CN102021143A - 一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法，所述方法包括：将传代稳定的间充质干细胞于无血清预处理培养基中，培养4～5天，获得处理后的间充质干细胞用于细胞移植；所述无血清预处理培养基组成如下：1×N2添加剂，1×B27添加剂，5～20ng/mlIGF，5～20ng/ml PDGF或bFGF，溶剂为低糖DMEM培养基或高糖DMEM培养基；本发明通过该无血清预处理培养基培养，能保持MSC细胞学特征，并有效提高其体内移植后的迁移能力，进而提高MSC移植治疗各种损伤疾病的能力。

Description

一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法

(一)技术领域

本发明涉及一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法，可提高细胞移植后修复损伤组织的能力。

(二)背景技术

目前充血性心力衰竭发病率逐年升高，是65岁以上人群的首要住院原因，也是心血管疾病死亡的主要原因。细胞移植疗法可促进梗死局部血管新生和心肌再生，进而改善心肌梗死后的心功能，已成为目前心血管领域的研究热点。然而可供移植的细胞中胚胎心肌细胞增殖能力有限、取材不便，骨骼肌成肌细胞不能与心肌细胞形成缝隙连接且有致心律失常作用，导致该治疗手段止步不前。因此，以干细胞为种子资源的细胞治疗成为进行损伤组织修复和替代的重要手段。

成功建立干细胞治疗需要以下几大要素：具备自我更新，多向分化潜能以及免疫调节等特性的干细胞群体；来源广泛；移植后不发生并发症和肿瘤形成。间充质干细胞(MSC)是一类最早从成体骨髓中分离获得的多能性干细胞，具有分化为成骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞等间质细胞的潜能以及免疫调节作用。由于其特有的生物学性状，它能作为细胞治疗的种子资源，参与治疗骨骼肌肉损伤，改善心血管疾病引发的心肌功能衰退，缓解移植物与宿主之间的免疫排斥现象。除了骨髓能作为MSC来源外，研究证实其还存在于如脂肪，子宫内膜，羊膜液，骨膜，脐带血等成体或胚胎组织中。然而目前所有用于临床试验的人骨髓MSC均在含动物源性的血清如胎牛血清或血清替代物的培养体系中培养扩增，使用这类种子资源进行细胞治疗可能会导致各种异源污染(如蛋白酶传染性因子，病毒和病原微生物)，也有可能引发异种抗原(如非人源唾液酸N-glycolylneuraminic acid和牛载脂蛋白B-100)导致的免疫反应。虽然已有研究试图采用自体或异体的血清或血浆代替胎牛血清来培养人骨髓MSC，但存在一定的局限性，首先供体能提供的自体血清或血浆有限，无法满足MSC扩增的需要；其次异体血清或血浆可能会导致MSC生长停滞或极速衰老。因此，优化干细胞培养体系将有助于提高其未来的临床应用价值。

(三)发明内容

本发明目的是优化干细胞培养体系，提供一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法。

本发明采用的技术方案是：

一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法，所述方法包括：将传代稳定的间充质干细胞于无血清预处理培养基中，常规条件下培养4～5天，获得处理后的间充质干细胞；处理后的细胞可直接用于细胞移植；

所述无血清预处理培养基组成如下：

N2添加剂        终浓度为1×

B27添加剂       终浓度为1×

IGF             5～20ng/ml

PDGF或bFGF      5～20ng/ml

溶剂为低糖DMEM培养基或高糖DMEM培养基。

其中N2，B27添加剂为市购商品，其成分确定且唯一，其终浓度为1×，意思是其中各组分在预处理培养基的终浓度与1×N2和1×B27中相同。N2，B27是美国Invitrogen公司生产的细胞培养基添加成分，用于作为神经干细胞培养基的添加成分，2006美国PNAS杂志报道在DMEM/F12培养基中添加1×N2和1×B27，并辅助添加bFGF能长期维持人胚胎干细胞的自我更新和定向分化潜能，但尚未有文献证实这类添加成分能维持组织来源的MSC的增殖和保持细胞形态。市购商品多为50×或100×母液，按比例(1/50体积或1/100体积)添加使其终浓度为1×即可。50×N2母液主要包含1mM人源转铁蛋白，8.61μM重组人胰岛素，1mM孕酮，1mM四甲烯二胺和1mM亚硒酸。B27主要包含D-生物素，牛血清白蛋白(BSA fraction V，无脂肪酸)，过氧化氢酶，L-肉碱盐酸，皮质酮，乙醇胺盐酸，D-半乳糖，谷胱甘肽，人重组胰岛素，亚麻酸，孕酮，亚硒酸钠，过氧化物歧化酶，白蛋白，维生素E和人源转铁蛋白。

本发明的要点在于利用N2，B27完全代替常规细胞培养基中的FBS，并辅助添加不同组合的细胞因子(IGF/PDGF或IGF/bFGF组合)，培养后能增加MSC基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达和分泌，一定程度提高细胞的运动能力。

所述培养在常规条件下进行，具体于37℃下、在CO₂体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中进行。

具体的，所述方法如下：将继代第8～11代的间充质干细胞于无血清预处理培养基中，于37℃下、在CO₂体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中培养4～5天，获得处理后的间充质干细胞；所述无血清预处理培养基组成如下：

N2添加剂     终浓度为1×

B27添加剂    终浓度为1×

IGF           10ng/ml

PDGF或bFGF    10ng/ml

溶剂为低糖DMEM培养基。

本发明的有益效果主要体现在：本发明通过该无血清预处理培养基培养，能保持MSC细胞学特征，并有效提高其体内移植后的迁移能力，进而提高MSC移植治疗各种损伤疾病的能力。

(四)附图说明

图1为经血来源的MSC分别经两种无血清培养基(N2B27+10ng/mlIGF+10ng/ml PDGF，N2B27+10ng/ml IGF+10ng/ml bFGF)培养5天后的形态学特征，标尺为100μm；

图2为经血来源的MSC分别经两种无血清培养基(N2B27+10ng/mlIGF+10ng/ml PDGF，N2B27+10ng/ml IGF+10ng/ml bFGF)培养5天后的表面抗原表达情况；

图3为利用transwell技术比较不同培养体系下培养4天的经血MSC的体外迁移能力，标尺为100μm；

图4为利用流式细胞技术比较不同培养体系下培养5天的经血MSC移植入大鼠心梗模型后的迁移情况。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1、第10代经血来源的MSC(杭州易文赛生物技术有限公司)常规培养于含20％FBS(v/v)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的低糖DMEM培养基(美国Invitrogen公司)中，一旦汇集，采用0.25％胰酶(w/v)-0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)(w/v)(吉诺生物医药技术有限公司)消化传代。

2、待经血MSC生长至50％汇合度，去除常规的含20％FBS的细胞培养基，采用无血清低糖DMEM洗涤3次以上，随后分别添加含10ng/mlIGF，10ng/ml PDGF(英国PeproTech公司)的无血清N2B27培养基(N2，B27，美国Invitrogen公司)(N2，B27终浓度为1×，溶剂为低糖DMEM培养基)，或含10ng/ml IGF，10ng/ml bFGF(英国PeproTech公司)的无血清N2B27培养基(N2，B27终浓度为1×，溶剂为低糖DMEM培养基)，置于37℃，含5％CO₂和饱和湿度的细胞培养箱(Forma 3111，美国Thermo Fisher公司)内培养4～5天，隔日更换培养基。

3、5天后，对细胞进行细胞形态和表面抗原表达的鉴定：分别获得不同培养体系下培养的人经血MSC，经磷酸缓冲液(PBS)常温洗涤2次，采用0.25％胰酶-0.02％EDTA室温消化2～3分钟，添加含血清培养基终止消化，收集，于室温1200rpm离心5分钟，弃去上清，并添加PBS离心洗涤2次，最后重悬于PBS中，制备成5×10⁵/100μl细胞悬液，各添加20μl Human Fc Receptor Binding Inhibitor Purified(美国eBioscience公司)，4℃孵育20分钟，随后依次添加抗人CD29，CD166抗体及其同型对照抗体(美国eBioscience公司)，避光4℃孵育45分钟，1500rpm离心5分钟去除抗体，添加PBS离心洗涤2次，最后添加500μl PBS重悬后进行流式细胞仪(美国BD公司)计数，对于每个样本至少计数1×10⁴，数据采用流式细胞仪自带软件(美国BD公司)分析。

经血来源的MSC分别经两种无血清培养基培养5天后的形态学特征见图1，与常规的DMEM+20％FBS培养相比，按照本发明方法预培养后的细胞状态更佳，保持典型的成纤维细胞形态；

经血来源的MSC分别经两种无血清培养基培养5天后的表面抗原表达情况见图2，与常规的DMEM+20％FBS培养相比，两者在MSC特异性表面抗原标志CD29，CD166方面表达情况相似。

4、利用Transwell评价人经血MSC的体外迁移能力：分别获得不同培养体系下培养4天的人经血MSC，消化收集后，各采用200μl含1％FBS的低糖DMEM培养基重悬，制备成4×10⁴细胞悬液，接种于Transwell小室(美国Costar公司，孔径为8μm)中，小室外添加500μl含20％FBS的低糖DMEM培养基，置于37℃，含5％CO₂和饱和湿度的细胞培养箱孵育20-24小时。随后，取出Transwell小室，用棉签擦去小室膜上层细胞，PBS轻柔洗涤2次后，置于4％多聚甲醛(美国Sigma公司)内，37℃固定30分钟，PBS洗涤2-3次后，采用1μg/ml Hoechst 33258(美国Invitrogen公司)室温避光染色15分钟，荧光显微镜(日本Olympus公司)拍照记录。结果见图3。与常规含血清培养基相比，采用本发明方法预处理后的细胞迁移能力更强。

5、利用大鼠急性心梗模型的体内移植来评价人经血MSC的体内迁移能力：Sprague Dawley(SD)大鼠(浙江省医学科学院动物中心)经水合氯醛麻醉后，气管插管，小动物呼吸机支持，开胸，用6-0丝线在左心耳下方结扎左前降支冠脉，根据心电图变化和局部组织颜色变化确定心梗模型制成，关胸。分别获得不同培养体系下培养5天的人经血MSC，PBS轻柔洗涤2～3次后，添加5μl DiI(美国Molecular Probes公司)/1ml低糖DMEM培养基，置于37℃，含5％CO₂和饱和湿度的细胞培养箱孵育20分钟，随后采用PBS轻柔洗涤3次，彻底去除DiI，消化收集细胞，分别采用300μl低糖DMEM重悬，通过尾静脉注射入SD大鼠心梗模型中，20～24小时后，引颈处死大鼠，分别取出心脏左室，骨髓，肺，脾脏，匀浆或1mg/mlI型胶原酶(美国Sigma公司)消化后获得细胞悬液，离心洗涤后，采用红细胞裂解液，冰上处理4～10分钟，2000-3000rpm离心10分钟后采用适量PBS重悬，流式细胞仪计数，对于每个样本至少计数2×10⁵，数据流式细胞仪自带软件分析。

结果见图4，与常规含血清培养基相比，采用本发明方法预处理后的细胞体内迁移能力更强。

结论：无血清培养基(N2B27+10ng/ml IGF+10ng/ml PDGF，N2B27+10ng/ml IGF+10ng/ml bFGF)预处理后能维持MSC典型的成纤维细胞形态和表面抗原标志的表达，同时也能提高其体内体外的运动迁移能力，进一步提高MSC移植治疗各种损伤疾病的效果。

Claims (3)

1.一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法，所述方法包括：将传代稳定的间充质干细胞于无血清预处理培养基中，培养4～5天，获得处理后的间充质干细胞；

所述无血清预处理培养基组成如下：

N2添加剂     终浓度为1×

B27添加剂    终浓度为1×

IGF          5～20ng/ml

PDGF或bFGF   5～20ng/ml

溶剂为低糖DMEM培养基或高糖DMEM培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述培养于37℃下、在CO₂体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中进行。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下：将继代第8～11代的间充质干细胞于无血清预处理培养基中，于37℃下、在CO₂体积浓度5％、空气体积浓度95％的混合气体中培养4～5天，获得处理后的间充质干细胞；所述无血清预处理培养基组成如下：

N2添加剂     终浓度为1×

B27添加剂    终浓度为1×

IGF          10ng/ml

PDGF或bFGF   10ng/ml

溶剂为低糖DMEM培养基。

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