CN112462062B - 一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用，本发明鉴定了羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞外分泌蛋白组，并对结果进行了分析整合，对它们的差异表达蛋白进行了进一步的分析。筛选出对上皮发育和表皮再生的积极因子LOXL2，对后续羊膜干细胞旁分泌作用的研究提供了详实的基础和新的思路。LOXL2为临床大面积难愈合创面的在上皮化提供了新的思路，为更好的挖掘不同羊膜干细胞外分泌蛋白的特点提供了方向。为特异性无细胞敷料的开发与临床应用提供了基础。

Description

一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及羊膜干细胞外分泌蛋白LOXL2的筛选鉴定和应用。
背景技术
人羊膜是胎膜最内层，其主要由外胚层的羊膜上皮干细胞和中胚层的羊膜间充质干细胞组成。多在胎儿分娩后随胎盘废弃。研究发现：人羊膜可作为一种新型的生物敷料应用于临床急慢性创口的辅助性治疗中。已有研究报道，冷冻或辐照处理后的羊膜组织依然在动物创伤模型或者临床创面的愈合中具有促进创面的愈合、降低炎症反应、减少瘢痕的发生等等方面有显著的疗效。由此证明羊膜旁分泌物质有巨大的研究价值和临床意义。然而，羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞的外分泌蛋白组并尚未明晰。
赖氨酰氧化酶同系物2(lysyl oxidase like 2，LOXL2)作为转录辅阻遏物，并且特异性介导组蛋白H3(H3K4me3)的三甲基化'Lys-4'的脱氨基作用，其是表观遗传转录激活的特异性标记。LOXL2可能通过介导组蛋白H3的脱氨基，与SNAI1的相互作用参与上皮至间质转化(EMT)并参与E-钙粘蛋白CDH1的抑制。当分泌到细胞外基质中时，通过介导纤维胶原和弹性蛋白的前体中的肽基赖氨酸残基的氧化脱氨作用来促进细胞外基质蛋白的交联，并且可以在上皮发育调节，细胞生长控制和血管生成等方面有额外的作用。
对于创伤愈合，角质形成细胞作为表皮的主要组成细胞承担了再上皮化的重要任务。已有文献报道羊膜上皮干细胞的条件培养基促进角质形象细胞迁移，并在小鼠体内实验证明条件培养基有促进创口愈合和再上皮化的作用。而羊膜间充质条件培养基对于再上皮化的机制并未明晰。
发明内容
发明目的：
本发明提出一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用，其目的是从羊膜干细胞外分泌蛋白中筛选鉴定出LOXL2，并验证该蛋白有促进角质形成细胞迁移的作用，促进创面再上皮化，提出LOXL2的一种新应用。
技术方案：
一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法，步骤如下，
步骤一：羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞的提取、培养与鉴定，分别得到羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞；
步骤二：将步骤一中得到的羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞分别持续培养到P2，分别接种于培养瓶中培养22-26h；用PBS洗2-5次，将培养基换成无血清培养基，22-26h后收集无血清培养基，于-80℃冰箱保存，分别获得羊膜间充质干细胞的条件培养基和羊膜上皮干细胞的条件培养基；
步骤三：分别将步骤二中保存的羊膜间充质干细胞的条件培养基和羊膜上皮干细胞的条件培养基取出、融化、浓缩后，分别进行液相色谱-质谱联用分析，鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞外分泌蛋白，分别进一步筛选出它们的差异表达蛋白，分别对筛选出的差异表达蛋白进行GO、KEGG和蛋白质结构域进行整合分析，鉴定出羊膜干细胞的外分泌蛋白LOXL2。
步骤一中羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞的提取、培养与鉴定的具体步骤为：
(1)羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞的提取、培养；
