JP2008022863A - ストレスにさらされている生細胞とさらされていない生細胞とを用いた少なくとも1つの生物学的パラメーターに結果的に生じた変化の同定法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、少なくとも1つの生物学的パラメーターに結果的に生じた変化を同定する方法であって、
a)若い生細胞について
b)加齢した生細胞について
c)三次元組織モデルで用いられる上記2種類の細胞のうち少なくとも1種について
比較プロテオーム解析、比較トランスクリプトーム解析及び/又は比較ゲノム解析を行い、細胞の加齢により更に変化が生じる少なくとも1つの生物学的パラメーターを結果的に同定することを可能にする方法に実質的に関する。
本発明は、活性源をスクリーニングするために上記方法を使用することを含む。
【選択図】なし
Description
a)若い生細胞について
b)加齢した生細胞について
c)三次元組織モデルで用いられる上記2種類の細胞のうち少なくとも1種について
比較プロテオーム解析、比較トランスクリプトーム解析及び/又は比較ゲノム解析を行い、細胞の加齢により変化が生じる少なくとも1つの生物学的パラメーターを結果的に同定することを可能にする方法に実質的に関する。
a)若い生細胞について
b)加齢した生細胞について
c)三次元組織モデルで用いられる上記2種類の細胞のうち少なくとも1種について
比較プロテオーム解析、比較トランスクリプトーム解析及び/又は比較ゲノム解析を行い、細胞の加齢に対して更に変化が生じる少なくとも1つの生物学的パラメーターを結果的に同定することを可能にすることを特徴とする方法を提供するという新規の技術的な問題を解決することを目的とする。
1)再構成上皮(再構成表皮を含む)、色素細胞を含む及び/又は免疫担当性の、再構成上皮、結合性マトリックス(絨毛膜、真皮を含む)、再構成皮膚又は粘膜、色素細胞を含む及び/又は免疫担当性の再構成皮膚又は粘膜、色素細胞を含む及び/又は免疫担当性の及び/又は内皮化した及び/又はマクロファージを含有する、再構成皮膚又は粘膜、生検材料
もう一方では、以下のモデル:
2)単層又は懸濁状態で培養した、上記のモデル又は上記の様々なモデルを作っている細胞
から選択されるモデルの間で行い、
上記の比較は以下の若い細胞と加齢細胞:
・「若い細胞」と呼ばれる細胞、すなわち、若いドナー由来の生検材料から抽出した細胞、in vitroであまり増幅されていない細胞、又は、太陽にさらされていない部位の体(胴体、胸部、腹部、包皮等)由来の生検材料から抽出した細胞
・「加齢細胞」と呼ばれる細胞、すなわち、加齢したドナー由来の生検材料から抽出した細胞、in vitroで何度も増幅された細胞、又は、太陽にさらされる部位の体(首、顔、手等)由来の生検材料から抽出した細胞
の間で行う。
a)若い生細胞について
b)加齢した生細胞について
c)三次元組織モデルで用いられる上記2種類の細胞のうち少なくとも1種について
比較プロテオーム解析、比較トランスクリプトーム解析及び/又は比較ゲノム解析を行い、細胞の加齢に対して更に変化が生じる少なくとも1つの生物学的パラメーターを結果的に同定することを可能にすることを特徴とする方法を提供するものである。
−プロテオームの特徴の解析方法:二次元電気泳動、タンパク質アレイ、サイトカインアレイ及び/又は複合ELISA法
−ゲノムの特徴の解析方法:DNAアレイ、ポリメラーゼ多重連鎖反応(PCR−multiplex)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び/又はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムPCR)
−トランスクリプトームの特徴の解析方法:RNAアレイ、cDNAアレイ、逆転写多重ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR−multiplex)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)及び/又はリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムRT−PCR)
a)若い生細胞について
b)加齢した生細胞について
c)三次元組織モデルで用いられる上記2種類の細胞のうち少なくとも1種について
比較プロテオーム解析、比較トランスクリプトーム解析及び/又は比較ゲノム解析を行い、細胞の加齢に対して更に変化が生じる少なくとも1つの生物学的パラメーターを結果的に同定することを可能にする方法に関する。
−プロテオームの特徴の解析方法:二次元電気泳動、タンパク質アレイ、サイトカインアレイ及び/又は複合ELISA法
−ゲノムの特徴の解析方法:DNAアレイ、ポリメラーゼ多重連鎖反応(PCR−multiplex)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)及び/又はリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムPCR)
