CN104946590B - 成人骨髓中Muse细胞诱导为神经前体细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物学技术领域，提供了一种从成人骨髓中分离得到Muse细胞，并体外诱导为Muse‑NPCs的方法，并从形态观察、细胞表型、多向分化能力以及成瘤性等方面对Muse细胞以及诱导形成的Muse‑NPCs进行了鉴定，采用本发明的方法培养得到的Muse细胞及Muse‑NPCs的相关分子标识确是完全的表达。本发明还提供了根据该方法从成人骨髓中分离得到的Muse细胞，以及Muse细胞诱导分化得到的Muse‑NPCs。本发明在体外成功诱导形成Muse‑NPCs，其持续增殖、多向分化和自体来源的特性可以为今后神经损伤的细胞治疗和组织工程治疗提供新的良好的种子细胞。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物技术领域，涉及一种细胞的分离和诱导分化，具体即从成人骨髓中分离出Muse细胞并体外诱导成神经前体细胞的方法。
背景技术
脊髓损伤后，中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞大量凋亡、死亡，仅存的极少量神经干细胞无法足量补充丢失的神经细胞，且受损的神经元再生能力也相对较弱，这是导致轴突再生和功能恢复障碍的重要原因之一。为了补充丢失的神经细胞，有必要对损伤脊髓进行细胞治疗，而如何选取合适的种子细胞则是细胞治疗面临的首要和关键问题。各种干细胞因为具有多向分化潜能和自我复制能力而被广泛应用，目前已报道的应用研究于神经损伤的干细胞有：(1)成体干细胞：由于是天然的多能干细胞，曾被认为能安全应用于临床，但是由于它们最初在活体器官中的角色是维持和修补其所在组织的细胞类型，因此分化能力较为局限，尤其在来源较方便、研究较多的中胚层干细胞跨胚层分化方面更是如此；即使是同一分化方向的神经干细胞，也由于取材困难同样较难应用于临床。(2)胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)：是从胚泡内细胞群分离得到的全能干细胞，能经诱导分化为机体几乎所有的细胞类型，但由于伦理学问题和致瘤性而备受争议。(3)诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPS cell)：可以从体细胞得到在细胞倍增能力、分化能力等方面都与ES细胞相似的多能干细胞，且没有伦理学争议；但是添加4个重新编程基因或取代疾病细胞中有缺陷基因的方法都可能有致瘤的副作用，目前还没有明确的检测和消除其所含未分化致瘤细胞的方法。(4)间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)：存在于人体发生、发育过程的多种组织中，如真皮、骨髓、脂肪组织和脐带等中均可分离和制备MSCs。与造血干细胞和神经干细胞等一般成体干细胞不同，MSCs的成分复杂，且各种细胞分化能力差异较大，其中仅少部分细胞的分化方向较广泛，具有向内、中、外三个胚层分化和自我更新的干细胞特性，且与ES细胞相比没有伦理学的困扰，因此成为细胞替代治疗和组织工程的热点细胞。目前研究最多的是骨髓来源的间充质干细胞，大部分报道是通过差速贴壁法来分离获取这种细胞，实际上得到的是骨髓基质细胞(bone marrowstromal cells,BMSCs)，免疫表型鉴定为CD29、CD49、CD73、CD90、CD105和Stro-1阳性，CD11b和CD45阴性。虽然BMSCs已被证明在体外、体内能分化为神经细胞，我们前期试验也发现体内移植BMSCs可以少部分分化为neurofilament(NF)免疫反应阳性的神经细胞，但分化率仅5％左右。所以实际上BMSCs中存在的MSCs仅是一群数量少、且分化能力有差异的干细胞亚群，仅通过贴壁这种简单的筛选方法得到的原代培养细胞大多是异种间充质细胞群，含有大比例的多种不同表型和功能的非干细胞；当移植到体内，能真正分化为所在组织相关细胞的数量极少，多数报道仅为百分之几，而更多的阳性效果可能是由于移植细胞分泌细胞因子等方面的间接作用，因此这种方法得到的BMSCs作为种子细胞移植并不能充分发挥干细胞治疗的优势。当采用BMSCs作为脊髓损伤修复应用的种子细胞时，植入前即有必要对其进行纯化，筛选出其中真正的多能干细胞，以进一步提高干细胞移植治疗的效果。