(2)羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞进行流式细胞检测、鉴定；
(3)羊膜间充质干细胞或者羊膜上皮干细胞进行成骨、成脂、成软骨分化诱导。
步骤一中通过表面标记物分别鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞。
无血清培养基是EpiLife基础培养基中添加0.1-0.3％v/v的牛垂体提取物、0.01-0.03μg/mL人胰岛素样生长因子、0.15-0.20μg/mL皮质醇、3-5μg/mL的牛转铁蛋白以及0.2-0.4ng/mL的人表皮生长因子。
步骤三中液相色谱-质谱联用分析中二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索注释。
步骤三中，根据鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞外分泌蛋白，以p-value<0.05，Log2FC>1.5为基础进一步筛选出它们的差异表达蛋白进行GO、KEGG和蛋白质结构域进行整合分析。
羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞的高表达蛋白包括LOXL2、CTHRC1和LGASL1，且羊膜间充质干细胞的高表达蛋白LOXL2、CTHRC1和LGASL1比羊膜上皮干细胞分泌量高。
一种羊膜干细胞外分泌蛋白的应用，羊膜干细胞外分泌蛋白LOXL2在促进角质形成细胞迁移，促进创面再上皮化的应用。
LOXL2作为促进创口愈合和再上皮化药剂的应用。
优点及效果：
本发明鉴定了羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞外分泌蛋白组，并对结果进行了分析整合，对它们的差异表达蛋白进行了进一步的分析。筛选出对上皮发育和表皮再生的积极因子LOXL2，对后续羊膜干细胞旁分泌作用的研究提供了详实的基础和新的思路。LOXL2为临床大面积难愈合创面的在上皮化提供了新的思路，为更好的挖掘不同羊膜干细胞外分泌蛋白的特点提供了方向。为特异性无细胞敷料的开发与临床应用提供了基础。
附图说明
图1是羊膜间充质干细胞流式细胞技术鉴定干细胞表面标志物；
图2是羊膜上皮干细胞流式细胞技术鉴定干细胞表面标志物；
图3是羊膜间充质干细胞分化潜能的鉴定(成脂、成骨、成软骨)；
图4是羊膜上皮干细胞分化潜能的鉴定(成脂、成骨、成软骨)；
图5是羊膜干细胞条件培养基质谱分析数据结果基本统计图；
图6是羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞差异表达定量火山图；
图7是差异表达蛋白在GO二级分类中统计分布图；
图8是差异表达蛋白KEGG富集气泡图；
图9是差异表达蛋白在蛋白结构域分类中富集分布气泡图；
图10是ELISA实验验证筛选出羊膜间充质干细胞高表达的外分泌蛋白LOXL2、CTHRC1、LGASL1；
图11是划痕实验证明LOXL2促进角质形成细胞迁移；
图12是划痕实验不同时间点的量化细胞迁移面积直方图；
图13是LOXL2促进角质形成细胞mRNA水平分化指标表达；
图14是Western Blot表明LOXL2促进角质形成细胞蛋白水平分化指标表达；
图15是全层切除伤口的代表性图片；
图16是伤口愈合的闭合率；
图17是受伤的皮肤切片进行染色示意图。
具体实施方式
本发明涉及干细胞与再生医学、蛋白质组在基础医学领域的深入研究与临床的转化应用，重点应用于羊膜干细胞在促进创伤愈合中积极因子LOXL2与创面愈合临床研究的推广与发展。从羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞外分泌蛋白的鉴定入手，结合非标定量蛋白质组学技术，分析了两种细胞外分泌表达谱的异同。从而筛选出羊膜间充质高表达的外分泌蛋白LOXL2。ELISA实验证实筛选结果，利用纯品蛋白刺激角质形成细胞，划痕实验发现该蛋白能有效的促进角质形成细胞迁移。
实施例1
1.羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞的条件培养基
材料与方法:
蛋白酶抑制剂(碧云天)
胰蛋白酶(trypsin)BI
超滤离心管(Merck Millipore；Amicon Ultra-50，Ultracel-3k)
BCA试剂盒(碧云天)