−トランスクリプトームの特徴の解析方法:RNAアレイ、cDNAアレイ、逆転写多重ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR−multiplex)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)及び/又はリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムRT−PCR)
から選択される少なくとも1つの解析を含む。
皮膚の場合は真皮、粘膜の場合は絨毛膜と呼ばれる、主として間質細胞を含む結合性マトリックスモデル、主として上皮細胞から構成される上皮モデル、主としてケラチノサイトから構成される表皮モデル、表皮及び真皮から構成される皮膚モデル、上皮及び絨毛膜から構成される粘膜モデル
から選択される。
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン(登録商標)膜若しくはテフロン(登録商標)スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、Anopore無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CM半透膜、ポリエステル半透膜又はポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体(上記群において、例えば、真皮モデルであるSkin2TMmodel ZK1100、Dermagraft(R)及びTranscyte(R)(Advanced Tissue Sciences)が挙げられる)
−細胞培養処理した樹脂(葉状真皮(a dermal leaf)の構造:Michel M.ら、In Vitro Cell.Dev Biol.−Animal(1999)35:318−326)
−ヒアルロン酸(Hyalograft(R) 3D−Fidia advanced Biopolymers)及び/又はコラーゲン及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とするゲル又は膜(上記群において、例えば、真皮モデルであるVitrix(R)(オルガノジェネシス)が挙げられる)
より選択されるマトリックス担体を含み、多孔性マトリックスは浮上している又は浮上していないもので、1つ以上のグリコサミノグリカン類及び/又は最終的にはキトサン(CNRSのEP0296078 A1、ColeticaのWO01/911821及びWO01/92322)を含むことが可能であるコラーゲンから作られる結合性マトリックス(真皮又は絨毛膜)の組織モデルである。
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン(登録商標)膜若しくはテフロン(登録商標)スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、Anopore無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CM半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体(上記群において、再構成表皮及び上皮のモデル(Skinethic(R))、並びに、EpiDerm(R)、EpiAirway(R)、EpiOccular(R)(Mattek Corporation)といったモデルが挙げられる)
−ヒアルロン酸及び/又はコラーゲン及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とする薄膜又は膜(上記群において、特に、Laserskin(R)(Fidia advanced Biopolymers)、Episkin(R)(ロレアル)といったモデルが挙げられる)
より選択されるマトリックス担体を含む表皮組織モデル又は上皮組織モデルである。
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン(登録商標)膜若しくはテフロン(登録商標)スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン、ポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート(PET)の半透膜、Anopore無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル(HATF)の膜、Biopore−CM半透膜又はポリエステル半透膜からなる群より選択される不活性な担体(上記不活性な担体は間質細胞、特に繊維芽細胞を含む)
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲン及び/又はヒアルロン酸及び/又はフィブロネクチン及び/又は繊維素を基盤とするゲル