2010年，Mari Dezawa等从BMSCs和皮肤纤维母细胞中分离出多系分化持续应激细胞(multilineage differentiating stress enduring cells，Muse cells)，Muse细胞可以从间充质中，如皮肤、脂肪组织、骨髓中分离得到，对胰蛋白酶长时间孵育等限制性的培养条件有很好的适应力。Muse细胞表现未分化胚胎干细胞标记物—阶段特异性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-3，SSEA-3)阳性，以及间充质细胞标记物CD105、CD29、CD90阳性。Muse细胞在黏附培养基中呈成纤维细胞样形态；单个Muse细胞悬浮培养后，细胞开始增殖并形成细胞球，其形态类似于ES细胞的胚状体，并表达多能干细胞相关标志物，如Oct3/4、Sox2、Nanog和ALP等；但不表达其他干细胞的标记物，如造血干细胞(CD34、CD117)、皮肤前体细胞(Snai1、Slug)、神经嵴前体细胞(CD271、Sox10)、血管周细胞(NG2、CD146)和内皮前体细胞(CD31、von Willebrand factor)等，表明Muse细胞与骨髓、真皮等间充质中的已知干细胞不同。通过实验确认Muse细胞至第5代仍具有自我更新的能力。当Muse细胞球转移至明胶培养基中，可自发分化为三个胚层的细胞：内胚层细胞(肝细胞、胆管细胞)，中胚层细胞(骨细胞、平滑肌细胞)，外胚层细胞(表皮细胞)。虽然都具有向三个胚层分化的潜能，但与ES细胞和iPS细胞不同的是，Muse细胞移植进入免疫缺陷小鼠体内并不会形成畸胎瘤(参见文献：Kuroda Y,Kitada M,Wakao S,et al.Unique multipotentcells in adult human mesenchymal cell populations.Proc Natl Acad SciUSA.2010；107(19):8639–43.；Kitada M,Wakao S,Dezawa M.Muse cells and inducedpluripotent stem cell:implication of the elite model.Cell Mol Life Sci.2012；69(22):3739–50.；Wakao S,Kitada M,Kuroda Y,et al.Multilineage-differentiatingstress-enduring(Muse)cells are a primary source of induced pluripotent stemcells in human fibroblasts.Proc Natl Acad Sci USA.2011；108(24):9875-80.)。
综上所述，Muse细胞是在天然单细胞水平上具有多能干细胞特性和自我更新能力的干细胞，它同时克服了ES细胞、iPS细胞以及其他成体干细胞在体内移植治疗研究中的许多不足。Muse细胞作为理想的种子细胞已被用于一些小鼠损伤的模型修复研究中，如人Muse细胞修复骨骼肌退变、糖尿病、急性重症肝炎等，结果发现Muse细胞在这些损伤组织中能顺利和宿主组织整合并分别向相应胚层的细胞分化，最终促成组织重建。
但Muse细胞在神经系统中，尤其是脊髓损伤方面的应用研究还未见报道，也无文献报道从成人骨髓中分离出Muse细胞并体外诱导成神经前体细胞(neural precursorcells，NPCs)。
本领域也一直致力于寻找在神经系统损伤后进行细胞治疗和组织工程治疗的合适的种子细胞，种子细胞需要寻找取材方便、增殖力强、无伦理学问题的新的细胞来源。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从成人的骨髓中分离出Muse细胞，并体外诱导成神经前体细胞(Muse-NPCs)的方法，本发明的另一目的在于提供上述方法制备得到的神经前体细胞。
新近发现的Muse细胞是不同于已知干细胞的独特亚群，存在于骨髓、BMSCs等间充质或间充质细胞中，可以从自体方便获取，具有多能干细胞标志及生物学特性。从骨髓中分离出Muse细胞，并经体外诱导为Muse-NPCs作为种子细胞，可以为神经系统损伤的干细胞治疗和组织工程治疗提供有力的支持。
本发明的技术关键在于，如何将成人骨髓中的Muse细胞筛选、分离出来，如何将Muse细胞在体外成功诱导成Muse-NPCs。
本发明提供了一种从成人的骨髓中分离Muse细胞并诱导分化为神经前体细胞(Muse-NPCs)的方法，流程如图1所示，具体步骤如下：
A、从成人骨髓中分离、培养Muse细胞：
将健康成人骨髓采用密度梯度离心法分离骨髓单核细胞，所述的密度梯度离心法，为本领域常规技术，可参见LM,Noack S,Weist R,Jagodzinski M,Krettek C,Buettner M,Hoffmann A.Analysis of surface protein expression in human bonemarrow stromal cells:new aspects of culture-induced changes,inter-donordifferences and intracellular expression.Stem Cells Dev.2013Dec 15；22(24):3226-35.
