CN106834218A - 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 - Google Patents
人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106834218A CN106834218A CN201710008851.4A CN201710008851A CN106834218A CN 106834218 A CN106834218 A CN 106834218A CN 201710008851 A CN201710008851 A CN 201710008851A CN 106834218 A CN106834218 A CN 106834218A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- stem cell
- serum
- people
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 60
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 title claims abstract description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 26
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims abstract description 21
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 12
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 12
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 12
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 12
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N actrapid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@H](C)CC)[C@H](C)CC)[C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C(N)=O)C1=CNC=N1 YAJCHEVQCOHZDC-QMMNLEPNSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N caninsulin Chemical compound [Zn].C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC3N=CN=C3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1C=NC=N1 LEMUFSYUPGXXCM-JNEQYSBXSA-N 0.000 claims abstract description 12
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 12
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 61
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 18
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 11
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 claims description 11
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000010959 steel Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- -1 HTrf Chemical compound 0.000 abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 abstract description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 abstract 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 abstract 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 abstract 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 abstract 1
- 125000001980 alanyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 abstract 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 abstract 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 abstract 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 abstract 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 abstract 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 abstract 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 13
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 13
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 10
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 8
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 8
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 8
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 8
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 8
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 8
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 8
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 8
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 8
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 description 8
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 8
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 8
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 description 8
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 8
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 8
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 8
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 8
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 8