−1つ以上のグリコサミノグリカン類及び/又は最終的にはキトサンを含むことが可能であるコラーゲンから作られる、浮上している又は浮上していない多孔性マトリックス(上記多孔性マトリックスは間質細胞、特に繊維芽細胞を統合したものである)
−ヒト又は動物の、上皮を剥がした真皮又は死んだ真皮
より選択される真皮の又は絨毛膜のマトリックス担体を含む再構成皮膚又は粘膜の組織モデルである。
A/上記潜在的活性物質を、上記潜在的活性物質を作用させるのに十分な時間、上記細胞モデル又は組織モデルに播種した上記加齢細胞と接触させて配置すること
B/上記細胞モデル又は組織モデルに播種した上記若い細胞
C/上記加齢細胞における細胞の代謝に対する上記物質の作用を検討するために、部分的に又は完全に、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析及び/又はゲノム解析を行うこと
D/上記潜在的活性物質の存在下の上記加齢細胞における細胞の代謝を、上記物質の非存在下の上記加齢細胞又は若い細胞における代謝と比較すること
E/上記潜在的活性物質の活性の有無を明らかにすること、特に加齢の間に変化が生じることが明らかにされた生物学的パラメーターの変化を防止するための上記物質の肯定的又は否定的な効果を明らかにすること
を含む。
a)対照として用いられる若い細胞、好ましくは上記に記載の若い細胞を培養すること
b)若い細胞と呼ばれる細胞に対して変化が生じた生物学的パラメーターを持った加齢細胞、好ましくは上記に記載の加齢細胞を、上記細胞における細胞の代謝に対して上記潜在的活性物質を結果的に作用させるのに十分な時間、少なくとも1つの潜在的活性物質の存在下で培養して、代謝を若い細胞のレベルに回復すること
c)結果的に活性を持つことになる物質の存在下又は非存在下で培養した加齢細胞について、好ましくは上記の方法で、部分的に又は完全に、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析及び/又はゲノム解析を行うこと
d)c)で行った解析と、上記潜在的活性物質の非存在下で培養したa)に記載の若い生細胞についての、好ましくは上記の方法による、部分的な又は完全な、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析及び/又はゲノム解析とを比較すること
e)c)及びd)での解析の比較に続いて、上記加齢により変化が生じる生物学的パラメーターを少なくとも1つ変換することができる活性物質を少なくとも1つ結果的に同定すること
を含む、加齢する間に変化が生じる生物学的パラメーターを少なくとも1つ変換することができる潜在的活性物質を少なくとも1つ同定する方法に関する。
a)上記に記載の組織モデルに播種した上記に記載の加齢細胞と呼ばれる細胞と接触させて、上記潜在的活性物質を作用させるのに十分な時間、上記潜在的活性物質を配置すること
b)上記物質と接触させて配置した加齢細胞について、好ましくは上記に記載の方法で、部分的に又は完全に、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析及び/又はゲノム解析を行うこと
c)b)で行った解析と、上記潜在的活性物質の非存在下で培養した生細胞についての、好ましくは上記に記載の、部分的な又は完全な、プロテオーム解析、トランスクリプトーム解析及び/又はゲノム解析とを比較すること
d)c)での解析の比較に続いて、加齢により変化が生じる少なくとも1つの生物学的パラメーターの変化を防止することができる活性物質を少なくとも1つ結果的に同定すること
を含む、加齢する間に変化が生じる少なくとも1つの生物学的パラメーターの変化を防止することができる潜在的活性物質を少なくとも1つ同定する方法に関する。
上記パラメーターは、若い細胞を用いた細胞モデルと、加齢細胞を用いた細胞モデルとを比較検討することにより同定されたものであり、
上記モデルの少なくとも1つは繊維芽細胞又はケラチノサイトの少なくともどちらかを含む組織モデルである。
「若い」細胞又は「加齢した」細胞と呼ばれる細胞の抽出及び培養
「若い」細胞と呼ばれる細胞は、
・若いドナーから抽出した細胞、すなわち、形成外科、好ましくは包皮、腹部、乳房、最終的には歯肉又は膣の形成外科より入手した、日光にさらされていない生検材料から抽出した細胞
・若いドナーから抽出した細胞、例えば45才未満の若いドナーから抽出した細胞
・経代培養初期で用いられる細胞、例えば、繊維芽細胞の場合は10回未満、メラノサイトの場合は6回未満及びケラチノサイトの場合は2回未満といった経代培養初期で用いられる細胞
のいずれかである。
・加齢したドナー由来の生検材料から抽出した細胞、及び、形成外科、好ましくは腹部、乳房、最終的には歯肉又は膣の形成外科より入手した、日光にさらされていない、高齢の患者、例えば45才を超えるドナー由来の生検材料から抽出した細胞
・様々な年齢のドナー由来の生検材料、及び、日光にさらされた部位(顔、首、手)の形成外科より入手した生検材料より抽出した細胞
