CN104988110A - 脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，包括无菌条件下分离提取脐带间充质干细胞传代培养后，进行诱导：1)在含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中加入含β-神经生长因子，激活素A，尼克酰胺，表皮生长因子，进行诱导培养；2)添加含尼克酰胺，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基继续培养至细胞转化结束，获得胰岛细胞液。通过本发明所获得胰岛细胞不仅数量较多，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素，对于临床移植脐带间充质干细胞治疗1型糖尿病具有重要意义。

Description

脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物工程、组织工程和生物医药领域，特别涉及利用脐带间充质干细胞诱导转化为胰岛细胞的方法。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。临床上，Ⅰ型及部分Ⅱ型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。而细胞治疗是糖尿病尤其是Ⅰ型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的胰岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难极大的限制了这种疗法的应用。

干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想靶细胞。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人羊水、脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。

对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗Ⅰ型糖尿病的理想策略之一。目前，现有技术中已出现诱导干细胞转化为胰岛细胞的方法，即应用插入式细胞培养皿共培养板体外诱导脐带间充质干细胞向胰岛样细胞分化具体为：选取第3代脐带间充质干细胞，用含10％FBS(胎牛血清)的L-DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×105个/ml，接种于普通6孔板，倒置显微镜下观察细胞贴壁后，改为L-DMEM/RPMI1640(1:1)培养基(低糖型改良杜氏伊格尔培养基与RPMI 16401:1混合而成的培养基)。同时将已分离获得的胰岛细胞，以50个/孔接种于共培养板的中，进行脐带间充质干细胞和胰岛细胞两种细胞的共培养。然而，此种共培养方法不仅需要一定的胰岛细胞源，过程较繁琐，花费较大，而且所获得的更多为散在胰岛样细胞，数量较少，胰岛细胞团几乎没有，而且散在的胰岛样细胞相对较小，胰岛素分泌量少难以达到临床移植要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中干细胞与胰岛细胞共培养方式所获得的胰岛细胞较小，数量较少，且花费较大等缺陷，提供一种高效的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，通过该方法不仅提高了胰岛细胞的数量，也提高了胰岛细胞的质量。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，取第三代脐带间充质干细胞，置于培养箱中，按以下步骤对第三代脐带间充质干细胞进行诱导：

在细胞培养基中加入第一种诱导液，培养至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体；

并在含有胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基中，加入第二种诱导液，培养所述预转化干细胞体至细胞转化结束，获得胰岛细胞液；

其中，所述第一种诱导液包括5-15mmol/L尼克酰胺、15-30μg/L表皮生长因子；

所述第二种诱导液包括5-15mmol/L尼克酰胺和5-15μg/L碱性成纤维细胞生长因子。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第一诱导液还包括60μg/L-150μg/Lβ-神经生长因子和1-10nmol/L激活素A。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第一诱导液还包括还原剂。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述还原剂为β-琉基乙醇，且β-琉基乙醇为5-15μg/L。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第一种诱导液中尼克酰胺的浓度为5mmol/L，表皮生长因子的浓度为30μg/L，β-神经生长因子的浓度为150μg/L，激活素A的浓度为10nmol/L，β-琉基乙醇的浓度为10μg/L。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第一种诱导液中尼克酰胺的浓度为15mmol/L，表皮生长因子的浓度为15μg/L，β-神经生长因子的浓度为60μg/L，激活素A的浓度为1nmol/L，β-琉基乙醇的浓度为15μg/L。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第一种诱导液中尼克酰胺的浓度为10mmol/L，表皮生长因子的浓度为25μg/L，β-神经生长因子的浓度为100μg/L，激活素A的浓度为4nmol/L，β-琉基乙醇的浓度为5μg/L。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，DMEM/F12培养基中含有的胰岛素-转铁蛋白-硒质量分数为1％-5％。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第二种诱导液中尼克酰胺的浓度为10mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10μg/L。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第二种诱导液中尼克酰胺的浓度为5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5μg/L。

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，所述第二种诱导液中尼克酰胺的浓度为15mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15μg/L。

实施本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，可以达到以下有益效果：该方法不仅易操作，而且所获得胰岛细胞数量较多，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞方法所获得胰岛细胞通过双硫腙染色得到的显微镜下的细胞分布图；

图2为现有技术中脐带间充质干细胞和胰岛细胞共培养方式获得的胰岛细胞通过双硫腙染色得到的显微镜下的细胞分布放大图。

具体实施方式

为解决现有技术中利用脐带间充质干细胞与胰岛细胞共同培养诱导脐带间充质干细胞转化的胰岛细胞较少，且数量较少等缺陷，本发明的创新点在于提供一种独立培养诱导脐带间充质干细胞转化成胰岛细胞的方法，从而实现了提高脐带间充质干细胞转化率及提高转化后胰岛细胞质量的目的。

