레인, 셀룰로우즈 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CMTM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인으로 구성된 군으로부터 선택되는 스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하는 비활성 지지체,
    세포 배양액을 처리한 성형물,
    스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하는 하이알루론산, 콜라겐, 피브로넥틴 또는 피브린으로 된 젤 혹은 멤브레인,
    글리코스아미노글리칸 또는 키토산을 하나 이상 포함할 수 있는 콜라겐으로 제조되며, 스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하는 다공성 기질.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 조직 모델은 다음에서 선택되는 기질 지지체를 포함하는 표피 조직 모델 혹은 상피 조직 모델임을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법:
    반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인, 테프론 스폰지, 폴리카보네이트 반투과성 멤브레인, 폴리에틸렌 반투과성 멤브레인, 폴리프로필렌 반투과성 멤브레인, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 반투과성 멤브레인, 반투과성 아노포어TM 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 멤브레인, 셀룰로우즈 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CMTM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인으로 구성된 군으로부터 선택되며, 스트로마세포 또는 섬유아세포를 미리 파종하고 나서 상피세포 또는 각질화세포를 파종한 비활성 지지체,
    콜라겐 하이알루론산, 피브로넥틴 또는 피브린으로 제조되며 스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하는 젤,
    글리코스아미노글리칸 또는 키토산을 포함할 수 있는 콜라겐으로 제조되며, 스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하는 다공성 기질,
    인간 혹은 동물 유래의 탈표피화된 진피 혹은 죽은 진피.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 조직 모델은 상피 세포, 색소 세포, 면역강화세포 및 신경세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 추가로 포함함을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 조직 모델은 다음으로부터 선택되는 기질 지지체를 포함하는 상피세포로 파종된 재건 점막 혹은 각질화세포로 파종된 재건 피부임을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법:
    스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하며, 반투과성 니트로셀룰로우즈 멤브레인, 반투과성 나일론 멤브레인, 테프론 멤브레인, 테프론 스폰지, 폴리카보네이트 반투과성 멤브레인, 폴리에틸렌 반투과성 멤브레인, 폴리프로필렌 반투과성 멤브레인, 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 반투과성 멤브레인, 반투과성 아노포어(Anopore) 무기 멤브레인, 셀룰로우즈 아세테이트 멤브레인, 셀룰로우즈 에스테르(HATF) 멤브레인, 반투과성 바이오포어-CM 멤브레인, 반투과성 폴리에스테르 멤브레인으로 구성된 군으로부터 선택되는 비활성 지지체,
    스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하는 하이알루론산, 콜라겐, 피브로넥틴 또는 피브린으로 된 젤,
    스트로마세포 또는 섬유아세포를 포함하며, 글리코스아미노글리칸 또는 키토산을 포함할 수 있는 콜라겐으로 제조된 다공성 기질,
    인간 혹은 동물 유래의 탈표피화된 진피 혹은 죽은 진피.
  17. 제 1항에 있어서, 상기에서 사용된 조직 모델은 하나 이상의 세포유형으로서 내피세포; 림프구, 대식세포, 수지상돌기 세포와 같은 면역세포; 지방세포; 또는 체모, 머리카락, 피지세포와 같은 피부 부가물이 추가로 결합되어 있는 모델을 포함함을 특징으로 하는 생물학적 지표의 시험관내에서의 예상변형 동정방법.
  18. 삭제
  19. 다음을 포함함을 특징으로 하는 피부세포의 노화 동안 변형되는 하나 이상의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 하나 이상의 잠재적 활성물질을 선별하기 위한 방법:
    a) 상기 잠재적 활성물질을 성숙피부세포와 접촉하도록 배치하여 상기 잠재적 활성물질이 작용하도록 세포 모델 혹은 조직 모델에 이들을 파종하고,
    b) 어린피부세포를 세포 모델 혹은 조직 모델에 파종하고,
    c) 상기 성숙피부세포의 피부 세포 대사 동안 상기 물질의 작용을 연구하기 위해 부분적으로 혹은 전체적으로 전사 분석 또는 유전자 분석을 실시하고,
    d) 잠재적 활성물질이 있는 상태에서 상기 성숙피부세포의 피부세포 대사와 상기 물질이 없는 상태에서 상기 성숙피부세포 혹은 어린피부세포의 대사를 비교하고,
    e) 피부세포의 노화 동안 변형되는 것으로 확인된 생물학적 지표의 변형을 억제하기 위해 주로 상기 물질의 양성 혹은 음성 효과를 동정하여 상기 잠재적 활성물질의 활성의 유무를 동정함.
  20. 다음을 포함하는 노화 동안 변형된 하나 이상의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 하나 이상의 잠재적 활성물질의 동정방법:
    a) 제 4항에서 정의된 어린피부세포를 배양하여 대조군으로 사용하고,
    b) 어린피부세포의 대사를 회복하기 위해 상기 잠재적 활성물질이 상기 피부세포의 피부 세포 대사에 작용하도록 하나 이상의 잠재적 활성물질이 있는 상태에서 소위 어린피부세포에 대해 변형된 생물학적 지표를 갖는 제 5항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 기재된 성숙피부세포를 배양하고,
    c) 활성물질이 있거나 혹은 없는 상태에서 배양된 성숙피부세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 전사 분석 또는 유전자 분석을 실시하고,
    d) a)의 잠재적 활성물질 없이 배양된 살아있는 어린생체 피부세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 전사 분석 또는 유전자 분석을 실시하여 c)에서 실시한 분석과 서로 비교하고,
    e) 피부세포의 노화에 의해 변형된 하나 이상의 생물학적 지표를 역전시킬 수 있는 하나 이상의 활성물질을 동정한 후 c)와 d)에서 실시한 분석들을 서로 비교함.
  21. 다음을 포함하는 노화 동안 변형된 하나 이상의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 하나 이상의 잠재적 활성물질의 동정방법:
    a) 상기 잠재적 활성물질을 성숙피부세포와 접촉하도록 배치하여 상기 활성물질이 작용하도록 조직 모델에 이들을 파종하고,
    b) 이들 물질들이 서로 접촉하도록 놓인 성숙피부세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 전사 분석 또는 유전자 분석을 실시하고,
    c) 상기 잠재적 활성물질이 없는 상태에서 배양된 생체세포에 대해 부분적으로 혹은 전체적으로 실시된 전사 분석 또는 유전자 분석과 b) 단계에서 실시한 분석과 비교하고,
    d) 노화 동안 변형된 하나 이상의 생물학적 지표의 변형을 억제할 수 있는 활성물질 하나 이상을 동정한 후 c) 단계에서 실시한 분석들을 비교함.
  22. 삭제
  23. 옥수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화방지를 위한 화장료용 조성물에 있어서, 상기 옥수수 추출물은 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 따라 선별될 수 있는 것임을 특징으로 하는 피부노화방지를 위한 화장료용 조성물.
  24. 옥수수 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부노화방지를 위한 화장료용 조성물.
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