・経代培養後期で用いられる細胞、例えば、繊維芽細胞の場合は10回を超える、メラノサイトの場合は6回を超える及びケラチノサイトの場合は2回を超えるといった経代培養後期で用いられる細胞
のいずれかである。
「若い」再構成真皮及び「加齢した」再構成真皮と呼ばれる再構成真皮の調製、並びに、RNA、DNA及びタンパク質の抽出
実施例1に記載の方法で増幅した、若いドナー(45才未満)及び高齢のドナー(45才を超える)をそれぞれ3人含むプールに由来する繊維芽細胞500,000個を、ウシ血清を10%、アスコルビン酸−2−リン酸を最終濃度1mM、EGF(表皮成長因子)を最終濃度10ng/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL加えたDMEM−glutamax培地中の、アジ化ジフェニルホスホリル(diphenylphosphoryl azide)で架橋したコラーゲンでできている真皮の基質に播種して21日間培養する。
「若い」再構成表皮及び「加齢した」再構成表皮と呼ばれる再構成表皮の調製、並びに、RNA、DNA及びタンパク質の抽出
実施例1に記載の方法で経代培養1回目(トリプシン処理(trypsination)による1回目の増幅)まで増幅した、「若い」ケラチノサイト(35才未満のドナーに由来する)及び「加齢した」ケラチノサイト(55才を超えるドナーに由来する)と呼ばれるケラチノサイト4×106個を、Hyclone IIウシ血清を10%、アスコルビン酸−2−リン酸を最終濃度1mM、EGF(表皮成長因子)を最終濃度10ng/mL、ヒドロコルチゾンを最終濃度0.4μg/mL、ウムリン(umulin)を最終濃度0.12UI/mL、アイスプレルを最終濃度0.4μg/mL、トリヨードチロニンを最終濃度2×10−9M、アデニンを最終濃度24.3μg/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL、ゲンタマイシンを最終濃度20μg/mL加えたDMEM−Glutamax/Ham F−12(3/1 v/vの割合)培地中の、繊維芽細胞層下にあらかじめ栄養分を播種してある容器型のBoyden挿入片(空隙率0.4μm、直径25mmの膜)に播種し、3〜8日間浸漬させて培養する。
「若い」再構成歯肉粘膜上皮及び「加齢した」再構成歯肉粘膜上皮と呼ばれる再構成歯肉粘膜上皮の調製、並びに、RNA、DNA及びタンパク質の抽出
実施例1に記載の方法で抽出した、「若い」上皮細胞と呼ばれる歯肉粘膜上皮細胞(経代培養1回目、トリプシン処理(trypsination)による1回目の増幅におけるもの)及び「加齢した」上皮細胞と呼ばれる歯肉粘膜上皮細胞(経代培養4回目、トリプシン処理(trypsination)による4回目の増幅におけるもの)1〜2×106個を、Hyclone IIウシ血清を10%、アスコルビン酸−2−リン酸を最終濃度1mM、EGF(表皮成長因子)を最終濃度10ng/mL、ヒドロコルチゾンを最終濃度0.4μg/mL、ウムリン(umulin)を最終濃度0.12UI/mL、アイスプレルを最終濃度0.4μg/mL、トリヨードチロニンを最終濃度2×10−9モル/L、アデニンを最終濃度24.3μg/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL、ゲンタマイシンを最終濃度20μg/mL加えたDMEM−Glutamax/Ham F−12(3/1 v/vの割合)培地中の、容器の形状のBoyden挿入片(空隙率0.4μm、直径10mmの膜)に播種して、3〜8日間浸漬させて培養する。
「若い」再構成皮膚及び「加齢した」再構成皮膚と呼ばれる再構成皮膚の三次元多細胞モデル、並びに、RNA、DNA及びタンパク質の抽出
「若い」繊維芽細胞(35才未満の3人のドナーを含むプールに由来する)及び「加齢した」繊維芽細胞(55才を超える3人のドナーを含むプールに由来する)と呼ばれる繊維芽細胞400,000個を抽出し、実施例1に記載の方法で経代培養5回目(トリプシン処理(trypsination)による5回目の増幅)まで増幅し、浮上したコラーゲンのスポンジを基盤とする真皮の基質の上に播種する。
−0.75%コラーゲンゲルを25℃で乾燥させ、薄膜を作る。
−上記コラーゲン薄膜を0.75%コラーゲンゲルの上におく。
−24時間凍結乾燥させ、ジメチルホルムアミド溶媒、その後pH8.9ホウ酸バッファーの中で、コラーゲンをDPPA(アジ化ジフェニルホスホリル(diphenylphosphoryl azide))50μL/gで架橋する。
−脱塩水で洗浄し、浮上した真皮の基質を再度凍結乾燥する。
ランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞の個体群を含む、「若い」モデル及び「加齢した」モデルと呼ばれる再構成皮膚の三次元多細胞モデル、並びに、RNA、DNA及びタンパク質の抽出
●ランゲルハンス細胞の分化経路において優先的に環境に適応することができる、未分化で未発達の樹状細胞の産出