采用差速贴壁法，24小时后BMSCs贴壁，倒去悬浮的未贴壁细胞，加入新的DMEM/F12完全培养基常规培养5天至10天(最优为7天)，所述的差速贴壁法，为本领域常规技术，可参见Mareddy S1,Crawford R,Brooke G,Xiao Y.Clonal isolation andcharacterization of bone marrow stromal cells from patients withosteoarthritis.Tissue Eng.2007Apr；13(4):819-29.
用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，并以105/ml的密度接种于培养皿中培养6小时至10小时(最优为8小时)，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于预先经过polyHEMA包被处理的培养板中常规培养，3-7天后形成Muse细胞球；
B、Muse细胞的扩增和传代：
将Muse细胞球吸出移入离心管，1000rpm离心5分钟至10分钟(最优为5分钟)，加入0.25％Trypsin-EDTA消化5分钟至8分钟(最优为5分钟)，终止胰酶反应后洗涤，DMEM/F12完全培养基吹打成单细胞悬液，以105/ml的密度接种至培养皿中常规培养，可见Muse细胞贴壁生长，数量扩增，4天后用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于预先经过polyHEMA包被处理的培养板中常规培养，2天即可见Muse细胞球形成；
C、Muse细胞的鉴定：
光镜观察Muse细胞球形成情况；
流式细胞仪鉴定Muse细胞的细胞表型；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞球的多能干细胞标记物表达情况；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞向三个胚层分化的能力；
D、体外诱导Muse分化成神经前体细胞Muse-NPCs：
将Muse细胞球吸出后用0.25％Trypsin-EDTA消化5分钟至8分钟(最优为5分钟)，终止胰酶反应后1000rpm离心5分钟至10分钟(最优为5分钟)，用神经诱导培养基重悬细胞，反复吹打成单细胞悬液，以5×104/ml的密度接种于培养皿中，常规培养3-7天后可见Muse-NPCs细胞球形成；
所述的神经诱导培养基的配方为DMEM/F12，1％青霉素-链霉素双抗，1％B27，20ng/ml EGF，和20ng/ml bFGF；
E、Muse-NPCs的鉴定：
光镜观察Muse-NPCs的细胞球形成情况；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse-NPCs的多能神经干细胞标记物表达情况。
在本发明的一个优选实施例中，步骤A、从成人骨髓中分离、培养Muse细胞：
将健康成人骨髓2-3ml，采用密度梯度离心法分离骨髓单核细胞，即用PBS等体积稀释骨髓后，缓慢加在3ml Histopaque-1077上方，2000rpm离心30min，吸出第二层云雾状薄膜层，加入PBS洗涤2次后用DMEM/F12完全培养基(DMEM/F12，15％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗)重悬细胞，以5×105/ml的密度种于培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养。根据差速贴壁的原理，24h后BMSCs贴壁，倒去悬浮的未贴壁细胞，加入新的DMEM/F12完全培养基常规培养7d。利用Muse细胞对胰蛋白酶应激耐受的特点，用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，并以105/ml的密度接种于培养皿中培养8h，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基(DMEM/F12，20％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗，0.9％MethoCult)重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于24孔板(培养板预先经过polyHEMA包被处理)中常规培养，3-7d后形成Muse细胞球。
在本发明的一个优选实施例中，步骤B、Muse细胞的扩增和传代：
用200μl枪头将Muse细胞球吸出移入15ml离心管，1000rpm离心5min，加入0.25％Trypsin-EDTA消化5min，终止胰酶反应后洗涤，DMEM/F12完全培养基吹打成单细胞悬液，以105/ml的密度接种至培养皿中常规培养，可见Muse细胞贴壁生长，数量扩增，4d后用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于24孔板(培养板预先经过polyHEMA包被处理)，常规培养2d即可见Muse细胞球形成，成球率高于原代Muse细胞。
在本发明的一个优选实施例中，步骤C、Muse细胞的鉴定：
光镜观察Muse细胞球形成情况；流式细胞仪鉴定Muse细胞的细胞表型(CD90、CD105、CD11b、CD45，SSEA-3等)；免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞球的多能干细胞标记物表达情况(Nanog、Oct3/4、Sox2等)；免疫荧光细胞化学技术(外胚层标记物neurofilament-M、中胚层标记物α-smooth muscle actin、内胚层标记物α-fetoprotein)和RT-PCR技术(外胚层标记物MAP-2、中胚层标记物Nkx2.5、内胚层标记物GATA6)检测Muse细胞向三个胚层分化的能力。
在本发明的一个优选实施例中，步骤D、体外诱导Muse分化成Muse-NPCs：
将Muse细胞球吸出后用0.25％Trypsin-EDTA消化5min，终止胰酶反应后1000rpm离心5min，用神经诱导培养基(DMEM/F12，1％青霉素-链霉素双抗，1％B27，20ng/ml EGF，20ng/ml bFGF)重悬细胞，用枪头反复吹打成单细胞悬液，以5×104/ml的密度接种于培养皿中，常规培养3-7d后可见Muse-NPCs细胞球形成。
在本发明的一个优选实施例中，步骤E、Muse-NPCs的鉴定：
光镜观察Muse-NPCs的细胞球形成情况；免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse-NPCs的多能神经干细胞标记物表达情况(nestin、βⅢ-tubulin、GFAP、neuroglycanC等)。
将Muse-NPCs(约105个)移植入裸鼠体内，利用小动物活体成像系统动态观察移植细胞成瘤情况，6个月后取出移植细胞进行成瘤分析。
本发明经实验证实已成功诱导为神经前体细胞(NPCs)，且无致瘤性。
本发明分化得到的Muse-NPCs可以安全的应用于基础研究和临床研究。
进一步地，本发明还提供了根据上述方法从成人骨髓中分离得到的Muse细胞，以及Muse细胞体外诱导分化成的Muse-NPCs。
本发明利用Muse细胞的胰蛋白酶应激耐受特性，通过胰酶处理从成人骨髓中筛选出Muse细胞，取材简单，操作方便；利用神经诱导培养基，首次成功体外诱导形成Muse-NPCs，其持续增殖、多向分化和自体来源的特性可以为今后神经损伤的细胞治疗和组织工程治疗提供新的良好的种子细胞。
且本发明采用的是自体骨髓，从中分离分化出的Muse-NPCs便于今后自体移植修复神经系统的损伤，临床应用于病患可以克服免疫排斥、伦理学等多种问题。
附图说明
图1是从成人骨髓中分离出Muse细胞并诱导分化为Muse-NPCs的流程模式图；
图2是Muse细胞球的相差显微镜像，其中A为10倍相差显微镜像，B为40倍相差显微镜像；
图3是Muse-NPCs细胞球的相差显微镜像，其中A为10倍相差显微镜像，B为40倍相差显微镜像。
具体实施方式
下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：成人骨髓中分离、培养Muse细胞并体外诱导成Muse-NPCs
实验材料与试剂：
健康志愿者，男性，40岁龄，体重75kg(南通大学附属医院血液内科，通大附伦理审查(科研)2013-013)。
Histopaque-1077，polyHEMA，B27，EGF，bFGF(以上试剂均购自Sigma公司)
DMEM/F12，胎牛血清，青霉素-链霉素双抗，Trypsin-EDTA(以上试剂均购自Gibco公司)
MethoCult(购自Stemcell公司)
CD90、CD105、CD11b、CD45，SSEA-3(以上抗体均购自eBioscience公司)Nanog、Oct3/4、Sox2(以上抗体均购自Millipore公司)
neurofilament-M、α-smooth muscle actin、α-fetoprotein、nestin、βⅢ-tubulin、GFAP，neuroglycan C(以上抗体均购自Abcam公司)
细胞总RNA抽提试剂盒(购自Invitrogen公司)
TagDNA聚合酶(购自TaKaRa公司)
引物序列由Invitrogen公司合成
一、从成人骨髓中分离、培养Muse细胞
抽取健康成年男性髂骨骨髓2-3ml用PBS等体积稀释，缓慢加在3mlHistopaque-1077上方，2000rpm离心30min，吸出第二层云雾状薄膜层，加入PBS洗涤2次后用DMEM/F12完全培养基(DMEM/F12，15％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗)重悬细胞，以5×105/ml的密度种于培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养。24h后倒去悬浮未贴壁细胞，加入新的DMEM/F12完全培养基常规培养7d。用0.25％Trypsin-EDTA重悬细胞，并以105/ml的密度接种于培养皿中培养8h，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基(DMEM/F12，20％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗，0.9％MethoCult)重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于24孔板(培养板预先经过polyHEMA包被处理)中常规培养，4d后形成Muse细胞球。
本发明采用的是自体骨髓，从中分离分化出的Muse-NPCs便于今后自体移植修复神经系统的损伤，临床应用于病患可以克服免疫排斥、伦理学等多种问题。
二、Muse细胞的扩增和传代：
用200μl枪头将Muse细胞球吸出移入15ml离心管，1000rpm离心5min，加入0.25％Trypsin-EDTA消化5min，终止胰酶反应后洗涤，DMEM/F12完全培养基吹打成单细胞悬液，以105/ml的密度接种至培养皿中，常规培养4d后用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于24孔板(培养板预先经过polyHEMA包被处理)，常规培养2d后形成第二代Muse细胞球。
三、Muse细胞的鉴定：
1、观察Muse细胞球形成情况：细胞呈克隆状增殖，集落边缘光滑、清晰，细胞排列紧密，如图2所示。
2、鉴定Muse细胞的细胞表型：流式细胞仪检测结果显示阳性细胞率分别为CD9092.3％、CD10595.4％、SSEA-393.5％、CD11b 2.75％、CD453.72％。
3、检测Muse细胞的多能干细胞标记物表达情况：免疫荧光细胞化学染色结果显示Nanog(+)、Oct3/4(+)、Sox2(+)，RT-PCR检测结果显示Nanog、Oct3/4、Sox2基因强表达。
4、检测Muse细胞向三个胚层分化的能力：免疫荧光细胞化学染色结果显示neurofilament-M(+)、α-smooth muscle actin(+)、α-fetoprotein(+)；RT-PCR检测结果显示MAP-2、Nkx2.5、GATA6基因强表达。
四、体外诱导Muse分化成Muse-NPCs：
将Muse细胞球吸出后用0.25％Trypsin-EDTA消化5min，终止胰酶反应后1000rpm离心5min，用神经诱导培养基(DMEM/F12，1％青霉素-链霉素双抗，1％B27，20ng/ml EGF，20ng/ml bFGF)重悬细胞，用枪头反复吹打成单细胞悬液，以5×104/ml的密度接种于培养皿中，37℃，常规培养7d后可见Muse-NPCs细胞球形成。
五、Muse-NPCs的鉴定：
1、Muse-NPCs的形态观察：细胞以克隆状增殖，胞体透亮，边缘清晰，7d后形成细胞集落，细胞间排列紧密，如图3所示。
2、Muse-NPCs的多能神经干细胞标记物表达情况：免疫荧光细胞化学染色结果显示nestin(+)、βⅢ-tubulin(+)、GFAP(+)，neuroglycan C(+)；RT-PCR检测结果nestin、βⅢ-tubulin、GFAP、neuroglycan C基因强表达。
3、Muse-NPCs的成瘤性检测：将Muse-NPCs移植入裸鼠体内，通过小动物活体成像系统观察和成瘤分析结果显示移植入细胞无致瘤性，说明分化得到的Muse-NPCs可以安全的应用于基础研究和临床研究。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式不受上述实施例的限制。其他任何不脱离本发明之精神和原理下所作的变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种从成人骨髓中分离Muse细胞并诱导分化为神经前体细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
A、从成人骨髓中分离、培养Muse细胞：
将健康成人骨髓2-3ml，用PBS等体积稀释骨髓后，缓慢加在3ml Histopaque-1077上方，2000rpm离心30min，吸出第二层云雾状薄膜层，加入PBS洗涤2次后用DMEM/F12完全培养基重悬细胞，以5×105/ml的密度种于培养皿中，37℃、5％CO2的培养箱中培养；