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 8
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 7
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 7
- 102100026844 Pancreatic prohormone Human genes 0.000 description 7
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 7
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 7
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 7
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 7
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 6
- 101150084866 MAFA gene Proteins 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 101000983116 Homo sapiens Pancreatic prohormone Proteins 0.000 description 5
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 5
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 5
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 5
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 5
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 5
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 101100129232 Danio rerio mafaa gene Proteins 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101150051019 Klrg1 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 4
- FQLOSLKSJZSARD-BYPYZUCNSA-N (4s)-4-amino-5-hydroxypentanamide Chemical class OC[C@@H](N)CCC(N)=O FQLOSLKSJZSARD-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- 101000998011 Homo sapiens Keratin, type I cytoskeletal 19 Proteins 0.000 description 3
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 3
- 208000036365 Normal labour Diseases 0.000 description 3
- 101150082372 PPY gene Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 3
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 3
- 102100035071 Vimentin Human genes 0.000 description 3
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 3
- KLLLJCACIRKBDT-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1H-indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C=C1C1=CC=CC=C1 KLLLJCACIRKBDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012549 training Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URJOZSLMTIRWFW-QGZVFWFLSA-N (4r)-4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5,6-dimethoxy-4,9-dihydro-1h-benzo[f][2]benzofuran-3-one Chemical compound C1=C2OCOC2=CC([C@H]2C3=C(COC3=O)CC3=CC=C(C(=C32)OC)OC)=C1 URJOZSLMTIRWFW-QGZVFWFLSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 101710148099 Blue fluorescence protein Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102400000320 Glicentin Human genes 0.000 description 1
- 101800002945 Glicentin Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150111723 PDX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000817 amniotic epithelial stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000000205 computational method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical class O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000000864 hyperglycemic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N keto-phenylpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)CC1=CC=CC=C1 BTNMPGBKDVTSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000015031 pancreas development Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法。该无血清培养基为DMEM/F12基础培养基中添加人表皮细胞生长因子、人转铁蛋白、人胰岛素、亚硒酸钠、丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸；其培养方法是将人羊膜用2.5g/L胰蛋白酶消化，获取人羊膜上皮干细胞，并将其过滤制成单细胞悬液；再通过上述无血清培养基，使人羊膜上皮干细胞在无血清条件下，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中，通过换液和传代培养，实现羊膜上皮干细胞在无血清培养的条件下，生长和扩增，并具有干细胞的特性，且无其他动物源性、来源广泛、不受伦理限制。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域的一种上皮细胞培养基及其培养方法，具体涉及的是一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法。
背景技术
人羊膜易于获得，具有不引起伦理学争议、所含羊膜干细胞（羊膜上皮干细胞和羊膜间充质干细胞）含量丰富、免疫原性低等特点,可成为再生医学临床应用的重要种子细胞来源。