−Ficoll(R) gradient(ナトリウムジアトリゾエ―ト/密度1.077のポリスクロース;Lymphoprep Abcys 1053980)を用いて遠心分離した後、上記循環血の単核の細胞を回収し、磁気ビーズに結合した抗体混合物(主として抗CD3、抗fCD3、抗CD7、抗CD19、抗CD45RA、抗CD56、抗IgE(抗免疫グロブリンE)のCD)により間接的に標識する。
−磁気カラムを通した後、非磁性標識単球のみを溶出する。
−上記in vitroにおいて産生する樹状細胞の約60〜80%は、Langerinを細胞内において、及び、MIP−3αの特異的受容体であるCCR6を発現する。
−上記in vitroにおいて産生する樹状細胞は、MIP−3αによって化学的に強く引き寄せられることから、上記受容体CCR6との相関関係が明らかである。
−上記in vitroにおいて産生する樹状細胞は、成熟度の標識であるCD83、DC−LAMP及びCCR7を発現していないため、未成熟である。
上記細胞モデルのRNA、DNA及びタンパク質の精製
RNAは、2−プロパノールを用いて沈殿させて12,000gで15分間遠心分離し、80%エタノールでプラグを洗浄し、乾燥させてDNAase(AMBION)を用いて処理を行い、260nm及び280nmでの吸収の値を読んだ後、1μg/μLの割合で水に溶解する。
「若い」再構成皮膚及び「加齢した」再構成皮膚と呼ばれる再構成皮膚に対する抗加齢複合体の効果の検討
再構成皮膚は、実施例5に記載の方法により調製した。基底膜の再構成を刺激する活性物質Basaline(R)(改変させた麦芽タンパク質、Coletica、リヨン)を含む3種の活性物質からなる抗加齢複合体を、2.25%濃度で浸漬培地に添加した、又は、添加しなかった(未処理コントロール)。この状態を14日間保った。
14日間培養した後、「コントロール」再構成皮膚及び「処理した」再構成皮膚は液体窒素中で凍結させ、クリオマイクロパート(低温維持装置、Microm 500M)を用いて低温で切片を作った。
第一段階において、コラーゲンは、0.5N酢酸培地中で48時間4℃においてペプシン(20mg/g乾燥試料)により消化した後、再構成皮膚から抽出する。
アクチン、IV型コラーゲン及びVII型コラーゲンをコードしているmRNAの定量は、リアルタイム定量PCR法によって再構成したモデルにおいて行った。これを行うために、IV型コラーゲンの特異的な部位を増幅することができるプライマー(231塩基対)及びVII型コラーゲンの特異的な部位を増幅することができるプライマー(763塩基対)及びアクチンのシークエンスのプライマー(541塩基対)を用いた。
アンチセンス IV型コラーゲン 5’―GAATATCCGATCCACAAACTCCGCC―3’
アンチセンス VII型コラーゲン 5’―CACCACACGTAGTTCAATGC―3’
アンチセンス アクチン CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC
−5ng/μL濃度のRNA10μL
−上記で用いた様々なラベルのプライマー
−逆転写酵素及びDNAポリメラーゼ酵素、標識剤SYBR Green I(伸長の際にDNA二重らせんに挿入された発蛍光団)並びにMgCl2を含んだ反応混合物(キアゲン)
−逆転写:50℃で30分
−PCR反応:[94℃で15秒、56℃で30秒及び72℃で30秒]を50サイクル
上記増幅したDNA中に取り込まれた蛍光を、PCRサイクルの間連続的に評価した。この方法により蛍光測定曲線がPCRサイクルの関数として得られ、これより増幅したDNAの相対量を求めることができる。
Sgene<x>=107×(1/2)C(T)gene<x>
(C(T)gene<x>は、遺伝子<x>のC(T)の測定閾値(サイクル閾値)を示す)
によって計算する。
R=Sgene<x>/Sactin
の計算により、シグナル「アクチン」に従属していると考える。
単層、再構成真皮及び再構成皮膚のDNAアレイによる解析、「若い」モデル及び「加齢した」モデルと呼ばれるモデル間の比較
上記3つの細胞モデルを作るにあたって、同じ回数経代培養した同一のcell stockを用いる。
−簡潔には、上記試料のRNAを(液体窒素中でバイオプルベライザー(三次元モデル用のバイオプルベライザー)を用いてすりつぶした後で)抽出し、Tri Reagent(R)の供給業者のプロトコールに従って精製する(DNAを完全に除去する)。
−精製したRNAについて定性分析及び定量分析を行う。
−次の段階として、Atlas Pure(クロンテック)のプロトコールに従い、メッセンジャーRNA(mRNA)のpoly(A)末端をビオチン化オリゴ(dT)プライマーとハイブリダイゼーションさせ、ストレプトアビジンビーズ上に選択的に捕獲することにより、mRNAのプールを精製した。[α33P]−dATPの存在下で、アレイ上に固定されているシークエンスに特異的なプライマーのプールを用いて、poly(dT)のビーズ上に連結したmRNAを逆転写することにより、33Pで複数標識したDNAプローブを作成した。上記標識したプローブは、排除カラムクロマトグラフィー(exclusion column chromatography)を用いて精製し、その性質及び当量を液体シンチレーション計数法で評価した。
