CN109867718A - 一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途，人神经干细胞由人胚胎干细胞系诱导分化而成，选择第2‑3代处于对数生长期的人神经干细胞，收集干细胞培养基，进行高浓度的复合再生因子的制备。本发明人制备的神经干细胞来源的再生因子在治疗脊髓损伤中具有很好的应用前景，为有效治疗中枢神经系统损伤，包括创伤性脑损伤，脊髓损伤等提供新选择。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞再生修复领域，具体涉及一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途。
背景技术
中枢神经系统包含大脑和脊髓，是所有感官知觉和运动输出的中心。中枢神经系统的修复和再生能力非常有限，因为受损/轴突切割的神经元和大多数横切的中枢神经轴突不可再生。中枢神经系统损伤包括创伤性脑损伤和脊髓损伤，是临床上创伤性致死和致残的主要原因。
创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)和脊髓损伤(spinal cordinjury，SCI)神经外科最常见的急危重症之一，具有高发生率、高死亡率和高致残率的特点，而且随着社会的发展，其发生率呈逐年上升的趋势。虽然近十年来其总体死亡率有所下降，但是仍有部分轻度患者会遗产生留永久的神经功能障碍，中重度患者的致残率甚至高达66％～100％，为社会和家庭带来了极大的负担。中枢神经损伤目前还是一个世界性的医学难题，究其原因是人们对中枢神经损伤后再生修复机制并没有完全了解。比如脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤可直接造成损伤部位的神经元和胶质细胞机械性损伤，从而导致细胞死亡，其过程大致会持续数小时到数天。继发性损伤则是脊髓损伤局部的细胞凋亡、大量炎症细胞的浸润导致的免疫炎症反应、血管破坏导致的缺血、兴奋性毒性、脂质过氧化与自由基损伤等最终导致的神经元大量退化和死亡，残存的神经纤维脱髓鞘病变及水肿坏死等，造成损伤局部和周边组织的大范围神经组织形态学和功能的改变。另外一个重要的方面是在损伤后多种病理变化导致的不利再生微环境，导致神经营养因子比如BDNF,GDNF,NT-3等缺乏，从而进一步引起残存神经元缺乏足够的生长因子维持，增加残存神经元的轴突的溃变，最后死亡。另外神经营养因子的缺乏也导致内源性神经干细胞不能进行损伤的后的反应性增值和向功能神经元的定向分化。
近年来，随着对干细胞研究的不断深入，越来越多的证据表明神经干细胞能一定程度提高脊髓损伤修复效果。其机理主要为神经干细胞旁分泌大量的神经再生因子，比如BDNF，NT-3，GDNF，NGF等等，所以神经干细胞移植其实主要以旁分泌的方式起作用。而且随着体内移植的细胞的不断死亡，分泌的因子浓度也逐渐减少。因此，需要研究出一种将体外培养的干细胞分泌到培养基中的众多再生因子分离、浓缩的方法，然后将再生因子复合到生物材料上应用于中枢神经系统修复中。
发明内容
本发明的目在于针对脊髓损伤修复或中枢神经系统修复的问题，提供一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法及其用途，为有效治疗中枢神经系统损伤提供新选择。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法。
一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤A：将胚胎干细胞在10CM细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养7-10天形成熟拟胚体，然后将成熟拟胚体打散、贴壁培养于一号Neurobasal培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化，形成神经干细胞，然后将诱导而成的神经干细胞置于二号Neurobasal培养基中，选择处于2-3代对数生长期的神经干细胞收集培养基；