人羊膜上皮干细胞（amniotic epithelial stem cells,AESCs）是由羊膜分离获得的干细胞之一。hAESC分化于原始的二胚层胚盘，是受精后第8天由外胚层细胞发育而来，早于三胚层胚胎的形成，这一独特的组织胚胎学来源赋予了hAESC多向分化的潜能和独特的干细胞样特性。目前已可将其分化为神经细胞和脂肪细胞等。由于其不表达HLA-A，B,C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反应；又因其缺少端粒酶，不能形成崎胎瘤，因此，对人羊膜上皮细胞培养方法的探索及生长特性的研究具有重要意义。
目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的胎牛血清或新生小牛血清。由于上述异种动物血清存在动物携带的已知或未知病原体，因此，限制了干细胞的临床应用。
无血清细胞培养技术为干细胞的无血清培养提供了可能。虽然已有发明专利羊膜间充质干细胞无血清培养基（专利号CN201010252201.2），但由于上皮干细胞与间充质干细胞属于不同类别的干细胞，故需要的培养条件和需要的无血清细胞培养基也不同；因此还需要进行创新和改进以克服其局限性，由于hAESCs不合成端粒酶，hAESCs植入体内，并不形成畸胎瘤，在干细胞应用的安全性方面较一般干细胞更具临床应用潜力。增强了临床应用的安全性，使其用途更具优势。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的问题而提供一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法，本发明解决了上皮干细胞培养存在异种血清的问题，不形成畸胎瘤，应用安全，同时也解决了同种异体、来源广泛、不受伦理限制及无免疫原性问题。
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：
DMEM／F12(按体积1:1混合)15.0～15.6g/L
表皮细胞生长因子0.005～0.015 mg/L
人转铁蛋白1.0～7.0 mg/L
人胰岛素5.5～15 mg/L
亚硒酸钠5.0～7.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500 mg/L
L-丙氨酸10～25 mg/L
L-天冬酰胺4.9～10.9 mg/L
L-天冬氨酸9.3～17.3 mg/L
L-谷氨酸10.7～18.7 mg/L
甘氨酸5.5 ～8.5 mg/L
L-脯氨酸 7.5～15.5 mg/L
L-丝氨酸6.5～11.5 mg/L
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：
（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
取人羊膜先用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30分钟～60分钟，共2～4次，得到细胞悬液；用200目～300目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～15分钟，用PH 7.2 磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转/分钟～2500转/分钟，时间为15分钟～35分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；
（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增
将第(1)步所得细胞接种于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行传代培养，每24小时～48小时全量换液一次，使人羊膜上皮干细胞通过换液和传代逐渐得到扩增和纯；。
所述人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：
DMEM／F12（按体积1:1混合）15.0～15.6g/L
表皮细胞生长因子0.005～0.015 mg/L
人转铁蛋白1.0～7.0 mg/L
人胰岛素5.5～15 mg/L
亚硒酸钠5.0～7.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500 mg/L
L-丙氨酸10～25 mg/L
L-天冬酰胺4.9～10.9 mg/L
L-天冬氨酸9.3～17.3 mg/L
L- 谷氨酸10.7～18.7 mg/L
甘氨酸5.5 ～8.5 mg/L
L-脯氨酸 7.5～15.5 mg/L
L-丝氨酸6.5～11.5 mg/L
在上述第(2)步中，择优选择将第(1)步所得细胞以2.5×l07 L-1～2.5×l010 L-1密度接种于上述无血清培养基中培养；
细胞扩增和纯化的过程如下：
将第(2)步所得细胞于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，每24小时～48小时全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每24小时～48小时全量换液1次，直至细胞贴壁彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P1代，继续上述传代培养过程，使人羊膜上皮干细胞逐渐得到扩增和纯化。
本发明的优点在于：人羊膜是胎儿出生后随胎盘排出体外，并作为“废弃物”丢弃，本发明在体外取羊膜提取人羊膜上皮干细胞，并进行无血清培养，与用含有胎牛血清的培养基培养人羊膜上皮干细胞进行比较，具有无其他动物源性、不受伦理限制及异种免疫原性等优越性。由于不合成端粒酶，hAESCs植入体内不形成畸胎瘤，在干细胞应用的安全性方面较一般干细胞更具临床应用潜力。适宜于不同个体之间的移植，是细胞治疗的理想靶细胞。具有比骨髓干细胞更强的扩增能力和免疫原性及成瘤性更低等骨髓干细胞无法比拟的优点。本发明与骨髓间充质干细胞比较，克服了骨髓间充质干细胞的取材困难及年龄等局限性，其临床应用的安全性和用途更具优势，具有经济实用性和广泛普及性，临床应用性更强。
附图说明
图1为原代培养hAESCs倒置显微镜（× 40）的示意图。
图2为细胞免疫荧光方法检测提取培养原代（P0）代hAESCs中上皮标志物上皮角蛋白CK19（× 100）和间质细胞标志物波形蛋白
（× 100）表达的示意图。
图3为无血清培养基培养P1代hAESCs 培养96小时倒置显微镜
（× 40）的示意图。
图4为含10%胎牛血清完全培养基培养P1代hAESCs培养96小时倒置显微镜（× 40）的示意图。
图5为流式细胞分析技术鉴定无血清培养基培养96小时hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，简称CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR的表达的示意图。
图6为流式细胞分析技术鉴定含10%胎牛血清培养基培养96小时hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，简称CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR的表达的示意图。
图7为MTS增殖检测分析检测无血清培养基与含10%FBS的培养基培养hAESCs细胞增殖能力的示意图。
图8为细胞免疫荧光方法检测体外诱导hAESCs向胰岛素分泌细胞分化特异性标志物Insulin、Glucagon、PPY 和Mafa基因（× 100）表达的示意图。
图9为实时定量PCR方法检测无血清培养基培养的hAESCs向胰腺细胞分化能力的检测Insulin、Glucagon、Ngn3、Pdx1和PPY基因表达的示意图。
图10为细胞免疫荧光方法检测体外诱导hAESCs 向神经细胞分化特异性标志物Nestin和β-tubulin Ⅲ基因（× 100）表达的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明：
实施例1
如图1所示，原代培养hAESCs倒置显微镜（× 40）的示意图。从人羊膜提取的原代羊膜上皮细胞形态均一，呈鹅卵石样排列。
如图2所示，细胞免疫荧光方法检测鉴定提取的hAECs表面标志物，原代提取培养的P0代hAESCs中上皮标志物上皮角蛋白CK19和间质细胞标志物波形蛋白（× 100）表达。应用红色荧光蛋白标记的驴抗小鼠荧光二抗进行杂交CK19表达强阳性，波形蛋白表达弱阳性。
如图3 所示，无血清培养基对P1代hAESCs进行培养96小时倒置显微镜图（×40）。镜下细胞形态均一，细胞呈鹅卵石样排列。
如图4所示，含10%胎牛血清完全培养基对P1代hAESCs进行培养96小时倒置显微镜图（× 40）。镜下细胞形态均一，细胞呈鹅卵石样排列。
