CN104419661B - 神经干细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及神经干细胞的制备方法。具体而言，本发明公开了一种诱导人间充质干细胞获得神经干细胞的方法，将间充质干细胞在第一、第二、第三培养基中依次进行培养从而获得神经干细胞。最终获得的神经干细胞表达早期神经干细胞的标志，且能分化为有功能的神经元及神经胶质细胞。
Description
技术领域
本发明涉及再生医学领域。具体而言，涉及一种神经干细胞的制备方法。更具体而言，本发明涉及一种将间充质干细胞诱导为神经干细胞的方法。
背景技术
神经系统退行性病变的发病率逐年上升，主要表现为神经细胞的功能异常或细胞的进行性丢失，是临床常见的难治性疾病。对于机体自身而言，功能异常的神经细胞很难自行修复，而机体自身有限的神经再生能力亦不能满足修复损伤或细胞替代所需细胞数量的需求。目前，对于这些难治性疾病，临床上一般采用细胞营养疗法或药物治疗，但是收效甚微，尚未有安全有效的治疗方法。因此，对于神经系统退行性病变的治疗成为临床上一大难题。
随着再生医学的发展，干细胞移植疗法应运而生，受到人们的广泛关注。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。我们可以在体外分离获得自体、同种异体或异种的干细胞，将其回输给患者，治疗相关疾病。干细胞移植疗法的提出为多种难治性或高发性疾病的治疗提供了新的途径，也为神经系统退行性病变的患者带来了新的希望。
神经干细胞（Neural stem cells，NSCs）是一种多能成体干细胞，能进一步分化为终末神经细胞类型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。若将NSCs移植到损伤或病变部位，通过其在机体环境内的自发分化，替代功能受损或者凋亡的神经细胞，有望攻克上述医学难题，彻底治愈此类疾病。研究表明，直接将NSCs移植入受损小鼠损伤区域后，能明显减少神经凋亡，改善神经系统的运动功能，促进损伤区域的恢复，明显改善由神经元丢失所导致的认知功能障碍，因此NSCs是干细胞替代治疗神经系统疾病的理想种子细胞来源。
然而，NSCs的临床应用还存在诸多问题。首先，NSCs的来源困难，数量有限。目前，NSCs可由胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）或诱导性多能干细胞（inducedPluripotent stem cells，iPSCs）分化而来，也可直接从成体神经组织中分离获得。然而ESCs和iPSCs的使用存在伦理及免疫排斥问题，且由于缺乏严格的筛选体系，ESCs或iPSCs来源的NSCs可能含有未分化完全的多能干细胞，其使用存在致瘤的风险。有学者尝试从胚胎或者成体脑组织中分离NSCs，但胚胎NSCs的使用同样不能回避伦理问题；在成体组织中，NSCs主要存在于大脑半球的海马及室管膜下区，不易分离提取，因此无论从胚胎还是成体组织中获得的NSCs，其来源有限，难以获得足够数量的细胞，不能满足临床治疗的需求。其次，虽然干细胞的免疫原性较低，但是异体来源的NSCs移植仍然存在免疫排斥问题，极大的影响移植的效果。最后，存在于成体脑组织不同区域的NSCs因分化阶段不同，具有不同的特性，这就对临床用药方案的制定及疗效的评估造成了一定的障碍，极大地限制了该疗法的推广应用。因此，寻找一种NSCs的新来源是目前急需解决的问题。
干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植的理想细胞。在个体发育过程中，存在各种形式的干细胞，如胚胎干细胞、多能干细胞以及各种组织中的定向干细胞，如造血干细胞、神经干细胞等，但在实际应用上却面临伦理的挑战或取材的限制。间充质干细胞（MSC）是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，因其在特定环境下可诱导分化为多种组织细胞，且具有免疫原性低、移植后能形成稳定嵌合等特点，故可作为一种理想的供异基因移植的细胞。因为MSC亚全能干细胞可获得向内胚层组织分化的潜在能力、容易取材、来源更为丰富且不受伦理限制及没有成瘤危险，因此使用间充质干细胞体外诱导获得神经干细胞在临床上具有更高的应用价值。
发明内容
根据本发明的一方面，提供一种神经干细胞的制备方法，其包括步骤：
1）获得间充质干细胞；
2）将间充质干细胞在第一培养基中进行培养；
3）之后转入第二培养基中进行培养；
4）之后转入第三培养基中进行培养；
5）收集神经干细胞。
在一些具体的实施方式中，采用本领域常规方法获得间充质干细胞。
在一些具体的实施方式中，间充质干细胞是人脂肪来源的间充质干细胞。
在一些具体的实施方式中，间充质干细胞是使用本领域公知的分离培养方法获得的第3-5代间充质干细胞。在另一些具体的实施方式中，也可以使用市售的第3-5代间充质干细胞。
在一些具体的实施方式中，将间充质干细胞接种于第一培养基中，培养6-10天，优选8天，此时细胞体积变大，由梭形转变为上皮样细胞形态。