−上記Custom ATLAS膜を前処理した後、それぞれの膜に固定されているcDNAを対応する標識したプローブとハイブリダイズさせた(68℃、一晩)。この後、分析する前に薄膜を洗浄した。
−Cyclone Phosphorimager(Packard instrument;3時間、この後取得するために72時間)及びQuantArray(Packard、software)を用いて、スポットの放射能をオートラジオグラフィーにより分析して定量した。
−ドナーが若かったり高齢であったりといった様々な実験条件での目的の遺伝子を同定した。単層条件、単細胞三次元条件及び多細胞三次元条件下における結果を、加齢したモデルと若いモデルの差異の百分率で示す。
「若い再構成皮膚」及び「加齢した再構成皮膚」と呼ばれる再構成皮膚モデルにおけるフィブロネクチンをコードするmRNAのノーザンブロットによる分析
コラーゲン−GAG−キトサンマトリックスに繊維芽細胞(35才未満の及び55才を超えるドナーをそれぞれ少なくとも3人含むプールに由来し、実施例1に記載のプロトコールにより別々に抽出及び増幅したもの)を400,000個播種して、ウシ血清を10%、アスコルビン酸を最終濃度1mM、EGF(表皮成長因子)を最終濃度10ng/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL及びゲンタマイシンを最終濃度20μg/mL加えたDMEM−glutamax培地中で15日間培養し、若い再構成皮膚及び加齢した再構成皮膚を調製する。ケラチノサイト(同一のドナープールに由来し、実施例1に記載のプロトコールにより別々に抽出及び増幅したもの)は、再構成真皮あたり400,000個の割合で播種する。上記培養物は、Hyclone IIウシ血清を10%、アスコルビン酸−2−リン酸を最終濃度1mM、EGFを最終濃度10ng/mL、ヒドロコルチゾンを最終濃度0.4μg/mL、ウムリン(umulin)を最終濃度0.12UI/mL、アイスプレルを最終濃度0.4μg/mL、トリヨードチロニンを最終濃度2×10−9M、アデニンを最終濃度24.3μg/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL、ゲンタマイシンを最終濃度20μg/mL加えたDMEM−Glutamax/Ham F−12(3/1 v/vの割合)培地でできた増殖培地中で1週間培養を続ける。このようにすると再構成皮膚が発生し、この後、ウシ血清、ヒドロコルチゾン、アイスプレル、トリヨードチロニン及びウムリン(umulin)を除く以外は上記と同じ培地中で更に2週間培養する。上記試料はTri Reagent(R)(シグマ)中で集める。
「若い」再構成皮膚及び「加齢した」再構成皮膚と呼ばれる再構成皮膚モデルにおけるVII型コラーゲンのウェスタンブロットによる分析
コラーゲン−GAG−キトサンマトリックスにP2(経代培養2回目、すなわちトリプシン処理(trypsination)による2回目の増幅)の「若い」細胞及びP12(経代培養12回目、すなわちトリプシン処理(trypsination)による12回目の増幅)の「加齢した」細胞(両細胞は、実施例1に記載のプロトコールにより別々に抽出及び増幅したもの)を400,000個播種して、ウシ血清を10%、アスコルビン酸−2−リン酸を最終濃度1mM、EGF(表皮成長因子)を最終濃度10ng/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL及びゲンタマイシンを最終濃度20μg/mL加えたDMEM−glutamax培地中で15日間培養し、「若い」再構成真皮及び「加齢した」再構成真皮と呼ばれる再構成真皮を調製する。P1(経代培養1回目、すなわちトリプシン処理(trypsination)による1回目の増幅)の「若い」と呼ばれるケラチノサイト及びP3の「加齢した」と呼ばれるケラチノサイトを実施例1に記載のプロトコールにより別々に抽出及び増幅し、再構成真皮あたり400,000個の割合で播種する。上記培養物は、Hyclone IIウシ血清を10%、アスコルビン酸−2−リン酸を最終濃度1mM、EGFを最終濃度10ng/mL、ヒドロコルチゾンを最終濃度0.4μg/mL、ウムリン(umulin)を最終濃度0.12UI/mL、アイスプレルを最終濃度0.4μg/mL、トリヨードチロニンを最終濃度2×10−9M、アデニンを最終濃度24.3μg/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL、ゲンタマイシンを最終濃度20μg/mL加えたDMEM−Glutamax/Ham F−12(3/1 v/vの割合)培地でできた増殖培地中で1週間培養を続ける。このようにすると再構成皮膚が発生し、この後、ウシ血清、ヒドロコルチゾン、アイスプレル、トリヨードチロニン及びウムリン(umulin)を除く以外は上記と同じ培地中で更に2週間培養する。