如图5所示，流式细胞分析技术鉴定无血清培养96小时hAESCs中分化抗原簇（cluster of differentiation，简称CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR 图。结果显示 hAESCs 阳性表达CD29 、CD31 、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和SSEA-4；
不表达Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、HLA-DR 。
如图6所示，流式细胞分析技术鉴定10%胎牛血清培养基培养96小时hAESCs中CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR 图。结果显示 hAESCs 阳性表达 CD29 、CD31 、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和SSEA-4；不表达Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、HLA-DR 。
如图7所示，无血清培养hAESCs细胞增殖能力无血清培养基与含10%FBS的培养基培养hAESCs细胞增殖能力比较图。无血清培养基培养（含不同浓度 0，0.02%、0.06%、0.10%、0.20%和0.40%）人血白蛋白）hAESCs，与含10%FBS的培养基培养下，分别在培养24、48、72和96小时对细胞增殖能力进行比较。结果24小时不添加人血白蛋白组与对照组无显著差异；48和72小时不添加或添加0.02%人血白蛋白组与对照组无显著差异；96小时不添加或添加0.02%与0.06%人血白蛋白组与对照组无显著差异。
如8 所示，细胞免疫荧光方法检测无血清培养基培养的hAESCs向胰腺细胞分化特异性标志物检测。A. 定向诱导分化培养基对无血清培养的hAESCs进行培养，2周后检测结果显示诱导分化的hAESCs细胞质中Glucagon（绿色荧光）和PPY（绿色荧光）表达阳性。B. 定向诱导分化培养基对无血清培养的hAESCs进行培养，3周后免疫荧光检测结果显示Insulin（红色荧光）和Mafa（绿色荧光）表达阳性。DAPI标记的细胞核蓝色荧光均表达阳性。
如图9所示，实时定量PCR方法检测无血清培养基培养的hAESCs向胰腺细胞分化能力的检测。A. 定向诱导分化培养基对无血清培养的hAESCs进行培养2周后检测到hAESCs中Glucagon、Ngn3、Pdx1和PPY表达水平均升高。3周后检测到hAESCs中Insulin表达水平显著升高。
如图10所示，细胞免疫荧光方法检测无血清培养基培养的hAESCs定向诱导分化神经特异性标志物Nestin和β-tubulin Ⅲ表达阳性（×100）。检测结果显示定向诱导无血清培养基培养的hAECs 2周后倒置荧光显微镜下观察显示hAECs细胞质中表达神经分化特异性标志物绿色荧光蛋白标记Nestin和β-tubulin Ⅲ绿色荧光和DAPI标记的细胞核蓝色荧光均表达阳性。。
实施例2
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：
达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基／F12（简称DMEM／F12）按体积1:1混合，15.0～15.6g/L
表皮细胞生长因子0.005mg/L
人转铁蛋白1.0 mg/L
人胰岛素5.5 mg/L
亚硒酸钠5.0×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300 mg/L
L-丙氨酸10mg/L
L-天冬酰胺4.9 mg/L
L-天冬氨酸9.3 mg/L
L-左旋谷氨酸10.7 mg/L
甘氨酸5.5 mg/L
L-脯氨酸 7.5 mg/L
L-丝氨酸6.5 mg/L
制成为水溶液。
实施例3
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：
达尔伯克（氏）改良伊格尔（氏）培养基／F12（简称DMEM／F12）按体积1:1混合，15.3 g/L
表皮细胞生长因子0.01 mg/L
人转铁蛋白3.5mg/L
人胰岛素10mg/L
亚硒酸钠6.0×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽400mg/L
L-丙氨酸17mg/L
L-天冬酰胺7mg/L
L-天冬氨酸13mg/L
L-左旋谷氨酸14mg/L
甘氨酸7.0mg/L
L-脯氨酸 10mg/L
L-丝氨酸8mg/L
制成为水溶液。
实施例4
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：
DMEM／F12（按体积1:1混合）15.6g/L
表皮细胞生长因子0.015 mg/L
人转铁蛋白7.0 mg/L
人胰岛素15 mg/L
亚硒酸钠7.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽500 mg/L
L-丙氨酸25 mg/L
L-天冬酰胺10.9 mg/L
L-天冬氨酸17.3 mg/L
L-左旋谷氨酸18.7 mg/L
甘氨酸8.5 mg/L
L-脯氨酸15.5 mg/L
L-丝氨酸11.5 mg/L
制成为水溶液。
实施例5
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：
（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎盘，并在胎盘娩出5分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测，用磷酸盐缓冲液（PBS）反复漂洗后剪碎；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液浸泡20分钟。取人羊膜10×10cm2，用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30分钟分钟，共2次，收集消化液，用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转/分钟，离心5分钟分钟，用PH 7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转/分钟，时间为15分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；
（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增
将第(1)步所得细胞接种于75ml 培养瓶培养，内含5ml无血清培养液，包括：
DMEM／F12（按体积1:1混合）15.0g/L，
表皮细胞生长因子0.005 mg/L
人转铁蛋白1.0 mg/L
人胰岛素5.5 mg/L
亚硒酸钠5.0×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300 mg/L
L-丙氨酸10 mg/L
L-天冬酰胺4.9 mg/L
L-天冬氨酸9.3 mg/L
L-谷氨酸10.7 mg/L
甘氨酸5.5 mg/L
L-脯氨酸 7.5 mg/L
L-丝氨酸6.5 mg/L
接种时细胞密度采用2.5×l07 L-1
置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO 2的孵箱中进行传代培养，每24小时，全量换液1次，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每24小时，全量换液1次，待细胞达到80％融合时，按1：2的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每24小时全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代，此传代培养记为P1代，然后继续上述传代培养过程。hAESCs呈鹅卵石样排列。随着传代hAESCs培养5代以后，细胞增殖速度减慢，出现衰老现象。
实施例6
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：