具体地，本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法为：

取第三代脐带间充质干细胞，置于培养箱中，并按以下步骤对第三代脐带间充质干细胞进行诱导：

1)在细胞培养基中加入第一种诱导液，培养至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体；

2)并在含有质量分数为1％-5％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基中，加入第二种诱导液，培养上述预转化干细胞体至细胞转化结束，获得胰岛细胞液；

其中，所述第一种诱导液包括5-15mmol/L尼克酰胺和15-30μg/L表皮生长因子；细胞培养基优选为含体积分数为5％-30％胎牛血清的DMEM/F12培养基；

所述第二种诱导液包括5-15mmol/L尼克酰胺和5-15μg/L碱性成纤维细胞生长因子。

尼克酰胺的主要作用是参与呼吸链，参与细胞增殖转化的呼吸过程及电子传递过程，促进细胞的增殖分化，在本发明的诱导过程中起到重要的作用；表皮生长因子可以促进脐带间充质干细胞增殖及促进胰岛样细胞团的形成；因此，在本发明诱导的第1)步加入尼克酰胺和表皮生长因子可以促进脐带间充质干细胞的增殖分化，完成预转化过程。而碱性成纤维细胞生长因子可促进细胞加速增殖,细胞体积增大；含有胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基可促使预转化的干细胞体定向转化成胰岛细胞。因此，在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法中，通过加入表皮生长因子促进脐带间充质干细胞增殖形成细胞团，并通过碱性成纤维细胞生长因子促进细胞体积增大，进而在胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基的作用下促使预转化的干细胞体定向转化成细胞体积较大的胰岛细胞，且易形成胰岛细胞团，解决了现有技术中，将干细胞与胰岛细胞共培养所获得的胰岛细胞较分散，且细胞体积较小，性状不稳定等缺陷，同时，也解决了转化所需胰岛细胞成本较大的难题。

进一步地，所述第一种诱导液还可以包括60μg/L-150μg/L的β-神经生长因子和1-10nmol/L激活素A。β-神经生长因子属于神经营养因子，可以促进脐带间充质干细胞的生长，维持脐带间充质干细胞正常的活性和功能；而激活素A，可以促进脐带间充质干细胞的增殖，因此，在第一诱导液中加入β-神经生长因子和激活素A不仅可以保持脐带间充质干细胞的活性，提高存活率，而且还可以进一步促进脐带间充质干细胞的增殖。

由于在细胞增殖预转化时期，细胞的氧化作用较强，会向培养基中释放氧自由基，氧自由基积累到一定程度时，会破坏细胞膜和细胞器膜，杀死细胞，不利于细胞的生长增殖，使得细胞达不到很高的密度，因此，第一种诱导液中还可以包括还原剂，如β-琉基乙醇，β-巯基乙醇是一种强还原剂,可以中和掉细胞培养基中积累的氧自由基,这样可以使得细胞分裂到很高的密度而不死亡,从而有利于脐带间充质干细胞的增殖，在细胞增殖预转化时期能降低细胞的氧化作用,提高细胞内谷胱甘肽的水平，清除氧自由基，有利于脐带间充质干细胞的转化，优选地，β-巯基乙醇的浓度为8-10μg/L。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

在本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法包括以下步骤：

(1)脐带间充质干细胞的分离培养

无菌条件下取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，脐带离体后浸泡于每毫升含25U肝素钠的生理盐水中进行4-6h处理后，超净台内剔除脐带的动静脉，剥去外层羊膜，将脐带切成1mm×1mm×1mm大小的组织块并贴于培养皿底，加入含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养，培养2周后移除，待贴壁细胞达到80％-90％汇合时进行传代培养，得到第三代脐带间充质干细胞。

其中，含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM(dulbecco's modifiedeagle medium，改良杜氏伊格尔培养基)成分为：含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、15ug/L的IL-3、5ug/L粒细胞集落刺激生物因子、1.0-3.3g/L葡萄糖。

当然可以理解的是，第三代脐带间充质干细胞的来源方式也并不局限于此，现有技术中可获取的第三代脐带间充质干细胞均适用于本发明。

(2)脐带间充质干细胞的诱导转化

1)在体积分数为30％胎牛血清的DMEM/F12培养基中加入含150μg/L的β-神经生长因子，10nmol/L激活素A，5mmol/L尼克酰胺，30μg/L表皮生长因子，10μg/Lβ-琉基乙醇的第一种诱导液，在37℃和5％CO₂的培养箱中培养7d至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体；

2)添加含10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的第二种诱导液，和含有质量分数为1％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基，在37℃和5％CO₂的培养箱中对预转化干细胞体培养14d至细胞转化结束，获得胰岛细胞液；

(3)胰岛细胞的分离

弃去上述培养液上清，用磷酸盐溶液(下称PBS缓冲液)清洗2次，加入L-DMEM(低糖型改良杜氏伊格尔培养基)培育1-2h后，收集上清，PBS洗2次，再换为H-DMEM(高糖型改良杜氏伊格尔培养基)培育1-2h，收集上清，即为分离后的胰岛细胞。