「若い」モデル及び「加齢した」モデルと呼ばれるモデルである再構成表皮との比較における、単層のケラチノサイトのDNAアレイによる分析
上記3つの細胞モデルを作るにあたって、同じ回数経代培養した同一のcell stockを用いる。
化粧品用の活性物質を「若い」再構成皮膚及び「加齢した」再構成皮膚と呼ばれる再構成皮膚に局所的に塗布した場合の効果の試験
「若い」繊維芽細胞と呼ばれる繊維芽細胞(胸部の生検材料から抽出)及び「加齢した」繊維芽細胞と呼ばれる繊維芽細胞(美容整形後に得た顔の生検材料から抽出)600,000個を、実施例1に記載の方法で抽出して経代培養6回目(トリプシン処理(trypsination)による6回目の増幅)まで増幅し、hyclone IIウシ血清を10%、アスコルビン酸−2−リン酸を最終濃度1mM、EGF(表皮成長因子)を最終濃度10ng/mL、ペニシリンを最終濃度100UI/mL、アンホテリシンBを最終濃度1μg/mL及びゲンタマイシンを最終濃度20μg/mL加えたDMEM−Glutamax培地中のコラーゲン−グリコサミノグリカン−キトサンを基盤とする真皮の基質の上に播種して21日間培養する。
化粧品用の活性物質を「若い」再構成真皮及び「加齢した」再構成真皮と呼ばれる再構成真皮のモデルにおいて全身に塗布した場合の効果の試験
実施例12から、フィブロネクチン含量が、加齢した細胞と呼ばれる細胞を用いたモデルにおいて、加齢した細胞を用いたモデルに対して減少するということが分かる(43%減少)。
Claims (20)
- 少なくとも1つの加齢する間に変化が生じるトランスクリプトームパラメーターに結果的に生じた変化を同定する方法であって、
a)(i)ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン又は繊維素からなるゲル、薄膜又は膜、又は(ii)コラーゲンから作られる多孔性マトリックスから選択され、かつ間質細胞又は上皮細胞からなるマトリックス担体からなる三次元組織モデルで培養された若い生細胞からmRNAを回収すること
b)工程a)で定義された三次元組織モデルで培養された加齢した生細胞からmRNAを回収すること
c)若い生細胞から回収したmRNAの発現レベルと、加齢した細胞から回収したmRNAの発現レベルとを、前記mRNAで行われる比較トランスクリプトーム解析により比較すること
d)細胞の加齢に対して更に変化が生じる少なくとも1つのトランスクリプトームパラメーターを同定するために、前記mRNAで行われる比較トランスクリプトーム解析を行うことにより、若い生細胞のトランスクリプトームと加齢した生細胞のトランスクリプトームとの少なくとも一つの差を結果的に同定することを可能にすること
を特徴とする方法。 - 前記組織モデルが、(i)ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン又は繊維素からなるゲル又は膜、又は(ii)コラーゲンから作られる多孔性マトリックスから選択され、かつ間質細胞からなるマトリックス担体からなる再構成真皮である請求項1記載の方法。
- 前記組織モデルが、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン又は繊維素からなる薄膜又は膜から選択され、かつ上皮細胞からなるマトリックス担体からなる再構成表皮である請求項1記載の方法。
- 前記組織モデルが、(i)ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン又は繊維素からなるゲル又は膜、又は(ii)コラーゲンから作られる多孔性マトリックスから選択され、かつ間質細胞からなるマトリックス担体からなる再構成絨毛膜である請求項1記載の方法。
- 前記組織モデルが、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン又は繊維素からなる薄膜又は膜から選択され、かつ上皮細胞からなるマトリックス担体からなる再構成上皮である請求項1記載の方法。
- 前記組織モデルが、上皮部分と真皮部分を有する再構成皮膚であり、上記再構成皮膚が、(i)ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン又は繊維素からなるゲル又は膜、又は(ii)コラーゲンから作られる多孔性マトリックスから選択され、かつ真皮部分にある間質細胞と上皮部分にある上皮細胞からなるマトリックス担体からなる請求項1記載の方法。
- 前記組織モデルが、上皮部分と絨毛膜部分を有する再構成粘膜であり、上記再構成粘膜が、(i)ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブロネクチン又は繊維素からなるゲル又は膜、又は(ii)コラーゲンから作られる多孔性マトリックスから選択され、かつ絨毛膜部分にある間質細胞と上皮部分にある上皮細胞からなるマトリックス担体からなる請求項1記載の方法。