（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎盘，并在胎盘娩出8分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测，用0.9%生理盐水反复漂洗后剪碎；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的0.9%生理盐水浸泡30分钟。取人羊膜10×10cm2，用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化45分钟，共3次，收集消化液，用250目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1250转/分钟，离心10分钟，用PH 7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为2000转/分钟，时间为28分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；
（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增
将第(1)步所得细胞接种于75ml 培养瓶培养，内含8ml无血清培养液，包括：
DMEM／F12（按体积1:1混合）15.3 g/L
表皮细胞生长因子0.010 mg/L
人转铁蛋白3.0 mg/L
人胰岛素10mg/L
亚硒酸钠6.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽400 mg/L
L-丙氨酸18mg/L
L-天冬酰胺8.0mg/L
L-天冬氨酸13.0mg/L
L-谷氨酸14.0mg/L
甘氨酸7.0mg/L
L-脯氨酸 10.0 mg/L
L-丝氨酸8.0mg/L
接种时细胞密度采用2.5×l07 L-1
置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO 2的孵箱中进行传代培养，每30小时，全量换液1次，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每30小时，全量换液1次，待细胞达到85％融合时，按1：2的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每48小时全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代，此传代培养记为P1代，然后继续上述传代培养过程。hAESCs呈鹅卵石样排列。随着传代hAESCs培养5代以后，细胞增殖速度减慢，出现衰老现象。
实施例7
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：
（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
取供体符合医学标准剖腹产或正常分娩的胎盘，并在胎盘娩出10分钟内，从胎膜上钝性分离羊膜；进行ABO/Rh血型检测及HLA分型检测和微生物学检测，用磷酸盐缓冲液（PBS）或0.9%生理盐水反复漂洗后剪碎；用含1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液浸泡40分钟。取人羊膜10×10cm2，用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化60分钟，共4次，收集消化液，用300目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1500转/分钟，离心15分钟，用PH 7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为2500转/分钟，时间为35分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；
（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增
将第(1)步所得细胞接种于75ml 培养瓶培养，内含10ml无血清培养液，包括：
DMEM／F12（按体积1:1混合）15.6g/L，
表皮细胞生长因子0.015 mg/L
人转铁蛋白7.0 mg/L
人胰岛素15 mg/L
亚硒酸钠7.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽500 mg/L
L-丙氨酸25 mg/L
L-天冬酰胺10.9 mg/L
L-天冬氨酸17.3 mg/L
L-谷氨酸18.7 mg/L
甘氨酸8.5 mg/L
L-脯氨酸15.5 mg/L
L-丝氨酸11.5 mg/L
接种时细胞密度采用2.5×l07 L-1
置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO 2的孵箱中进行传代培养，每48小时，全量换液1次，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，48小时，全量换液1次，待细胞达到90％融合时，按l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每72小时全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代，此传代培养记为P1代，然后继续上述传代培养过程。hAESCs呈鹅卵石样排列。随着传代hAESCs培养5代以后，细胞增殖速度减慢，出现衰老现象。
实施例8
本发明人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：
（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
取从人胎膜上钝性分离羊膜；用PH7.2的PBS（phosphate buffer saline，简称PBS）磷酸盐缓冲液反复漂洗后，取羊膜10×10cm2；置于1000U/ml庆大霉素和2.5μg/ml二性霉素B的磷酸盐缓冲液60ml中，浸泡30分钟。用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，37℃温箱消化30分钟，共3次，收集消化液，用200目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1500转/分钟，离心5分钟，用PH 7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为2500转/分钟，时间为15分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；
（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增
将第(1)步所得细胞接种于25ml 培养瓶培养，内含5ml无血清培养液，包括：
DMEM／F12（按体积1:1混合）15.3 g/L，
表皮细胞生长因子0.012 mg/L
人转铁蛋白3.8mg/L
人胰岛素16mg/L
亚硒酸钠7.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽480 mg/L
L-丙氨酸22mg/L
L-天冬酰胺9.0mg/L
L-天冬氨酸15.0mg/L
L-谷氨酸16.0mg/L
甘氨酸9.0mg/L
L-脯氨酸 15.0 mg/L
L-丝氨酸9.0mg/L
接种时细胞密度采用2.5×l010 L-1 置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的C02培养箱中进行传代培养，记为P0代；根据细胞的贴壁情况，24小时用上述无血清培养液5ml全量换液1次，待细胞达到80％融合时，按l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代。以此类推。
实施例9
本发明采用流式细胞术鉴定无血清培养与10%胎牛血清培养基培养96小时hAESCs 表型中分化抗原簇（cluster of differentiation，简称 CD）CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR基因的表达，如下：
1.取hAESCs，调整细胞密度为1×106/mL；
2.取1mL细胞悬液，冷PBS洗细胞后100uL PBS重悬细胞；
3.实验组分别加入5uL单克隆抗体CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 、Oct4、Sox2、TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4、HLA-DR基因，设置未加抗体组作为阴性对照组；
4. 4℃避光孵育30min，冷PBS冲洗3次；
5.用流式细胞仪检测。
实施例10
本发明MTS增殖检测分析检测无血清培养基与含10%FBS的培养基培养hAESCs的细胞增殖能力。如下：
1.分别将无血清培养基与含10%FBS培养基培养P2代hAESCs按8×103/孔接种于96孔板内；
2.待细胞贴壁后分别更换培养液；