Ⅳ型胶原酶(sigma)
成骨/成脂/成软骨试剂盒(赛业生物)
步骤一：羊膜间充质干细胞(hAMSCs)和羊膜上皮干细胞(hAECs)的提取、培养与鉴定：
(1)羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞的提取、培养
取健康剖腹产产妇的羊膜组织，将羊膜组织浸泡在生理盐水中30min，用PBS反复冲洗至无粘液。将冲洗后的羊膜组织剪成5x5cm2的小块放入10ml胰蛋白酶中消化30-50min。
羊膜上皮干细胞的提取、培养：胰蛋白酶用2-3ml血清充分中和，300-500g离心10-15min，得到羊膜上皮细胞，收集羊膜上皮细胞沉淀，用羊膜上皮干细胞培养基(DMEM F12+10％FBS+10ng/mL EGF+50U/mL青霉素+50μg/mL链霉素)充分吹匀，随后将的羊膜上皮细胞单细胞悬液接种于培养瓶中，密度为1-2×106个/mL，放入37℃、5％CO2、95％湿度的培养箱中。传代培养至P2。
羊膜间充质干细胞的提取、培养：PBS反复冲洗前一步消化后的羊膜组织，随后滤干PBS用眼科剪将清洗干净的羊膜组织剪碎。1mg/ml的Ⅳ型胶原酶在37℃环水浴1.0-1.5h，收集消化后的混合液用其两倍体积的PBS中和。200目细胞筛过滤，收集滤液300-500g离心10-15min，得到羊膜间充质干细胞，收集羊膜间充质干细胞沉淀，用培养基(DMEM F12+10％FBS+50U/mL青霉素+50μg/mL链霉素)充分吹匀，随后将细胞接种于培养瓶中，密度为5-6×105个/mL，放入37℃、5％CO2、95％湿度的培养箱中。传代培养至P2。
(2)羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞进行流式细胞检测、鉴定：
为了消除个体差异的影响，提取n＝3例不同产妇来源羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞进行流式细胞检测，流式细胞仪对P3羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞表面相对特异性抗原进行检测。将步骤(1)中得到的羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞在PBS中洗涤3次，得到羊膜间充质细胞悬浮液和羊膜上皮干细胞悬浮液，分别将羊膜间充质细胞悬浮液与FITC-CD73，CD44，CD105，CD34，CD45，CD31的荧光抗体，羊膜上皮干细胞悬浮液与FITC-CD105，OCT4，SOX2，SSEA3，SSEA4，HLA-DR在避光常温条件下孵育30-50min，然后PBS洗涤3-5次，并重悬。上机测定抗原的阳性率。
hAMSCs表面标记物的鉴定结果见图1所示，即与对照组相比，CD44，CD73，CD105表达为阳性；CD34，CD45，CD31表达为阴性，符合MSCs干细胞标志物表达情况，提取细胞符合实验要求。hAECs表面标记物的鉴定，与对照组相比，CD29，CD90，SSEA4表达为阳性，HLA-DR表达为阴性。EP-CAM，SSEA3表达弱阳性，符合hAECs干细胞标志物表达情况，提取细胞符合实验要求。
(3)对三个不同来源人羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞进行成骨、成脂、成软骨分化诱导：
对步骤(2)的三个不同来源的羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞，分别利用成骨、成脂、成软骨诱导培养基相应进行成骨、成脂、成软骨按照试剂盒说明书(赛业生物)诱导操作，hAMSCs和hAECs诱导的骨粒利用茜素红染液染色，骨粒成深红色；诱导出的脂滴利用油红O染液染色，脂滴呈橙红色；诱导出的软骨球利用冰冻切片机切片，并用阿利辛蓝染液染液染色。
hAMSCs诱导结果见图3，hAECs诱导结果见图4，由图3和图4可知，hAMSCs和hAECs有多项分化潜能，符合干细胞对于多项分化的要求。
步骤二：羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞条件培养基的获得，
羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞培养第二代融合度为80-90％时传代，分别以2-3×106个细胞种至75cm2培养瓶中。24-36h后用PBS洗3-5遍，将培养基换成无血清培养基。24-48h收集无血清培养基，获得羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞条件培养基，-80℃冰箱保存。
无血清培养基是EpiLife基础培养基中添加0.1-0.3％v/v牛垂体提取物(BPE)、0.01-0.03μg/mL人胰岛素样生长因子、0.15-0.20μg/mL皮质醇、3-5μg/mL牛转铁蛋白以及0.2-0.4ng/mL人表皮生长因子(hEGF)。
步骤三：羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞条件培养基的处理和质谱检测
(1)人羊膜干细胞条件培养基的处理：
样品从-80℃取出，放置于室温，待其完全溶化后，4℃，8000-10000g离心10-15min，去除固体杂质。上清液转移至超滤离心管于4℃，5000-6000g离心2-3h，收集浓缩液。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
(2)外分泌蛋白质组学：杭州景杰生物科技有限公司进行液相色谱-质谱联用分析，二级质谱数据使用Maxquant(v1.5.2.8)进行检索注释。本次实验，通过质谱分析共得到882574.0张二级谱图。质谱二级谱图经蛋白理论数据搜库后，得到可利用有效谱图数为70346，谱图利用率为8.0％。通过谱图解析共鉴定到12536.0条肽段，其中特异性肽段为10096.0。共鉴定到1897个蛋白，其中1607个可定量(定量蛋白表示至少一个比较组有定量信息)。实验结果详细统计如图5。
(3)羊膜间充质干细胞外分泌蛋白与羊膜上皮干细胞外分泌蛋白的差异比较分析：
根据(2)中鉴定出羊膜间充质干细胞与羊膜上皮干细胞外分泌蛋白，通过质谱分析技术检测蛋白在每个样本中对应信号丰度，通过非标定量计算方法得到蛋白在每个样本中的iBAQ intensity，根据不同样本之间蛋白iBAQ intensity得到每个样本的相对定量值。第一步计算比较组中两个样本间蛋白的差异表达量，首先计算出每个样本在多次重复中定量值的平均值，然后再计算两个样本之间平均值的比值，该比值作为比较组最终的差异表达量。第二步计算该蛋白在两个样本中的差异表达显著性P-value，首先将各个样本的相对定量值取log2(以使得数据符合正态分布)，然后用双样本双尾T检验方法计算p-value。当p-value<0.05时，以差异表达量变化超过1.5作为显著上调的变化阈值，小于1/1.5作为显著下调的变化阈值。单次重复比较组仅以差异表达量变化超过1.5作为显著上调的变化阈值，小于1/1.5作为显著下调的变化阈值。图6中横轴为蛋白相对定量值经过Log2对数转换后的值，纵轴为差异显著性检验p-value值经过-Log10对数转换后的值。图中红色点表示显著差异表达量上调蛋白，蓝色点表示显著差异表达下调蛋白。Gene Ontology(GO)即基因本论，是一个重要的生物信息学分析方法和工具，用于表述基因和基因产物的各种属性。GO注释分为3个大类：生物进程(Biological Process)，细胞组成(CellularComponent)和分子功能(Molecular Function)，从不同角度阐释蛋白的生物学作用。对差异表达蛋白在GO二级注释中的分布，具体结果见图7，羊膜干细胞外分泌蛋白组对各种细胞进程和功能有丰富的功能。KEGG是连接已知分子间相互作用的信息网络，如代谢通路、复合物、生化反应。KEGG途径主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、人类疾病、药物开发等。富集分析得到的KEGG途径通过网页形式进行了可视化展示。并对富集分析得到的KEGG途径以及蛋白质结构域通过网页形式进行了可视化展示，具体结果见图8和图9。
实施例2
质谱分析羊膜间充质干细胞比羊膜上皮干细胞高表达筛选蛋白结果验证。
材料与方法:
ELISA试剂盒(上海酶联)
结果：