步骤B：吸出二号Neurobasal培养基，将神经干细胞置于DMEM/F12培养基中继续培养12小时，然后将细胞和培养基转移至离心管进行离心处理，收集离心管中的上清，备用；
步骤C：将收集的上清分装到离心管，每管15mL，然后将各离心管冷冻干燥，离心管里形成固体粉末；
步骤D：取每管冷冻干燥的粉末，采用1.5mL去离子水重新溶解，使用PD-10预装脱盐柱进行脱盐纯化，得到高蛋白浓度的洗脱液；
步骤E：重新收集洗脱液于离心管中，每管20mL，冷冻干燥成粉末，然后再用2mL去离子水重新溶解，得到高浓度的复合再生因子。
进一步地，所述步骤A中，一号Neurobasal培养基的具体配制为每100mL的Neurobasal培养液中，添加1mL的B27和500ng的noggin。
进一步地，所述步骤A中，二号Neurobasal培养基的具体配制为：每100mL的Neurobasal培养液中，添加500ng的bFGF、1000ng的EGF5以及1mL的N2添加物。
进一步地，所述步骤A中，诱导形成的神经干细胞纯度大于90％。
进一步地，所述步骤C中的离心处理具体是指：将细胞和培养基转移至50mL离心管中，以3000rpm的速度离心10min。
进一步地，所述步骤D中脱盐纯化的具体步骤包括：
步骤D1：平衡，采用PBS平衡PD-10柱；
步骤D2：上样，在PD-10柱平衡后，将溶解后的神经干细胞培养液加到柱子顶上；
步骤D3：洗脱：培养液全部进入柱子内后，从柱顶加入PBS以自然流速进行洗脱；
步骤D4：收集，从加样开始计算，用1.5mL的EP管收集流出液为脱盐蛋白峰，每管收集0.5mL；
步骤D5：检测，采用BCA方法检测每管总蛋白浓度，采用ELISA试剂盒检测各管的特定再生因子浓度，将蛋白浓度比高于5ug/mL的样品液合并后收集得到纯化的洗脱液。
进一步地，所述步骤D5中，每15mL神经干细胞培养液可以收集2mL纯化的洗脱液。
本发明的第二方面，提供所制备的神经干细胞来源的复合再生因子在中枢神经系统损伤中作为干细胞衍生治疗药物的应用。
进一步地，所述神经干细胞来源的复合再生因子应用于治疗创伤性脑损伤后的干细胞衍生物治疗。
进一步地，所述创伤性脑损伤为破坏大脑或中枢神经功能的开放或闭合性损伤。
本发明的第三方面，提供一种用于中枢神经损伤的干细胞衍生治疗药物，其活性成分为采用制备的神经干细胞来源的复合再生因子。
进一步地，其主要活性成分为所述的表达复合再生因子，包括BDNF，GNDF，NGF，NT-3等再生因子。
本发明所述的人神经干细胞来源于商业化的胚胎干细胞系，并在GMP级临床干细胞制备室进行诱导分化分离，培养及扩增，并经过严格的间充质干细胞质量控制与安全性评价体系的检测，不仅克服了细胞移植的来源少的问题，并且无伦理学的争议，为干细胞的临床转化应用提供了新的支持。同时，本发明所使用的方法可以扩展到任何干细胞种类，包括但不限于脐带、胎盘、骨髓、脐带血、牙龈、牙髓、脂肪来源，并从其培养基中提取复合再生因子，同时作为干细胞治疗药物、护肤品、化妆品中的应用。
本发明的有益效果在于：
1.本发明从培养的神经干细胞培养基中提取出高浓度的复合再生因子，用于中枢神经系统疾病治疗，可以有效避免细胞移植带来的免疫排斥反应。本发明在GMP级环境中进行诱导分化分离，培养及扩增，并经过严格的神经干细胞质量控制与安全性评价体系的检测，制备的神经干细胞符合临床级的生产要求，保证后续提取得再生因子没有传染性病毒的污染。本发明提取的高浓度复合再生因子在治疗脊髓损伤中具有很好应用前景，为中枢神经系统损伤的治疗提供了一个新的选择。另外，本方法可以应用于其他干细胞，比如各种组织来源的间充质干细胞分泌因子的提取，广泛应用于再生修复、皮肤护理等多个领域。
2.本发明综合采用冷冻干燥、离子交换层析柱分离，能够将体外培养的干细胞分泌到培养基中的众多再生因子分离、浓缩出来，然后复合到生物材料上应用于中枢神经系统修复。通过这样的方法，能有效避免同种异体干细胞移植导致的免疫排斥反应。
附图说明
图1表示神经干细胞免疫荧光染色图；其中，(a)为神经干细胞标志物NESTIN免疫荧光染色图；(b)为神经干细胞分化7天后神经元标志物betaⅢ-tubulin和胶质细胞标志物GFAP的免疫荧光染色图。
图2表示ELISA法检测培养基中的生长因子BDNF和NGFbeta在纯化前后对比示意图。
图3表示大鼠脊髓损伤造模后经过本方法获得的高浓度生长因子修复后运动水平修复平分图。
图4表示本实施例制备的高浓度再生因子修复后脊髓组织恢复情况示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
本实验中，所述胚胎干细胞购置于北京中科院干细胞库，批号为H9feeder free细胞。
本实验中，所述一号Neurobasal培养基、二号Neurobasal培养基中配制所需的原料均购置于Giboco公司。
实施例1
配制一号Neurobasal培养基：取每100mL的Neurobasal培养液中，添加1mL的B27和500ng的noggin，摇晃混匀。
配制二号Neurobasal培养基：每100mL的Neurobasal培养液中，添加500ng的bFGF、1000ng的EGF5以及1mL的N2添加物，摇晃混匀。
一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：在GMP级干细胞制备室中，将胚胎干细胞在10CM细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养7天形成熟拟胚体，然后将成熟拟胚体打散、贴壁培养于上述配制好的一号Neurobasal培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化，形成神经干细胞，控制诱导形成的神经干细胞纯度大于90％，然后将诱导而成的神经干细胞置于上述配制好的二号Neurobasal培养基中，选择处于2-3代对数生长期的神经干细胞收集培养基；
步骤2：将二号Neurobasal培养基吸出，然后取神经干细胞置于DMEM/F12培养基中继续培养12小时，随后将细胞和培养基转移至50mL离心管中，以3000rpm的速度离心10min，收集离心管中的上清，备用；
步骤3：将收集的上清分装到50mL的离心管中，每管15mL，然后将各离心管置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，离心管里形成固体粉末；
步骤4：取每管冷冻干燥的粉末，采用1.5mL去离子水重新溶解，使用PD-10预装脱盐柱进行脱盐纯化，具体为：先用PBS平衡PD-10柱；在PD-10柱平衡后，将溶解后的神经干细胞培养液加到柱子顶上；培养液全部进入柱子内后，从柱顶加入PBS以自然流速进行洗脱；从加样开始计算，用1.5mL的EP管收集流出液为脱盐蛋白峰，每管收集0.5mL；采用BCA方法检测每管总蛋白浓度，采用ELISA试剂盒检测各管的特定再生因子浓度，发现收集的第5管到8管蛋白浓度比较高，高于5ug/mL，将第5-8管样品液合并得到纯化的洗脱液，每15mL神经干细胞培养液可以收集2mL纯化的洗脱液；
步骤5：重新收集洗脱液于50mL离心管中，每管20mL，冷冻干燥成粉末，然后再用2mL去离子水重新溶解，得到高浓度的复合再生因子。
参见图1为步骤1中诱导分化制备的神经干细胞免疫荧光染色图，A为神经干细胞标志物NESTIN免疫荧光染色图；B为神经干细胞分化7天后神经元标志物betaⅢ-tubulin和胶质细胞标志物GFAP的免疫荧光染色图，由图可知，诱导分化后的神经干细胞具有正常的生物学性状。
参见图2为步骤4中采用ELISA法检测培养基中的生长因子BDNF和NGFbeta在纯化前后对比示意图，由图可知，以神经营养因子BDNF和NGFbeta为例，浓缩后的生长因子BDNF和NGFbeta比原培养基中的生长因子明显提高，说明经过纯化处理过后，生长因子浓度可以显著提高。
应用例1
在本发明的研究中，对8周龄SD雌性大鼠用切割方法全横断脊髓，保留脊髓腹、背动脉和背静脉，在损伤部位采用稀释的复合再生因子加透明质酸凝胶进行治疗(总蛋白含量为50ug/只)，对照组只进行透明质酸凝胶治疗。
每周通过Basso-Mouse-Scale(BMS)法进行后肢运动学评分观察，持续至损伤后的12周。
参见图3，因子修复组的大鼠后肢运动学评分明显高于对照组，表明通过本方法提取的神经干细胞复合再生因子能明显改善脊髓损伤小鼠的后肢运动功能。在细胞治疗后第8周，脊髓切片观察，参见图4，对照组损伤部位缺损仍然很大，但是因子组组织填充修复明显比对照组要好，再生因子治疗组脊髓损伤部位的病变体积和病变长度明显减少。
综上，现有再生因子治疗技术多数运用单一的再生因子进行治疗，其疗效并不显著，而本发明提取的再生因子是一种复合物，包含多种再生因子，能够更好地提高治疗效果。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：将胚胎干细胞在10CM细菌培养皿中以无血清培养基悬浮培养7-10天形成熟拟胚体，然后将成熟拟胚体打散、贴壁培养于一号Neurobasal培养基中，诱导其向神经干细胞定向分化，形成神经干细胞，然后将诱导而成的神经干细胞置于二号Neurobasal培养基中，选择处于2-3代对数生长期的神经干细胞收集培养基；
步骤B：吸出二号Neurobasal培养基，将神经干细胞置于DMEM/F12培养基中继续培养12小时，然后将细胞和培养基转移至离心管进行离心处理，收集离心管中的上清，备用；
步骤C：将收集的上清分装到离心管，每管15mL，然后将各离心管冷冻干燥，离心管里形成固体粉末；
步骤D：取每管冷冻干燥的粉末，采用1.5mL去离子水重新溶解，使用PD-10预装脱盐柱进行脱盐纯化，得到高蛋白浓度的洗脱液；
步骤E：重新收集洗脱液于离心管中，每管20mL，冷冻干燥成粉末，然后再用2mL去离子水重新溶解，得到高浓度的复合再生因子。
2.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，一号Neurobasal培养基的具体配制为：每100mL的Neurobasal培养液中，添加1mL的B27和500ng的noggin。
3.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，二号Neurobasal培养基的具体配制为：每100mL的Neurobasal培养液中，添加500ng的bFGF、1000ng的EGF5以及1mL的N2添加物。
4.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，诱导形成的神经干细胞纯度大于90％。
5.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤C中的离心处理具体是指：将细胞和培养基转移至50mL离心管中，以3000rpm的速度离心10min。
6.根据权利要求1所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于，所述步骤D中脱盐纯化的具体步骤包括：
步骤D1：平衡，采用PBS平衡PD-10柱；
步骤D2：上样，在PD-10柱平衡后，将溶解后的神经干细胞培养液加到柱子顶上；
步骤D3：洗脱：培养液全部进入柱子内后，从柱顶加入PBS以自然流速进行洗脱；
步骤D4：收集，从加样开始计算，用1.5mL的EP管收集流出液为脱盐蛋白峰，每管收集0.5mL；
步骤D5：检测，采用BCA方法检测每管总蛋白浓度，采用ELISA试剂盒检测各管的特定再生因子浓度，将蛋白浓度比高于5ug/mL的样品液合并后收集得到纯化的洗脱液。
7.根据权利要求6所述的一种从神经干细胞来源的高浓度复合再生因子的制备方法，其特征在于：所述步骤D5中，每15mL神经干细胞培养液可以收集2mL纯化的洗脱液。
8.权利要求1所制备的神经干细胞来源的复合再生因子在中枢神经系统损伤中作为干细胞衍生治疗药物的应用。
9.一种用于中枢神经损伤的干细胞衍生治疗药物，其特征在于：其活性成分为采用权利要求1所述的方法而制备的神经干细胞来源的复合再生因子。
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