3.于24、48、72和96小时分别向各孔加入20μL MTS/孔（5mg/ml）；
于37 ℃、5% CO2的孵箱内孵育2小时；
3. MTS增殖检测各孔495nM处吸光值。
实施例11
本发明采用细胞免疫荧光方法检测无血清培养hAESCs向胰岛素分泌细胞诱导分化，如下：
1、制备hAESCs细胞爬片：将处理好的干净的盖片，置入六孔板内，以2×105密度将经诱导分化后的hAESCs接种到放入盖片的六孔板内，置于37℃体积分数为5％的 CO2饱和湿度培养箱中培养；
2、固定：待细胞生长70～80％融合时，弃去培养液，用1×PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛溶液固定细胞，室温固定20分钟；
3、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×PBS，50rpm/min洗涤5分钟，重复3次；
4、封闭：加入封闭液(0.2%Triton-X-100通透，含2.5%驴血清的PBS中)， 室温封闭30分钟～60分钟；
5、一抗孵育：用500μl抗体稀释缓冲液(1×PBS，1％BSA)
1∶200稀释一抗Insulin（1:100）、Glucagon（1:100）、PPY（1:100）、Mafa（1:100）；覆盖盖片表面并置入湿盒内，4℃，过夜；
6、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗涤5分钟，重复3次；
7、二抗孵育：用500μl抗体稀释缓冲液(1×PBS，1％BSA)
1∶500稀释二抗；Insulin应用红色荧光蛋白标记的驴抗大鼠荧光二抗进行杂交；Glucagon、PPY、Mafa应用绿色荧光蛋白标记的驴抗山羊荧光二抗进行杂交，室温孵育60分钟；
8、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗涤5分 钟，重复3次；
9、核染色：用去离子水(ddH2O)按1∶1000的比例稀释二脒苯基吲哚(DAPI)储存液，工作液浓度为1μg/ml，染色1分钟，使用ddH2O 洗3次，每次5分钟；
10、封片：防淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况。观察DAPI标记的细胞核表达蓝色荧光、红色荧光蛋白标记的荧光二抗驴抗大鼠荧光二抗表达红色荧光和绿色荧光蛋白标记的驴抗山羊荧光二抗表达绿色荧光。
实施例12
本发明采用qRT-PCR检测无血清培养hAESCs向胰岛素分泌细胞诱导分化，如下：
分别收集实验组无血清培养hAESCs和对照组hAESCs，采用qRT-PCR方法对hAESCs进行胰腺发育过程中相关标志物胰岛素（Insulin）、胰高糖素（Glucagon）、PPY和Mafa基因检测。
1. 将二组hAESCs分别按照3×106个细胞/孔的密度种入预先用1%琼脂铺好的6孔板中，使其悬浮生长，待贴壁后，每3 天更换1次。诱导周期为14 天。
诱导体系完全培养基如下：DMEM/F12，10%胎牛血清，10mg/mL EGF，1% 非必须氨基酸，2mmol/mL L-谷氨酰胺；
2.诱导形成的胰岛素分泌细胞能力的鉴定
用Trizol法分别提取细胞的RNA。对提取到的RNA进行反转录合成cDNA第一链。反应条件：在95℃ 20秒解链后，95℃ 5秒，60℃ 20秒，进行45个循环。荧光定量PCR仪上，以所获得的cDNA为模板，进行qRT-PCR检测 Insulin，胰高血糖素，PPY，Mafa及GAPDH基因表达水平。以GAPDH表达作为内参标定各实验指标表达量，计算方法为2 –ΔΔCT相对定量法。
实施例13
本发明采用细胞免疫荧光方法检测无血清培养hAESCs向神经细胞分化。
1、制备hAECs细胞爬片：将处理好的干净的盖片，置入六孔板内，以2×105密度将经诱导分化后的hAESCs接种到放入盖片的六孔板内，置于37℃体积分数为5％的 CO2饱和湿度培养箱中培养；
2、固定：待细胞生长70%～80％融合时，弃去培养液，用1×PBS洗2遍，加入4％多聚甲醛溶液固定细胞，室温固定20分钟；
3、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×PBS，50rpm/min洗涤5分钟，重复3次；
4、封闭：加入封闭液(0.2%Triton-X-100通透，含2.5%驴血清的PBS中)， 室温封闭30分钟～50分钟；
5、一抗孵育：用500μl抗体稀释缓冲液(1×PBS，1％BSA)1∶200稀释一抗Nestin和β-tubulin Ⅲ；覆盖盖片表面并置入湿盒内，4℃，过夜；
6、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗涤5分钟，重复3次；
7、二抗孵育：用500μl抗体稀释缓冲液(1×PBS，1％BSA)1∶500
稀释荧光二抗，Nestin和β-tubulin Ⅲ应用绿色荧光蛋白标记的驴抗小鼠荧光二抗进行杂交，室温孵育1小时；
8、洗涤：吸净多聚甲醛，加入1×PBS 1ml，50rpm/min洗涤5分 钟，重复3次；
9、核染色：用去离子水(ddH2O)按1∶1000的比例稀释二脒苯基吲哚(DAPI)储存液，工作液浓度为1μg/ml，染色1分钟，使用ddH2O 洗3次，每次5分钟；
10、封片：防淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察荧光表达情况。观察DAPI标记的细胞核表达蓝色荧光和绿色荧光蛋白标记的驴抗小鼠荧光二抗绿色荧光表达。
Claims (2)
1.一种人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括：
DMEM／F12按体积1:1混合15.0～15.6g/L
表皮细胞生长因子0.005～0.015 mg/L
人转铁蛋白1.0～7.0 mg/L
人胰岛素5.5～15 mg/L
亚硒酸钠5.0～7.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500 mg/L
L-丙氨酸10～25 mg/L
L-天冬酰胺4.9～10.9 mg/L
L-天冬氨酸9.3～17.3 mg/L
L-谷氨酸10.7～18.7 mg/L
甘氨酸5.5 ～8.5 mg/L
L-脯氨酸 7.5～15.5 mg/L
L-丝氨酸6.5～11.5 mg/L 。
2.一种人羊膜上皮干细胞无血清培养方法，包括以下步骤：
（1）人羊膜上皮干细胞分离及单细胞悬液的制备
取人羊膜先用终浓度 2.5g/L胰蛋白酶，室温消化30分钟～60分钟，共2～4次，得到细胞悬液；用200目～300目不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000转/分钟～1500转/分钟，离心5分钟～15分钟，用PH 7.2磷酸缓冲液PBS洗2次；再离心，离心机的转速为1500转/分钟～2500转/分钟，时间为15分钟～35分钟，弃去上清液，即获得羊膜上皮干细胞；
（2）人羊膜上皮干细胞的无血清培养、纯化及扩增
将第(1)步所得细胞接种于无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行传代培养，每24小时～48小时全量换液一次，使人羊膜上皮干细胞通过换液和传代逐渐得到扩增和纯化；
所述人羊膜上皮干细胞无血清培养基，包括
DMEM／F12按体积1:1混合15.0～15.6g/L
表皮细胞生长因子0.005～0.015 mg/L
人转铁蛋白1.0～7.0 mg/L
人胰岛素5.5～15 mg/L
亚硒酸钠5.0～7.2×103 mg/L
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽300～500 mg/L
L-丙氨酸10～25 mg/L
L-天冬酰胺4.9～10.9 mg/L
L-天冬氨酸9.3～17.3 mg/L
L-谷氨酸10.7～18.7 mg/L
甘氨酸5.5 ～ 8.5 mg/L
L-脯氨酸 7.5～15.5 mg/L
L-丝氨酸6.5～11.5 mg/L
在上述第(2)步中，择优选择将第(1)步所得细胞以2.5×l07 L-1～2.5×l09 L-1密度接种于上述无血清培养基中培养；
细胞扩增和纯化的过程如下：