基于生物信息学分析，hAMSCs和hAECs的外分泌蛋白在各个组织发育、分化和成熟中均有积极和消极的作用。这可能与羊膜组织特有的生理功能有关，羊膜组织做为胎膜最内一层，与覆盖在胎盘、脐带的羊膜层相连接。除了产生羊膜保护胚胎生长，其也可以通过分泌蛋白质组来调节胚胎的发育，实现调控。在本发明中，聚焦于皮肤发育、创伤愈合、细胞运动和表皮细胞调节等功能，分别富集了差异表达的hAMSCs-CM和hAECs-CM蛋白。基于本发明中hAMSCs-CM能促进再上皮化的现象，我们重点筛选了hAMSCs高表达的蛋白在表皮细胞和创面愈合中的积极的生物学现象功能。如图10所述，ELISA实验验证羊膜间充质干细胞高表达蛋白LOXL2、CTHRC1和LGASL1比羊膜上皮干细胞分泌量高，与质谱分析结果一致。
实施例3
LOXL2促进角质形成细胞迁移和分化。
材料与方法
重组蛋白CTHRC1(近岸蛋白，中国)
重组蛋白LGASL1(近岸蛋白，中国)
重组蛋白LOXL2(义翘神州，中国)
TRIZOL(Invitrogen，美国)
实时逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒(TaKaRa，日本)
Involucrin抗体(Abcam，美国)
CK10抗体(Abcam，美国)
步骤一：LOXL2促进角质形成细胞迁移：
采用划痕实验，分析上一步筛选出的蛋白对细胞迁移的影响。将角质形成细胞种到6孔板中，待到细胞融合度到90％时，使用200μL的无菌枪头横竖各划出一个500μm划痕。用PBS冲洗2-3次，去除无黏附的细胞。用LOXL2、CTHRC1和LGASL1(100ng/ml)预培养角质形成细胞3天，通过划痕创面实验研究不同处理因素组对角质形成细胞的迁移的影响。如图11中显示了蛋白LOXL2在不同时间点(0、12、24、36和48h)划痕试验的代表性图像。图12的直方图表示Image J软件计算的定量数据结果。直方图显示各组在不同时间点的量化细胞迁移面积数值为平均值±SEM。****p<0.0001；***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。
结果分析与对照组相比，各处理组在24h都有明显的促进迁移的能力，其中LOXL2处理组在12h就有明显的促迁移作用，且在多次重复中结果较稳定。
步骤二：LOXL2促进角质形成细胞分化指标的表达：
(1)在LOXL2(100ng/ml)预培养角质形成细胞3天后，收取RNA。根据测量得到的样品RNA浓度，计算每样品1ug的体积，根据以下体系，依次加入试剂。
反应条件：42℃2min
反应条件：37℃，15min，85℃，5s。
以上一步逆转录得到cDNA为样本，按照以下体系进行实时定量PCR实验。
反应程序为：95℃30s预变性；95℃5s，60℃34s，40个循环，计算方法为2–ΔΔCT相对定量法。引物见下表。
结果表明，与LOXL2共培养3天后，表皮分化标记物Involucrin、CK10、CK1和Filaggrin mRNA表达均明显高于对照组(图13)。
(2)在LOXL2(100ng/ml)预培养角质形成细胞3天后，收取总蛋白。按照试剂盒说明书配置10％的聚丙烯酰胺凝胶。分别在相应孔道加入20μg煮好的蛋白样品和Maker。连接电源80V恒压待溴酚蓝跑出玻璃板，停止电泳。将PVDF膜裁至5.2cm×8.3cm，用甲醇激活。待电泳停止，去掉浓缩胶。将分离胶和激活的PVDF膜对齐放好。在外层两侧放入两张同等大小的滤纸和对应的泡沫板，用夹子夹好，做成“三明治”。浸泡在转膜液中，90V恒压转90min。
待转膜结束，弃去凝胶，将PVDF膜正面向上放入脱脂奶粉中。室温在摇床上慢摇1-2h。封闭结束后，根据maker剪下对应条带。放入含有对应一抗的杂交液中(CK1 1:5000；CK10 1:5000；Involucrin 1:10000)，4℃孵育过夜。一抗孵育结束后，随后根据一抗的产品说明，按照说明书的比例加入与之对应的二抗，在摇床上室温慢速孵育1-2h。再用TBST洗3次。ECL试剂盒1:1配置发光液，将膜放入发光仪中，均匀涂上发光液，利用增强型化学发光成像系统进行显影。保存结果并用Image J分析。结果表明，与LOXL2共培养3天后，表皮分化标记物Involucrin、CK10蛋白表达均明显高于对照组(图14)。蛋白表达与mRNA水平一致。证明LOXL2具有促进角质形成细胞的分化能力。上述数据表明，hAMSCs分泌的LOXL2蛋白可以促进角质形成细胞的迁移和分化能力。
实施例4
LOXL2加速小鼠创面愈合速率。
材料与方法
健康雄性C57小鼠、鼠粮以及垫料均购自中国医科大学动物部，合格证号：SCXK(辽)2019-0012，鼠龄6周，体重20±2g。
Masson试剂盒(索莱宝，中国)
步骤一：LOXL2加速小鼠创面愈合速率：