在一些具体的实施方式中，将完成步骤2）的细胞转接于第二培养基中，培养5-9天，优选7天，细胞体积变小，形态趋于一致。
在一些具体的实施方式中，将完成步骤3）的细胞转接于第三培养基中，培养5-9天，优选7天，得到神经干细胞，此时细胞胞体圆缩，边缘透亮，铁壁不牢，容易脱离培养瓶底部悬浮生长。
在一些具体的实施方式中，步骤2）至步骤4）的培养条件为：在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养。
根据本发明的另一方面，提供一种制备神经干细胞的试剂盒，其包括第一培养基、第二培养基和第三培养基，其中：
所述第一培养基包括：动物细胞基础培养基、150-250ml/L血清替代物、5-15ml/L非必须氨基酸、0.05-0.15mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5-1.5mmol/L L-谷氨酰胺和0-10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。
所述第二培养基包括：动物细胞基础培养基、5-15ml/L N2添加剂、10-30ml/L B27添加剂、0.05-0.15mmol/Lβ-巯基乙醇和0.5-1.5mmol/L L-谷氨酰胺。
所述第三培养基包括：动物细胞基础培养基、5-15ml/L N2添加剂、10-30ml/L B27添加剂、0.05-0.15mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5-1.5mmol/L L-谷氨酰胺、15-25ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和15-25ng/ml表皮细胞生长因子。
在一些具体的实施方式中，第一培养基的基础培养基为Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12培养基。
在一些具体的实施方式中，第二培养基的基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基。
在一些具体的实施方式中，第三培养基的基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基。
在一些具体的实施方式中，第一培养基由如下组成：Knockout DMEM或KnockoutDMEM/F12培养基、200ml/L Knockout血清替代物、10ml/L非必须氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L L-谷氨酰胺和3-5ng/ml b-FGF，优选4ng/ml b-FGF。
在一些具体的实施方式中，第二培养基由如下组成：体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基、10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺和0.1mmol/Lβ-巯基乙醇。
在一些具体的实施方式中，第三培养基由如下组成：体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基、10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF。
根据本发明的一方面，提供一种根据上述方法获得的神经干细胞，其细胞表面标志物为Sox1阳性、Pax6阳性、巢蛋白阳性和波形蛋白阳性。
根据本发明的一方面，提供上述方法获得的神经干细胞在制备用于治疗脑损伤或神经系统退行性疾病的药物中的用途。其中，神经系统退行性疾病选自帕金森和阿尔茨海默病。
根据本发明的一方面，提供一种神经元的制备方法，其包括步骤：
1）获得间充质干细胞；
2）将间充质干细胞在第一培养基中进行培养；
3）之后转入第二培养基中进行培养；
4）之后转入第三培养基中进行培养；
5）获得神经干细胞；
6）将神经干细胞在第四培养基中进行诱导培养；
7）获得神经元；
其中
第四培养基由DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、10ml/L N2添加剂、20ml/LB27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.5μmol/L维甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L马血清和10ng/ml脑源性神经营养因子组成。
根据本发明的一方面，提供一种神经胶质细胞的制备方法，其包括步骤：
1）获得间充质干细胞；
2）将间充质干细胞在第一培养基中进行培养；
3）之后转入第二培养基中进行培养；
4）之后转入第三培养基中进行培养；
5）获得神经干细胞；
6）将神经干细胞在第五培养基中进行诱导培养；
7）获得神经胶质细胞；
其中
第五培养基由DMEM/F12、Neurobasal培养基、10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.5μmol/L维甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L马血清和10ng/ml血小板衍生生长因子组成。
附图说明
图1：第3代人脂肪来源间充质干细胞形态。
图2：人脂肪来源间充质干细胞免疫表型鉴定。人脂肪来源间充质干细胞表达Flk1、CD29、CD44、CD105、及HLA-ABC，不表达CD31、CD34、CD106及HLA-DR（横坐标为荧光强度，以10为底数；纵坐标为计数）。
图3A：第3代人脂肪来源间充质干细胞形态。
图3B：人脂肪来源间充质干细胞在培养基A中培养8天后细胞形态。
图3C：培养基A培养8天后细胞在培养基B中培养7天后细胞形态。
图3D：.经培养基A和B培养后细胞在培养基C中培养7天后细胞形态。
图4：免疫荧光染色鉴定人脂肪来源的间充质干细胞及诱导获得的神经干细胞中Sox1、Pax6、巢蛋白（Nestin）及波形蛋白（Vimentin）的表达情况。
图5A：人脂肪来源的间充质干细胞和诱导获得的细胞中神经干细胞标志基因Sox1的表达情况。
图5B：人脂肪来源的间充质干细胞和诱导获得的细胞中神经干细胞标志基因Pax6的表达情况。
图5C：人脂肪来源的间充质干细胞和诱导获得的细胞中神经干细胞标志基因巢蛋白的表达情况。
图5D：人脂肪来源的间充质干细胞和诱导获得的细胞中神经干细胞标志基因波形蛋白的表达情况。
图6A：诱导获得的神经干细胞向神经元分化潜能鉴定，神经元样细胞形态。
图6B：诱导获得的神经干细胞向神经元分化潜能鉴定，神经元样细胞形态。
图6C：诱导获得的神经干细胞向神经元分化潜能鉴定，分化后的神经元样细胞MAP2染色（绿色）。
图7A：诱导获得的神经干细胞向神经胶质细胞分化潜能鉴定，星形胶质细胞样细胞形态。
图7B：诱导获得的神经干细胞向神经胶质细胞分化潜能鉴定，少突胶质细胞样细胞形态。
图7C：诱导获得的神经干细胞向神经胶质细胞分化潜能鉴定，GFAP染色（绿色）。
图7D：诱导获得的神经干细胞向神经胶质细胞分化潜能鉴定，O4染色（绿色）。
图8A：采用膜片钳技术检测神经元的电生理特征，未诱导的人脂肪源性间充质干细胞未检测到任何电流。
图8B：采用膜片钳技术检测神经元的电生理特征，分化后的神经元细胞在刺激电压的作用下能产生一组内向电流。
图8C：采用膜片钳技术检测神经元的电生理特征，在细胞外液中加入500nmol/L的钠离子阻断剂TTX后，该内向电流可被阻断。
图9：分化后的神经胶质细胞上清中神经营养因子的24小时分泌量检测。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不意味着用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实验材料
青霉素、链霉素和胰蛋白酶-EDTA购自GIBCO公司；
Trizol购自美国Invitrogen公司；
Oligo dT、M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制剂购自日本Takara公司；
兔抗人Sox1、兔抗人Pax6、小鼠抗人Nestin、山羊抗人GFAP、小鼠抗人O4、小鼠抗人MAP2抗体均购自Abcam公司；
小鼠抗人Vimentin购自Santa Cruz公司；
异硫氰酸标记的山羊抗小鼠IgG、异硫氰酸标记的山羊抗兔IgG、异硫氰酸标记的兔抗山羊IgG购自Santa cruz公司；
Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12培养基、DMEM/F12培养基、Neurobasal培养基、Knockout血清替代物、非必需氨基酸、谷氨酰胺、N2supplement、B27supplement均购自GIBCO公司；
表皮细胞生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）购自Pepro Tech公司；
维甲酸（Retinoic acid，RA）购自Sigma公司。
实施例
实施例1、培养基的制备
培养基A、B、C、D和E的配制：
第一培养基（培养基A）由动物细胞基础培养基和溶质组成。动物细胞基础培养基为Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12；溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下：200ml/L Knockout血清替代物、10ml/L非必须氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1mmol/L L-谷氨酰胺、4ng/ml b-FGF。