将第(2)步所得细胞于上述无血清培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的C02培养箱中进行培养，根据细胞生长情况，每24小时～48小时全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，然后按1：2的比例或l：3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每24小时～48小时全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程使人羊膜上皮干细胞逐渐得到扩增和纯化。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710008851.4A CN106834218B (zh) | 2017-01-06 | 2017-01-06 | 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710008851.4A CN106834218B (zh) | 2017-01-06 | 2017-01-06 | 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106834218A true CN106834218A (zh) | 2017-06-13 |
| CN106834218B CN106834218B (zh) | 2021-03-02 |
Family
ID=59118624
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710008851.4A Active CN106834218B (zh) | 2017-01-06 | 2017-01-06 | 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106834218B (zh) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107653223A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-02-02 | 江西瑞济生物工程技术股份有限公司 | 一种羊膜干细胞培养基及其培养方法 |
| CN108130309A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-08 | 徐辉明 | 人羊膜上皮细胞的无血清培养基 |
| CN109042629A (zh) * | 2018-09-27 | 2018-12-21 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 一种保存子宫内膜组织的保存液及其制备方法 |
| CN109652364A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-19 | 广州和能生物科技有限公司 | 一种人羊膜上皮细胞的无血清培养基 |
| WO2019113556A1 (en) * | 2017-12-08 | 2019-06-13 | Juno Therapeutics, Inc. | Serum-free media formulation for culturing cells and methods of use thereof |
| CN110749579A (zh) * | 2019-08-29 | 2020-02-04 | 西安医学院 | 一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法 |
| CN111793596A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-10-20 | 上海赛傲生物技术有限公司 | 一种人羊膜上皮干细胞的分离方法和制备方法 |
| CN112462062A (zh) * | 2020-04-20 | 2021-03-09 | 沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司 | 一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用 |
| CN112920995A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-08 | 赵峻岭 | 一种间充质干细胞培养血清加油包及其应用 |
| CN115227876A (zh) * | 2022-07-28 | 2022-10-25 | 福建省海西细胞生物工程有限公司 | 一种组织工程表皮的制备方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102391982A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-03-28 | 遵义医学院附属医院 | 一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法 |
| CN102492651A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-06-13 | 遵义医学院附属医院 | 一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法 |
| CN104371970A (zh) * | 2013-08-15 | 2015-02-25 | 协和华东干细胞基因工程有限公司 | 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基 |
| CN104818244A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-08-05 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 |
| CN106244521A (zh) * | 2016-08-31 | 2016-12-21 | 吉林省中科生物工程股份有限公司 | 一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途 |
-
2017
- 2017-01-06 CN CN201710008851.4A patent/CN106834218B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102391982A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-03-28 | 遵义医学院附属医院 | 一种体外诱导人羊膜间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法 |
| CN102492651A (zh) * | 2011-12-08 | 2012-06-13 | 遵义医学院附属医院 | 一种体外诱导人羊膜上皮细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法 |
| CN104371970A (zh) * | 2013-08-15 | 2015-02-25 | 协和华东干细胞基因工程有限公司 | 一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基 |
| CN104818244A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-08-05 | 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 | 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 |
| CN106244521A (zh) * | 2016-08-31 | 2016-12-21 | 吉林省中科生物工程股份有限公司 | 一种人羊膜上皮细胞、分离培养方法及用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 肖露等: "人羊膜上皮细胞的临床应用前景", 《现代妇产科进展》 * |
| 金玲等: "人羊膜上皮细胞的干细胞特性", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107653223A (zh) * | 2017-11-06 | 2018-02-02 | 江西瑞济生物工程技术股份有限公司 | 一种羊膜干细胞培养基及其培养方法 |
| JP7433230B2 (ja) | 2017-12-08 | 2024-02-19 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 細胞を培養するための無血清培地配合物およびその使用の方法 |
