CN101831401A - 体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的无血清neurobasal medium培养体系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。本发明诱导分化率高且易于向神经元分化，能够减少胶质疤痕的形成，更利于移植应用。与胚胎干细胞或神经组织来源相比，脐带间充质干细胞取材方便、易于体外扩增、免疫源性低且合乎伦理学要求。

Description

体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法

技术领域

本发明涉及神经干细胞的制备方法，尤其是一种体外诱导间充质干细胞向神经干细胞分化的方法。

背景技术

神经系统疾病常伴有不同程度的神经功能损伤，是威胁人类生命和严重影响人们生活质量的主要疾病之一。神经干细胞是具有自我更新能力，并能转化为各种神经组织细胞(包括神经元、神经胶质细胞、少突胶质细胞等)的一类细胞。研究发现，在遭受神经损伤或特定细胞因子存在的条件下，神经干细胞能够激活并分化为神经元或神经胶质细胞，参与损伤部位的修复。因此，我们可以通过神经干细胞移植来促进损伤的神经再生。目前，神经干细胞主要从胚胎干细胞诱导获得或直接从成年哺乳动物的中枢神经系统(主要指分布于室管膜下、纹状体、海马齿状回、侧脑室下带等部位)中分离培养获得。但是伦理学、安全性问题以及细胞来源和数量的有限，在一定程度上都限制了神经干细胞的移植应用。因此，很有必要寻找其它能够获得神经干细胞的途径来克服这些限制。间充质干细胞是一群存在于多种组织中的多能干细胞，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，在体外不同的诱导条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞等多种细胞。目前，国内大都采用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)直接诱导脐带间充质干细胞向神经干细胞分化。将细胞接种于低粘附培养瓶中，在含有2％B27，20ng/mL EGF和20ng/mL bFGF的neurobasal medium中培养10～20天后传代。诱导后的细胞大约有80％左右表达神经干细胞表面标志巢蛋白(Nestin)并具有向神经元和神经胶质细胞分化的能力，其中约5％细胞表达神经元特异性表面标志MAP2；而约40％的细胞表达神经胶质细胞特异性表面标志GFAP。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种脐带间充质干细胞取材方便、易于体外扩增、免疫源性低且合乎伦理学要求的体外诱导间充质干细胞向神经干细胞分化的方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF 8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的无血清neurobasal medium培养体系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。

所述间充质干细胞来源自人类。

所述间充质干细胞来源包括人类的胚胎、骨髓、脂肪、胎盘、脐带组织。

所述间充质干细胞来源自人类脐带。

所述DMEM/DF-12培养体系添加的bFGF为20～100ng/mL、FGF8为50～150ng/mL、SHH为250～750ng/mL和LIF为5～20ng/mL。

所述bFGF为50ng/mL、FGF8为100ng/mL、SHH为500ng/mL和LIF为10ng/mL。

所述的无血清neurobasal medium培养体系添加的bFGF为20～100ng/mL、FGF8为50～150ng/mL和SHH为250～750ng/mL。

所述bFGF为50ng/mL、FGF8为100ng/mL和SHH为500ng/mL。

一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，包括以下步骤：

1)预诱导

(1)取4～6代脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取5～10mL 0.01M磷酸缓冲液PBS轻轻加入T₇₅培养瓶内洗涤，弃去洗液；

(2)加入0.25％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

(3)加入20mL 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分离心10分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12重悬细胞，在T₂₅培养瓶中接种2×10⁵个脐带间充质干细胞；

(4)培养体系为含体积比浓度为10％人AB血清，100u/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM/DF12完全培养液，添加了50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH和10ng/mL LIF，总体积为5mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天，每3天换液一次；

2)定向诱导脐带间充质干细胞向神经干细胞分化

(1)将预诱导后的细胞加入0.25％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

(2)加入10mL 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分离心10分钟；弃去上清液后，加入10mL neurobasal medium重悬细胞，重新接种在T₂₅培养瓶中；

(3)培养体系为含体积比浓度为2％的N2或B27、100u/mL青霉素、100μg/mL链霉素的无血清neurobasal medium，添加了50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8和500ng/mL SHH，总体积为5mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱中培养，每3天添加生长因子一次，每7天换液一次，培养20天后获得由人脐带间充质干细胞定向诱导分化的神经干细胞。