第二培养基（培养基B）由动物细胞基础培养基和溶质组成。动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基；溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下：10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇。
第三培养基（培养基C）由动物细胞基础培养基和溶质组成。动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基；溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下：10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF。
第四培养基（培养基D）由动物细胞基础培养基和溶质组成。动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基；溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下：10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.5μmol/L维甲酸（Retinoic acid，RA）、10ml/L胎牛血清、50ml/L马血清和10ng/ml BDNF（脑源性神经营养因子）。
第五培养基（培养基E）由动物细胞基础培养基和溶质组成。动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基；所述溶质及其在动物细胞基础培养基中的浓度如下：10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.5μmol/L维甲酸（Retinoic acid，RA）、10ml/L胎牛血清、50ml/L马血清和10ng/ml血小板衍生生长因子（PDGF-BB）。
实施例2、人神经干细胞的诱导培养
步骤一、获得第3代间充质干细胞
1、将采用吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hank’s（或PBS）洗去血细胞和麻醉药，2g/L II型胶原酶37℃消化30min，100目筛网过滤并收集滤液。
2、用D-Hank’s液重悬步骤1获得的细胞并重复洗涤2遍以除去胶原酶，室温1200rpm离心10min，收集细胞。
3、将步骤2的细胞以2×106个/ml的密度接种于装有扩增培养液（一个配方的实例为含580ml/L DMEM/F12、400ml/L MCDB、20ml/L胎牛血清、1×10-9mol/L胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂（ITS）、1×10-9mol/L地塞米松、1×10-4mol/L2-磷酸抗坏血酸、20ng/mL白介素-6、10ng/mL EGF、10ng/mL PDGF-BB，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的T75细胞培养瓶中，在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱培养36hr后（24-48hr均可）弃去培养液（含未贴壁的细胞），并补充新的扩增培养液，以后每3d半量更换新的扩增培养液，当细胞达70%-80%汇合时，用1g/L胰蛋白酶（Gibco公司）常规消化，细胞按照1：3进行传代，得到第1代间充质细胞。
所述扩增培养液并不限于本实施例使用的扩增培养液，其它间充质干细胞适用的扩增培养液均可以使用。
4、将第1代间充质细胞在扩增培养液中培养2-3d（在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养），达70%-80%汇合，用D-Hank’s液洗2遍，用1g/L胰蛋白酶（Gibco公司）常规消化，细胞按照1：3进行传代，得到第2代间充质细胞。
5、将第2代间充质细胞在扩增培养液中培养2-3d（在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱培养），达70%-80%汇合，用D-Hank’s液洗2遍，然后用1g/L的胰蛋白酶（Gibco公司）常规消化，室温1200rpm离心6min，收集细胞。
6、将步骤5的细胞以1×106个/孔的密度接种于装有扩增培养液的6孔板（购自Nunclon公司）中，在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱培养4-6hr，待细胞贴壁后弃除培养基，用D-Hank’s洗2遍，记作第3代间充质干细胞。
步骤二、采用培养基组合进行诱导培养获得神经干细胞
1、在6孔板中加入培养基A，每孔2ml。
2、在步骤1的6孔板中接种第3代间充质干细胞，使其在培养基中的浓度为3×105个/ml，在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养8d，隔天换液。
3、吸弃步骤2的6孔板中的培养基A，加入培养基B，每孔2ml，培养7天，隔天换液。
4、吸弃步骤3的6孔板中的培养基B，加入培养基C，每孔2ml，培养7天，隔天换液。
实施例3、对获得的神经干细胞终末分化能力的鉴定
1、向神经元分化：将实施例2步骤二最终获得的细胞种在多聚鸟甘酸/层粘连蛋白（PDL/laminin）包被的6孔板中，每孔5×105细胞，加入第四培养基（即培养基D），每2天换液，共培养12-16天，如14天。
2、向神经胶质分化：将实施例2步骤二最终获得的细胞种在多聚鸟甘酸/层粘连蛋白（PDL/laminin）包被的6孔板中，每孔5×105细胞，加入培养基E，每2天换液，共培养12-16天，如14天。
实施例4、诱导效果的鉴定
1、第3代间充质干细胞的免疫表型测定
步骤一得到的人脂肪来源的间充质干细胞的细胞形态见图1。
用间接免疫荧光法检测第3代间充质干细胞的表型，用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD29、CD34、CD31、CD44、CD105、CD106、Flk-1、HLA-ABC和HLA-DR抗体（抗体均购自BD公司）标记后进行流式检测，流式细胞仪为ACCURI C6(Becton Dickinson)。
结果见图2，横坐标表示细胞荧光强度，纵坐标表示细胞数；P1表示所选细胞群体。表型结果显示，第3代人脂肪来源间充质干细胞表达Flk1、CD29、CD44、CD105及HLA-ABC，不表达CD31，CD34、CD106及HLA-DR。与现有技术相比，本发明所获得的脂肪来源间充质干细胞的特有表型是Flk-1阳性。
2、人间充质干细胞诱导分化为神经干细胞的鉴定
（1）形态鉴定
人脂肪来源的第三代间充质干细胞（图3A）在培养基A中培养8d后，细胞形态发生一定改变：主要表现为细胞体积变大，边界不清，形成形态一致的扁平状细胞（见图3B）。这些细胞在培养基B中培养7天后，细胞回缩，体积变小，培养瓶中出现少量胞膜皱缩的凋亡细胞。细胞在培养基B中培养7天后，细胞获得一致的细胞形态（图3C）。随后，在培养基C中培养7天的细胞胞体回缩透亮，呈两极状态，细胞间间隙增大，未见明显的连接（图3D）。这一结果表明经过诱导之后细胞呈现神经干细胞的典型形态。
（2）免疫荧光染色鉴定
将实施例2步骤二中最终获得的细胞（将第3代间充质干细胞作为对照）进行免疫荧光染色，检测神经干细胞标志Sox1、Pax6、巢蛋白（Nestin）、波形蛋白（Vimentin）的表达情况。
具体检测方法如下：细胞以80%冰乙醇固定，PBS清洗后以含10g/L BSA封闭30min；然后用抗Sox1、Pax6、Nestin、Vimentin（工作浓度均为1：100、1：100、1：100、1：100稀释）的一抗4℃孵育过夜；用PBS缓冲液清洗后，再以异硫氰酸（绿色荧光）标记的二抗室温孵育1h；用PBS缓冲液清洗后用Hoechst33342染色液（Sigma）复染细胞核（蓝色荧光），在荧光显微镜下观察（Olympus）。
结果表明，第3代间充质干细胞表达Pax6和Vimentin，不表达Sox1和Nestin。采用培养基组合诱导培养后的细胞均表达Sox1、Pax6、Nestin和Vimentin（结果见图4）。这意味着，采用培养基组合诱导培养后细胞为Sox1阳性、Pax6阳性、Nestin阳性和Vimentin阳性。
（3）实时定量PCR分析
取实施例2步骤二最终获得的细胞（将第3代间充质干细胞作为对照），提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时定量PCR鉴定神经发育相关基因的表达情况。采用人GAPDH作为各基因的对照，所用的引物如下：
表1.实时定量PCR所用的引物
采用2-△△CT法计算各基因的相对表达量。以第3代人脂肪来源的间充质干细胞的基因表达量为1，计算采用培养基A、B、C组合诱导培养后的获得的神经干细胞中各个基因的相对表达量，结果见图5A至图5D。
以上鉴定结果表明，采用培养基组合A、B、C诱导培养后的细胞主要为人神经干细胞（如上所述，表达了神经干细胞的特异性标志基因及蛋白，并显示了神经干细胞的形态）。
实施例5、获得的神经干细胞能力的鉴定
1、终末分化细胞的形态及免疫荧光鉴定
诱导获得的神经干细胞在神经元分化培养基（即培养基D）中诱导12-16天，如14天后，细胞呈现出神经元样改变，主要呈双极状态，两侧有明显的神经纤维丝状突起，相邻细胞的突起交错相连，形成网状结构（图6A和图6B）。分化后的神经元样细胞表达成熟神经元的标志MAP2（图6C）。
诱导获得的神经干细胞在神经胶质分化培养基（培养基E）中诱导12-16天，如14天后，可观察到呈扁平片状形态的星形胶质细胞样细胞（图7A）及胞体呈圆形、边缘有突起结构的少突胶质细胞样细胞（图7B），对分化后的细胞进行免疫荧光染色，结果显示，细胞分别表达星形胶质细胞标志GFAP（图7C）和少突胶质细胞标志O4（图7D）。
2、神经元的功能检测
采用膜片钳技术检测神经元的电生理特征，在钠电流记录模式下，未诱导的人脂肪源性间充质干细胞未检测到任何电流（图8A），而分化后的神经元细胞在刺激电压的作用下能产生一组内向电流（图8B）。当在细胞外液中加入500nmol/L的钠离子阻断剂TTX后，该内向电流大部分可被阻断（图8C），这些结果表明我们检测到的内向电流是钠电流，具有钠电流的特征，即由神经干细胞分化产生的神经元细胞具有产生内向钠电流的能力，具有生理功能。
3、神经胶质细胞的功能检测
收集神经胶质细胞的上清，ELISA法检测培养上清中BDNF（脑源性神经营养因子）、NT3（神经营养因子3）、NT4（神经营养因子4）、GDNF（神经胶质源神经营养因子）及NGF（神经生长因子）的24小时分泌量（5×105个细胞）分别为180.5±13.5pg/ml、1050±23.5pg/ml、1700±34.6pg/ml、217.7±15.9pg/ml和900±18.4pg/ml（图9），这一结果说明分化后的神经胶质细胞具有分泌神经营养因子的功能。
小结：
由人脂肪来源的间充质干细胞获得神经干细胞的步骤可简述为：将脂肪组织获得的细胞以适当密度接种于扩增培养液中，将获得的第3代间充质干细胞依次顺序地置于第一培养基培养8天启动神经分化过程，使神经早期转录因子Sox1的表达活化、第二培养基培养7天进一步筛选Sox1阳性细胞、第三培养基培养7天扩增获得神经干细胞。最终获得的细胞表达早期神经干细胞的标志Sox1、Pax6、Nestin和Vimentin。当然，本发明所述方法所使用的人脂肪来源的间充质干细胞并不限于第3代间充质干细胞，3-5代次的间充质干细胞也可以使用。
本发明的诱导培养方法无病毒导入、易操作、效率高。这些诱导获得的神经干细胞不仅能够分化为神经元和神经胶质细胞，且神经元能产生内向的钠电流，有神经传导功能。此外神经胶质细胞亦能分泌神经营养因子，具有神经营养功能，这也是判定本发明所获得的细胞是神经干细胞的质量标准。
人脂肪间充质干细胞经过本发明的诱导法可在体外获得高纯度的、表达早期神经干细胞标志的、能够分化成为有功能的终末神经细胞的神经干细胞。本发明获得的神经干细胞可以用于治疗脑损伤及神经系统退行性疾病如帕金森、阿尔茨海默病等，可为脑损伤及神经系统退行性疾病的细胞治疗提供实验依据和临床研究证据。
Claims (13)
1.一种神经干细胞的制备方法，其包括步骤：
1)获得间充质干细胞；
2)将间充质干细胞在第一培养基中进行培养；
3)之后转入第二培养基中进行培养；
4)之后转入第三培养基中进行培养；
5)获得神经干细胞，
其中所述间充质干细胞是人脂肪来源的间充质干细胞；
其中所述第一培养基由动物细胞基础培养基、150ml/L至250ml/L血清替代物、5ml/L至15ml/L非必须氨基酸、0.05mmol/L至0.15mmol/Lβ-巯基乙醇、0.5mmol/L至1.5mmol/L L-谷氨酰胺和0ng/ml至10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子组成；
所述第二培养基由动物细胞基础培养基、5ml/L至15ml/L N2添加剂、10ml/L至30ml/LB27添加剂、0.05mmol/L至0.15mmol/Lβ-巯基乙醇和0.5mmol/L至1.5mmol/L L-谷氨酰胺组成；
所述第三培养基由动物细胞基础培养基、5ml/L至15ml/L N2添加剂、10ml/L至30ml/LB27添加剂、0.05mmol/L至0.15mmol/L β-巯基乙醇、0.5mmol/L至1.5mmol/L L-谷氨酰胺、15ng/ml至25ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和15ng/ml至25ng/ml表皮细胞生长因子组成，其中
所述第一培养基的动物细胞基础培养基为Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12，
所述第二培养基的动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基，以及
所述第三培养基的动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基；并且，其中
将所述间充质干细胞接种于所述第一培养基中，培养6至10天，
将完成步骤2)的细胞转接于第二培养基中，培养5至9天，
将完成步骤3)的细胞转接于第三培养基中，培养5至9天。
2.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中：
所述间充质干细胞是人脂肪来源的Flk-1阳性的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中所述间充质干细胞是第3至5代的间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的神经干细胞的制备方法，其中所述间充质干细胞是第3代间充质干细胞。