| WO2019113556A1 (en) * | 2017-12-08 | 2019-06-13 | Juno Therapeutics, Inc. | Serum-free media formulation for culturing cells and methods of use thereof |
| CN112041430A (zh) * | 2017-12-08 | 2020-12-04 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 用于培养细胞的无血清培养基配制品及其使用方法 |
| JP2021505148A (ja) * | 2017-12-08 | 2021-02-18 | ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド | 細胞を培養するための無血清培地配合物およびその使用の方法 |
| CN108130309A (zh) * | 2018-01-17 | 2018-06-08 | 徐辉明 | 人羊膜上皮细胞的无血清培养基 |
| CN109042629A (zh) * | 2018-09-27 | 2018-12-21 | 天津欣普赛尔生物医药科技有限公司 | 一种保存子宫内膜组织的保存液及其制备方法 |
| CN109652364A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-04-19 | 广州和能生物科技有限公司 | 一种人羊膜上皮细胞的无血清培养基 |
| CN110749579A (zh) * | 2019-08-29 | 2020-02-04 | 西安医学院 | 一种通过免疫荧光检测药物对胰岛细胞摄脂影响的方法 |
| CN111793596A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-10-20 | 上海赛傲生物技术有限公司 | 一种人羊膜上皮干细胞的分离方法和制备方法 |
| CN112462062B (zh) * | 2020-04-20 | 2023-10-03 | 沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司 | 一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用 |
| CN112462062A (zh) * | 2020-04-20 | 2021-03-09 | 沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司 | 一种羊膜干细胞外分泌蛋白的筛选鉴定方法及应用 |
| CN112920995A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-06-08 | 赵峻岭 | 一种间充质干细胞培养血清加油包及其应用 |
| CN115227876A (zh) * | 2022-07-28 | 2022-10-25 | 福建省海西细胞生物工程有限公司 | 一种组织工程表皮的制备方法 |
| CN115227876B (zh) * | 2022-07-28 | 2023-08-29 | 福建省海西细胞生物工程有限公司 | 一种组织工程表皮的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106834218B (zh) | 2021-03-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106834218A (zh) | 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 | |
| Fong et al. | Derivation efficiency, cell proliferation, freeze–thaw survival, stem-cell properties and differentiation of human Wharton’s jelly stem cells | |
| CN101914490B (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞无血清培养基及其培养方法 | |
| CN102191218B (zh) | 一种完全培养基及人羊膜间充质干细胞的培养方法 | |
| CN104164403B (zh) | 一种提取及培养脂肪干细胞的方法 | |
| CN103154241B (zh) | 用于培养羊膜来源间充质干细胞的培养基组合物和用其培养羊膜来源间充质干细胞的方法 | |
| CN106801032B (zh) | 人羊膜上皮干细胞库的构建方法 | |
| CN107012117A (zh) | 可从机体组织分离的多能干细胞 | |
| Mehrabani et al. | Growth kinetics, characterization, and plasticity of human menstrual blood stem cells | |
| CN109234229B (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| ES2611922T3 (es) | Células madre pluripotenciales obtenidas a partir de la pulpa dental | |
| CN104946590B (zh) | 成人骨髓中Muse细胞诱导为神经前体细胞的方法 | |
| CN106520676A (zh) | 从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用 | |
| CN103966159B (zh) | 人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法 | |
| RU2433172C2 (ru) | Способ получения гомогенной популяции стволовых клеток и ее применение | |
| US20130059378A1 (en) | Human epidermis-derived mesenchymal stem cell-like pluripotent cells and preparation method thereof | |
| CN108373990B (zh) | 人羊膜上皮干细胞向黑色素细胞诱导分化培养基及其方法 | |
| CN105331579A (zh) | 人睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途 | |
| CN104212763A (zh) | 一种睾丸间质干细胞的分离、培养方法及其用途 | |
| CN106939295A (zh) | 多能性干细胞的非致瘤性增殖 | |
| CN104726401A (zh) | 一种利用胎盘间充质干细胞提高脐血间充质干细胞培养成功率的方法 | |
| AU2020103493A4 (en) | A method for isolating hair follicle stem cells | |
| CN106834217B (zh) | 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用 | |
| US10542743B2 (en) | Isolation, expansion and characterization of wharton's jelly mesenchymal stem cells | |
| CN105683358A (zh) | 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为脂肪细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20180202 Address after: Two street 110000 Liaoning city of Shenyang Province Hunnan wisdom No. 400-4 Applicant after: Shenyang Amy bio engineering technology R & D Center Co., Ltd. Address before: 110000 Liaoning city of Shenyang province Shenbei New Area Po Road No. 77 Applicant before: Pang Xining |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |