CN107287160A - 一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法 - Google Patents

一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，该方法具体步骤如下：取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上；培养过程中每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，消化传代后接种至新的饲养层细胞上；将胚胎干细胞接种至加入不含LIF的ES常规培养基中，培养36‑48h得到类胚体；将类胚体分散成单个细胞后接种至加入10％FBS的DMEM高糖培养基中；胰酶消化类胚体，之后接种至DMEM/F12培养基中得到神经干细胞。本发明公开了一种多能干细胞体外诱导分化为神经细胞的方法，胚胎干细胞因其体外无限扩增能力、全能性和较低的免疫性而作为理想的种子细胞，本发明提供的方法操作简单，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的神经细胞来源。

Description

一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法。
背景技术
多能干细胞是当前干细胞研究的热点和焦点。它可以分化成体内所有的细胞，进而形成身体的所有组织和器官。因此，多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义，而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值。但是过去认为多能干细胞只能从人胚胎中获得。
多能干细胞，具有分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。2009年6月3日中国科学家肖磊领导的科研小组首次从猪的体细胞中培育出多能干细胞，这也是世界上首次提取出家养有蹄类动物的多能干细胞。
2007年，美国和日本科学家发现，应用人和鼠的正常皮肤细胞，导入KLF4、OCT4、SOX2和C-MYC四种基因，即可由正常体细胞转化成多能干细胞。这种基因诱导而产生的多能干细胞称为诱导多能干细胞(iPs)。除了皮肤细胞，像其他APSC多能细胞实验室等其他体细胞也可以产生iPs。应用iPs已经成功培养和分化出心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织。但是，过去诱导多能干细胞必须应用逆转录病毒载体才能进行基因组整合。由于基因组整合的随机性，可发生突变，甚至可以引起癌症和遗传疾病。哈佛干细胞研究中心和麻省医院肿瘤中心的科学家，成功应用无害基因组整合病毒载体，进行以上四种基因转移，成功地将成纤维细胞和肝细胞分化成多能干细胞，成为Adeno-iPs，将干细胞的实际应用又大大向前推进了一步。多能干细胞研究和应用将会成为21世纪最伟大的医学生物学成就之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，诱导使用的干细胞来源于胚胎干细胞，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的神经细胞来源。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，该方法具体步骤如下：
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上；
S2、培养过程中每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，消化传代后接种至新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；
S3、将S2中得到的胚胎干细胞接种至加入不含LIF的ES常规培养基中，培养36-48h得到类胚体；
S4、将S3中得到的类胚体分散成单个细胞后接种至加入10％FBS的DMEM高糖培养基中，培养6-8d；
S5、胰酶消化S4中预培养的类胚体，之后接种至DMEM/F12培养基中，培养5-6d得到神经干细胞。
进一步地，所述BG02培养基培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入终浓度如下的营养物质0.5％N2，0.5％B27，20-30ng/ml bFGF和2-5ng/ml TGF β。
进一步地，所述S2中消化条件为，37℃加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶。
进一步地，所述DMEM/F12培养基中加入8-10μg/ml多聚鸟氨酸、1-2μg/ml的层粘连蛋白和5-8ng/mL bFGF。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种多能干细胞体外诱导分化为神经细胞的方法，胚胎干细胞因其体外无限扩增能力、全能性和较低的免疫性而作为理想的种子细胞，本发明提供的方法操作简单，易于体外扩增，取材方便，提供了一种经济安全，行之有效的新的神经细胞来源。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入终浓度如下的营养物质0.5％N2，0.5％B27，20ng/ml bFGF和2ng/ml TGF β；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5；
S3、将S2中得到的胚胎干细胞接种至加入不含LIF的ES常规培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养36h得到类胚体；
S4、将S3中得到的类胚体分散成单个细胞后接种至加入10％FBS的DMEM高糖培养基中，37℃，5％CO2培养箱中培养6d，其中培养皿中铺满明胶；
S5、胰酶消化S4中预培养的类胚体，之后接种至DMEM/F12培养基中，其中，所述DMEM/F12培养基中加入8μg/ml多聚鸟氨酸、1μg/ml的层粘连蛋白和5ng/mL bFGF，置于37℃，5％CO2培养箱中培养5d得到神经干细胞。
实施例2
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入终浓度如下的营养物质0.5％N2，0.5％B27，30ng/ml bFGF和5ng/ml TGF β；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:6；
S3、将S2中得到的胚胎干细胞接种至加入不含LIF的ES常规培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养48h得到类胚体；
S4、将S3中得到的类胚体分散成单个细胞后接种至加入10％FBS的DMEM高糖培养基中，37℃，5％CO2培养箱中培养8d，其中培养皿中铺满明胶；
S5、胰酶消化S4中预培养的类胚体，之后接种至DMEM/F12培养基中，其中，所述DMEM/F12培养基中加入10μg/ml多聚鸟氨酸、2μg/ml的层粘连蛋白和8ng/mL bFGF，置于37℃，5％CO2培养箱中培养6d得到神经干细胞。
实施例3
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上，其中培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入终浓度如下的营养物质0.5％N2，0.5％B27，25ng/ml bFGF和3ng/ml TGF β；
S2、培养基置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，37℃条件下加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶进行消化传代，接种于新的饲养层细胞上，传代比例1:5.5；
S3、将S2中得到的胚胎干细胞接种至加入不含LIF的ES常规培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养44h得到类胚体；
S4、将S3中得到的类胚体分散成单个细胞后接种至加入10％FBS的DMEM高糖培养基中，37℃，5％CO2培养箱中培养7d，其中培养皿中铺满明胶；
S5、胰酶消化S4中预培养的类胚体，之后接种至DMEM/F12培养基中，其中，所述DMEM/F12培养基中加入9μg/ml多聚鸟氨酸、1.5μg/ml的层粘连蛋白和6ng/mL bFGF，置于37℃，5％CO2培养箱中培养5.5d得到神经干细胞。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于，该方法具体步骤如下：
S1、取人体胚胎干细胞接种在BG02培养基上；
S2、培养过程中每天更换培养液，细胞培养至汇合状态后，消化传代后接种至新的饲养层细胞上，传代比例1:5-6；
S3、将S2中得到的胚胎干细胞接种至加入不含LIF的ES常规培养基中，培养36-48h得到类胚体；
S4、将S3中得到的类胚体分散成单个细胞后接种至加入10％FBS的DMEM高糖培养基中，培养6-8d；
S5、胰酶消化S4中预培养的类胚体，之后接种至DMEM/F12培养基中，培养5-6d得到神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于：所述BG02培养基培养液成分为：DMEM/F12培养基中加入终浓度如下的营养物质0.5％N2，0.5％B27，20-30ng/ml bFGF和2-5ng/ml TGFβ。
3.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于：所述S2中消化条件为，37℃加入1mg/ml Tryp LE细胞消化酶。
4.根据权利要求1所述的一种人工诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于：所述DMEM/F12培养基中加入8-10μg/ml多聚鸟氨酸、1-2μg/ml的层粘连蛋白和5-8ng/mLbFGF。
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