24h后BMSCs贴壁，倒去悬浮的未贴壁细胞，加入新的DMEM/F12完全培养基常规培养7d；
用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，并以105/ml的密度接种于培养皿中培养8h，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于预先经过polyHEMA包被处理的24孔板中常规培养，4d后形成Muse细胞球；
所述的DMEM/F12完全培养基的配方为：DMEM/F12、15％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗；
所述的MC培养基配方为：DMEM/F12、20％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗和0.9％MethoCult；
B、Muse细胞的扩增和传代：
将Muse细胞球吸出移入离心管，1000rpm离心5分钟至10分钟，加入0.25％Trypsin-EDTA消化5分钟至8分钟，终止胰酶反应后洗涤，DMEM/F12完全培养基吹打成单细胞悬液，以105/ml的密度接种至培养皿中常规培养，可见Muse细胞贴壁生长，数量扩增，4天后用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于预先经过polyHEMA包被处理的培养板中常规培养，2天即可见Muse细胞球形成；
C、Muse细胞的鉴定：
光镜观察Muse细胞球形成情况；
流式细胞仪鉴定Muse细胞的细胞表型；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞球的多能干细胞标记物表达情况；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞向三个胚层分化的能力；
D、体外诱导Muse分化成神经前体细胞Muse-NPCs：
将Muse细胞球吸出后用0.25％Trypsin-EDTA消化5分钟至8分钟，终止胰酶反应后1000rpm离心5分钟至10分钟，用神经诱导培养基重悬细胞，反复吹打成单细胞悬液，以5×104/ml的密度接种于培养皿中，常规培养7天后可见Muse-NPCs细胞球形成；
所述的神经诱导培养基的配方为：DMEM/F12、1％青霉素-链霉素双抗、1％B27、20ng/mlEGF和20ng/ml bFGF；
E、Muse-NPCs的鉴定：
光镜观察Muse-NPCs的细胞球形成情况；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse-NPCs的多能神经干细胞标记物表达情况。
2.根据权利要求1所述的一种从成人骨髓中分离Muse细胞并诱导分化为神经前体细胞的方法，其特征在于，步骤B、Muse细胞的扩增和传代：
用200μl枪头将Muse细胞球吸出移入15ml离心管，1000rpm离心5min，加入0.25％Trypsin-EDTA消化5min，终止胰酶反应后洗涤，DMEM/F12完全培养基吹打成单细胞悬液，以105/ml的密度接种至培养皿中常规培养，可见Muse细胞贴壁生长，数量扩增，4d后用0.25％Trypsin-EDTA重悬贴壁细胞，终止胰酶反应后洗涤，MC培养基重悬细胞，以8×103/ml的密度，每孔1ml接种于预先经过polyHEMA包被处理的24孔板，常规培养2d后形成Muse细胞球。
3.根据权利要求1所述的一种从成人骨髓中分离Muse细胞并诱导分化为神经前体细胞的方法，其特征在于，步骤C、Muse细胞的鉴定中，
流式细胞仪鉴定Muse细胞的细胞表型CD90、CD105、CD11b、CD45和SSEA-3；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse细胞球的多能干细胞标记物Nanog、Oct3/4和Sox2表达情况；
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测外胚层标记物neurofilament-M、中胚层标记物α-smooth muscle actin、内胚层标记物α-fetoprotein、外胚层标记物MAP-2、中胚层标记物Nkx2.5和内胚层标记物GATA6。
4.根据权利要求1所述的一种从成人骨髓中分离Muse细胞并诱导分化为神经前体细胞的方法，其特征在于，步骤E、Muse-NPCs的鉴定中，
免疫荧光细胞化学技术和RT-PCR技术检测Muse-NPCs的多能神经干细胞标记物nestin、βⅢ-tubulin、GFAP和neuroglycan C表达情况。
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