(1)本次研究得到了大学医学伦理委员会的批准(CMU2019235)。从大学实验动物中心获得了6周龄的雄性C57雄性小鼠(20±2g)。将动物圈养在25摄氏度下光照12h/黑暗12h的标准实验室的条件下，每天提供充足的食物和水。将小鼠随机分为三组(n＝4)：磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照组；和5×hAMSCs-CM治疗组(条件培养基为浓缩五倍)；LOXL2治疗组(4μg)。首先通过腹腔注射戊巴比妥钠(20mg/kg.bw)麻醉小鼠，用电动剪刀将背部皮肤剃毛，并用75％酒精消毒液消毒皮肤。用无菌活检打孔器从小鼠背部指定区域切下直径1cm的全层皮肤(1cm)。用PBS(50μL)或5×hAMSCs-CM(50μL)或LOXL2(50μL)四点注射到创面的周围组织中，并在术后第0、3、6、9和12天拍照记录。使用Image J软件定量剩余创面的形态分析。收缩百分比通过以下公式使用评估的开放表面积确定。
伤口面积(％)＝(0d伤口面积-特定日期的伤口面积)/0d伤口面积×100％。
在第14天，通过腹腔注射麻醉小鼠戊巴比妥钠(30mg/kg.bw)，麻醉过量处死小鼠。实验过程中将尽一切努力使动物的痛苦最小化。
通过观察创面面积大小，从而确定hAMSCs-CM和LOXL2处理组是否对创面愈合有积极的作用。与对照组相比，hAMSCs-CM组在第3天的创面面积明显减少，术后第6天LOXL2组伤口闭合率明显降低。第6天后，LOXL2组与hAMSCs-CM组显示出相似的创面面积，见图15，图15为用PBS，5×hAMSCs-CM(hAMSCs条件培养基的浓度为5倍)或LOXL2处理的全层切除伤口的代表性照片。在用hAMSCs-CM组和LOXL2组治疗的小鼠中，在第9天创面基本愈合完毕，表皮屏障功能基本恢复。而对照组小鼠，还存在明显的未闭合区域。使用Image J软件测量并定量伤口面积，如图16所示，图16是PBS，5×hAMSCs-CM或LOXL2处理后伤口愈合的闭合率。箭头代表创面边缘，图16外源性蛋白LOXL2有明显的促进创面愈合的作用。
(2)为了进行组织学观察，在创伤模型第14天收集受伤的皮肤组织并将其固定在4％多聚甲醛中4℃过夜，随后4℃梯度蔗糖溶液脱水36-48h，然后浸入包埋剂(OCT)中。将样品包埋在冷冻切片机中，切成8μm厚的切片，贴付在载玻片上，然后用苏木精-伊红(H&E)和Masson染色。使用OlympusFSX100显微镜成像。组织学检查显示，与对照小鼠相比，hAMSCs-CM处理和LOXL2处理的小鼠的伤口愈合更快。皮肤切片的H&E染色表明，hAMSCs-CM处理小鼠和LOXL2处理小鼠的表皮类似于正常皮肤，并且角质形成细胞排列整齐且紧密。而在对照组中，角质形成细胞分散并且表皮特异性增厚见图17，图17为在造模后第14天，对各组受伤的皮肤切片进行H&E和Masson染色。箭头所指为创面边缘。值是平均值±SEM。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。Masson染色显示，与对照组相比，hAMSCs-CM治疗小鼠和LOXL2治疗小鼠的纤维化明显减少，并且增殖障碍也得到改善见图17。以上实验表明，LOXL2有明显加速创伤愈合的作用，且与hAMSCs-CM无显著差异p>0.05。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明任何形式上的和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含的本发明的保护范围之内。
本发明基于羊膜间充质干细胞和羊膜上皮干细胞条件培养基中外分泌蛋白的鉴定，进一步分析整合质谱数据。最终选定并验证LOXL2促进角质形成细胞迁移和分化，并加速小鼠背部创面愈合速率。因此，羊膜干细胞外分泌蛋白LOXL2对于角质形成细胞的影响将促进再上皮化，在临床大面积创面的愈合中产生良好的作用。羊膜外分泌蛋白组的进一步研究解析，可以在临床中更精准的应用，LOXL2能够应用于促进创口愈合和再上皮化的药剂或者化妆品等领域。为特异性无细胞敷料的开发与临床应用提供了基础，减轻患者的痛苦。

Claims (1)

1.羊膜干细胞外分泌蛋白LOXL2在制备促进角质形成细胞迁移进而促进创面再上皮化的药剂中的应用。
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