本发明的有益效果是：诱导分化率高且易于向神经元分化，能够减少胶质疤痕的形成，更利于移植应用。与现有技术相比，本诱导方法可获得大约90％的Nestin阳性细胞，且诱导后的神经干细胞同样具有向神经元和神经胶质细胞分化的能力，分化后的MAP2和GFAP阳性细胞表达率分别约为70％和15％。诱导使用的间充质干细胞可以来源于胚胎、骨髓、脂肪等组织，但最好是取自脐带来源。与胚胎干细胞或神经组织来源相比，脐带间充质干细胞取材方便、易于体外扩增、免疫源性低且合乎伦理学要求。由于生理学特点基本一致，所以无论是何种来源的人类间充质干细胞，都适用本发明所提供的诱导方法。

附图说明

图1是本发明的人脐带间充质干细胞诱导分化成的神经干细胞。

图2是本发明诱导后神经干细胞的Nestin表达情况：(A)Nestin染色；(B)细胞核DAPI染色；(C)A和B的合并图像。

图3是本发明诱导后神经干细胞的分化潜能情况：(A)神经胶质细胞特异性标志GFAP染色和细胞核DAPI染色；(B)神经元特异性标志MAP2染色和细胞核DAPI染色。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于下述实施例。

本发明体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，在添加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF 8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的无血清neurobasal medium培养体系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。

所述间充质干细胞来源自人类。

所述间充质干细胞来源包括人类的胚胎、骨髓、脂肪、胎盘、脐带组织。

所述间充质干细胞来源自人类脐带。

所述DMEM/DF-12培养体系添加的bFGF为20～100ng/mL、FGF8为50～150ng/mL、SHH为250～750ng/mL和LIF为5～20ng/mL。

所述bFGF为50ng/mL、FGF8为100ng/mL、SHH为500ng/mL和LIF为10ng/mL。

所述的无血清neurobasal medium培养体系添加的bFGF为20～100ng/mL、FGF8为50～150ng/mL和SHH为250～750ng/mL。

所述bFGF为50ng/mL、FGF8为100ng/mL和SHH为500ng/mL。

下面通过具体实施例，以间充质干细胞来源自人类脐带为例进行叙述：

1.预诱导

(1)取4～6代脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取10mL 0.01M磷酸缓冲液(phosphate bufferedsaline，PBS)轻轻加入T₇₅培养瓶内洗涤，弃去洗液；

(2)加入(质量/体积比)0.25％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates，EDTA)消化液1.0mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

(3)加入10mL 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分离心10分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12重悬细胞，在T₂₅培养瓶中接种2×10⁵个脐带间充质干细胞；

(4)培养体系为含10％人AB血清，100u/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM/DF12完全培养液，添加了50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH和10ng/mL LIF，总体积为5mL/瓶。置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天。每3天换液一次。

2.定向诱导脐带间充质干细胞向神经干细胞分化

(1)将预诱导后的细胞加入0.25％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates，EDTA)消化液1.0mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

(2)加入10mL 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分离心10分钟；弃去上清液后，加入10mL neurobasal medium重悬细胞，重新接种在T₂₅培养瓶中；

(3)培养体系为含体积比浓度为2％的N2或B27，100u/mL青霉素，100μg/mL链霉素的无血清neurobasal medium，添加了50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8和500ng/mL SHH，总体积为5mL/瓶。置37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱中培养20天左右。每3天添加生长因子一次，每7天换液一次。

3.神经干细胞的鉴定

(1)形态学鉴定：倒置显微镜下观察脐带间充质干细胞在诱导过程中形态的变化，发现神经干细胞呈神经球样生长(见图1)。定向诱导3～4天后，可观察到悬浮的小细胞团。诱导约20天时，大约可形成300～400个大小不等的细胞团。

(2)神经干细胞特异性标志检测：将载玻片固定于甩片机的转头上，滴加诱导后的神经干细胞悬液100ul后，1200g迅速离心5分钟。常规免疫荧光染色检测神经干细胞特异性标志巢蛋白(Nestin)。细胞破膜、封闭后，滴加一抗Nestin单克隆抗体，4℃孵育过夜。然后滴加异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的大鼠抗小鼠IgG抗，37℃孵育1h。细胞核用4‘6-二脒基-2-苯基吲哚(dihydrochloride，DAPI)染色。最后封片，荧光显微镜下观察，拍照。免疫荧光染色结果显示阳性表达率为90％左右(见图2)。

(3)神经干细胞分化潜能的检测：将无菌盖玻片放置在24孔板孔内，加入诱导后的神经干细胞悬液100ul，含10％人AB血清，100u/mL青霉素，100μg/mL链霉素的neurobasal media中培养7天。取出盖玻片进行免疫荧光染色，检测MAP2和GFAP的表达情况。细胞破膜、封闭后，分别滴加一抗MAP2和GFAP单克隆抗体，4℃孵育过夜。然后滴加FITC标记的大鼠抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1h。细胞核用DAPI染色。最后封片，荧光显微镜下观察，拍照。结果显示诱导后的神经干细胞能分化成神经元和神经胶质细胞(见图3)。其中，约70％细胞表达神经元特异性标志MAP2，约15％细胞表达神经胶质细胞特异性标志GFAP。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (9)

1.一种体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，在添加了bFGF、成纤维细胞生长因子FGF 8、SHH和白血病抑制因子LIF的DMEM/DF-12培养体系中预诱导间充质干细胞；在添加了bFGF、FGF8和SHH的无血清neurobasal medium培养体系中将预诱导的细胞定向分化为神经干细胞。

2.根据权利要求1所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源自人类。

3.根据权利要求2所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源包括人类的胚胎、骨髓、脂肪、胎盘、脐带组织。

4.根据权利要求3所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源自人类脐带。

5.根据权利要求1、2、3或4所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述DMEM/DF-12培养体系添加的bFGF为20～100ng/mL、FGF8为50～150ng/mL、SHH为250～750ng/mL和LIF为5～20ng/mL。

6.根据权利要求5所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述bFGF为50ng/mL、FGF8为100ng/mL、SHH为500ng/mL和LIF为10ng/mL。

7.根据权利要求5所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述的无血清neurobasal medium培养体系添加的bFGF为20～100ng/mL、FGF8为50～150ng/mL和SHH为250～750ng/mL。

8.根据权利要求7所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述bFGF为50ng/mL、FGF8为100ng/mL和SHH为500ng/mL。

9.根据权利要求4所述的体外诱导间充质干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)预诱导

(1)取4～6代脐带间充质干细胞，当细胞贴壁生长至80％-90％融合时，吸除培养瓶内原有培养液，取5～10mL 0.01M磷酸缓冲液PBS轻轻加入T₇₅培养瓶内洗涤，弃去洗液；

(2)加入0.25％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

(3)加入20mL 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分离心10分钟；弃去上清液后，加入10mL DMEM/F-12重悬细胞，在T₂₅培养瓶中接种2×10⁵个脐带间充质干细胞；

(4)培养体系为含体积比浓度为10％人AB血清，100u/mL青霉素，100μg/mL链霉素的DMEM/DF12完全培养液，添加了50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8、500ng/mL SHH和10ng/mL LIF，总体积为5mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6～8天，每3天换液一次；

2)定向诱导脐带间充质干细胞向神经干细胞分化

(1)将预诱导后的细胞加入0.25％胰蛋白酶-0.01％乙二胺四乙酸EDTA消化液1.0mL，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察见细胞呈圆形漂起时，加入1.0mL胎牛血清中止胰蛋白酶消化；

(2)加入10mL 0.01M PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分离心10分钟；弃去上清液后，加入10mL neurobasal medium重悬细胞，重新接种在T₂₅培养瓶中；

(3)培养体系为含体积比浓度为2％的N2或B27、100u/mL青霉素、100μg/mL链霉素的无血清neurobasal medium，添加了50ng/mL bFGF、100ng/mL FGF8和500ng/mL SHH，总体积为5mL/瓶，置37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱中培养，每3天添加生长因子一次，每7天换液一次，培养20天后获得由人脐带间充质干细胞定向诱导分化的神经干细胞。

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