5.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中
将所述间充质干细胞接种于所述第一培养基中，培养8天。
6.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中
将完成步骤2)的细胞转接于第二培养基中，培养7天。
7.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中
将完成步骤3)的细胞转接于第三培养基中，培养7天。
8.根据权利要求1所述的神经干细胞的制备方法，其中步骤2)至步骤4)的培养条件为：在37℃、50ml/L CO2、空气相对湿度为95％的培养箱中培养。
9.一种制备神经干细胞的试剂盒，其包括：
第一培养基；
第二培养基；和
第三培养基，
其中所述第一培养基由动物细胞基础培养基、150至250ml/L血清替代物、5至15ml/L非必须氨基酸、0.05至0.15mmol/L β-巯基乙醇、0.5至1.5mmol/L L-谷氨酰胺和0至10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子组成；
所述第二培养基由动物细胞基础培养基、5至15ml/L N2添加剂、10至30ml/L B27添加剂、0.05至0.15mmol/L β-巯基乙醇和0.5至1.5mmol/L L-谷氨酰胺组成；
所述第三培养基由动物细胞基础培养基、5至15ml/L N2添加剂、10至30ml/L B27添加剂、0.05至0.15mmol/L β-巯基乙醇、0.5至1.5mmol/L L-谷氨酰胺、15至25ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和15至25ng/ml表皮细胞生长因子组成，其中
所述第一培养基的动物细胞基础培养基为Knockout DMEM或Knockout DMEM/F12，
所述第二培养基的动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基，以及
所述第三培养基的动物细胞基础培养基为体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基。
10.一种制备神经干细胞的试剂盒，其由第一培养基、第二培养基和第三培养基组成，其中
第一培养基为：补充有200ml/L Knockout血清替代物、10ml/L非必须氨基酸、0.1mmol/L β-巯基乙醇、1mmol/L L-谷氨酰胺和3至5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子的KnockoutDMEM培养基或Knockout DMEM/F12培养基；
第二培养基为：体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基，其中补充有10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺和0.1mmol/L β-巯基乙醇；
第三培养基为：体积比为1：1的Neurobasal培养基与DMEM/F12培养基，其中补充有10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L β-巯基乙醇、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和20ng/ml表皮细胞生长因子。
11.根据权利要求10所述的制备神经干细胞的试剂盒，其中：
所述第一培养基中碱性成纤维细胞生长因子为4ng/ml。
12.一种神经元的制备方法，其包括步骤：
通过权利要求1至8中任一项所述的方法，获得神经干细胞；
将所述神经干细胞在第四培养基中进行诱导培养；
获得神经元；
其中
第四培养基由体积比为1:1的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基、10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.5μmol/L维甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L马血清和10ng/ml脑源性神经营养因子组成。
13.一种神经胶质细胞的制备方法，其包括步骤：
通过权利要求1至8中任一项所述的方法，获得神经干细胞；
将所述神经干细胞在第五培养基中进行诱导培养；
获得神经胶质细胞；
其中
第五培养基由体积比为1:1的DMEM/F12培养基和Neurobasal培养基、10ml/L N2添加剂、20ml/L B27添加剂、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.5μmol/L维甲酸、10ml/L胎牛血清、50ml/L马血清和10ng/ml血小板衍生生长因子组成。
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