- 工程a)の若い細胞は、45才未満のドナー由来の生検材料に由来する細胞、細胞の機能別に予め決定された回数未満のin vitro経代培養を受けた細胞、又は、太陽放射にあまりさらされていない生検材料に由来する細胞のいずれかであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 若い細胞が、胴体、胸部、腹部又は包皮に由来することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 加齢細胞は、45才を超えるドナー由来の生検材料に由来する細胞、細胞の機能別に予め決定された回数を超えるin vitro経代培養を受けた細胞、又は、太陽にさらされている部位から採取した生検材料に由来する細胞のいずれかであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 加齢細胞が、手、顔、首又は襟首に由来することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 加齢細胞は、1か月以上の長期間に渉って培養することにより人為的に加齢させた1種以上の細胞を含む三次元組織モデルにおいて統合された若い細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記若い細胞又は加齢細胞は少なくとも一体のヒト又は少なくとも一体の動物由来の細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記トランスクリプトーム解析は以下の:
RNAアレイ、cDNAアレイ、逆転写多重ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR−multiplex)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)又はリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムRT−PCR)
から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記マトリックス担体が間質細胞及び上皮細胞からなり、前記間質細胞が繊維芽細胞であり、前記上皮細胞がケラチノサイトであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記モデルは、正常若しくは異常細胞、又は、細胞系由来の細胞を含むことを特徴とする請求項1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15に記載の方法。
- 前記上皮部分が、上皮細胞、色素細胞、免疫担当細胞、神経細胞又はこれらのすべての細胞からなることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 用いられる前記組織モデルは、内皮細胞(EC)、免疫細胞、樹状細胞、脂肪細胞、リンパ球、マクロファージ、脂腺細胞、又は、皮膚の付属器から選択される少なくとも1種更に組み込まれたモデルを含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 加齢する間に変化が生じるトランスクリプトームパラメーターを少なくとも1つ変換することができる潜在的活性物質を少なくとも1つスクリーニングする方法であって、
請求項1に記載の方法によりトランスクリプトームにおける差を同定すること、及び、加齢する間に変化が生じる細胞の代謝における差を変換することができる物質をスクリーニングすることからなる方法。 - a)対照として用いられる請求項1に記載の若い細胞を三次元組織モデルで培養し、前記若い細胞からmRNAを回収すること
b)前記若い細胞のトランスクリプトームに対して変化が生じるトランスクリプトームパラメーターを持った請求項1に記載の加齢細胞を、前記加齢細胞における細胞の代謝に対して前記潜在的活性物質を結果的に作用させるのに十分な時間、少なくとも1つの潜在的活性物質の存在下で三次元組織モデルで培養して、前記加齢細胞からmRNAを回収すること
c)結果的に活性を持つことになる物質の存在下又は非存在下で培養した前記加齢細胞のmRNAについて、部分的に又は完全に、トランスクリプトーム解析を行うこと
d)c)で行った解析と、前記潜在的活性物質の非存在下で培養したa)に記載の若い生細胞のmRNAについての、部分的な又は完全な、トランスクリプトーム解析とを比較すること
e)c)及びd)での解析の比較に続いて、前記加齢細胞のトランスクリプトームパラメーターを少なくとも1つ変換することができる活性物質を少なくとも1つ結果的に同定すること
を含む、加齢する間に変化が生じる生物学的パラメーターを少なくとも1つ変換することができる潜在的活性物質を少なくとも1つ同定する方法。
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