实施例2

该实施例与实施例1相比，除第三代脐带间充质干细胞的诱导转化步骤1)有所区别以外，其他过程步骤均相同。

该实施例中，第三代脐带间充质干细胞的诱导转化步骤1)为：

加入含60μg/Lβ-神经生长因子，1nmol/L激活素A，15mmol/L尼克酰胺，15μg/L表皮生长因子，15μg/L的β-琉基乙醇的第一种诱导液，体积分数为5％胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养7天至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体。

实施例3

该实施例与实施例1相比，除脐带间充质干细胞的诱导转化步骤1)有所区别以外，其他过程步骤均相同。

该实施例中，脐带间充质干细胞的诱导转化步骤1)为：

加入含100μg/Lβ-神经生长因子，4nmol/L激活素A，10mmol/L尼克酰胺，25μg/L表皮生长因子，5μg/Lβ-琉基乙醇的第一种诱导液，在体积分数为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养7天至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体。

实施例4

该实施例与实施例1相比，除脐带间充质干细胞的诱导转化步骤2)有所区别以外，其他过程步骤均相同。

该实施例中，脐带间充质干细胞的诱导转化步骤2)为：

添加含10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的第二种诱导液，和含有质量分数为1％胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基，在37℃和5％CO₂的培养箱中对预转化干细胞体培养14d至细胞转化结束，获得胰岛细胞液。

实施例5

该实施例与实施例1相比，除脐带间充质干细胞的诱导转化步骤2)有所区别以外，其他过程步骤均相同。

该实施例中，脐带间充质干细胞的诱导转化步骤2)为：

添加含5mmol/L尼克酰胺，5μg/L碱性成纤维细胞生长因子的第二种诱导液，和含有质量分数为3％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基，在37℃和5％CO₂的培养箱中对预转化干细胞体培养14d至细胞转化结束，获得胰岛细胞液。

实施例6

该实施例与实施例1相比，除脐带间充质干细胞的诱导转化步骤2)有所区别以外，其他过程步骤均相同。

该实施例中，脐带间充质干细胞的诱导转化步骤2)为：

添加含15mmol/L尼克酰胺，15μg/L碱性成纤维细胞生长因子的第二种诱导液，和含有质量分数为5％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基，在37℃和5％CO₂的培养箱中对预转化干细胞体培养14d至细胞转化结束，获得胰岛细胞液。

为进一步验证本发明的有益效果，对本发明实施例1-6中所获得胰岛细胞分别进行相应参数的测定，主要包括胰岛细胞率、C肽分泌量和胰岛素分泌量的测定；并通过设置对照组对比突出本发明的有益效果，对照组为通过利用现有技术中脐带间充质干细胞和胰岛细胞共培养方式诱导获得的胰岛细胞,详见本发明说明书背景技术部分。

具体测定过程为：

1、采用流式细胞术检测胰岛细胞百分率

分别对本发明实施例1-6中诱导的胰岛细胞液以及对照组诱导第17d后的细胞培养上清液分别进行如下操作：用质量分数为0.25％胰蛋白酶消化后,PBS缓冲液洗涤3次,1000rpm离心5min,弃上清,加入insul in-CY5(胰岛素CY5荧光标记苏素),流式细胞仪计数105个细胞；分别进行6组平行实验胰岛细胞可被insul in-CY5标记，通过流式细胞器自带的软件分析可得出表1中胰岛细胞率的数据。

2、利用放射免疫法检测胰岛细胞分泌的胰岛素和C肽含量

分别对本发明实施例1-6中诱导的胰岛细胞液以及对照组诱导第17d后的细胞培养上清液分别进行如下操作：吸取培养上清液0.5ml于移液管中，-20℃冻存留取标本。按照北京福瑞生物工程公司的人胰岛素和C肽放免试剂盒说明测定留取标本中胰岛素和C肽的含量，测定结果如表1所示。

表1：

由表1可知，通过本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法所获得胰岛细胞率远大于现有技术，且由C肽分泌量和胰岛素分泌量可知，转化后的胰岛细胞利用率较高，因此，本发明不仅提高了胰岛细胞的数量，也提高了胰岛细胞的质量。

除此之外，通过设置双硫腙染色法来进一步验证通过本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞方法能够提高胰岛细胞数量并获得的胰岛细胞团；本次测试对象为：1、实验组-本发明实施例1获得胰岛细胞；2、对照组-以现有技术中脐带间充质干细胞和胰岛细胞共培养方式诱导获得的胰岛细胞，详见本发明说明书背景技术部分；

具体步骤为：

1、配制双硫踪工作液:将50mg双硫腙溶于5毫升DMSO(二甲基亚砜)，过滤、分装贮存于-20℃保存。

2、将实验组和对照组分别以磷酸盐溶液洗涤2次,各加入l毫升的磷酸盐溶液和10μL的双硫腙工作液(终浓度1％,V/V),37℃孵育15min,倒置显微镜下观察胰岛细胞着色情况，分别如图1和图2所示。图1中深色部分代表通过本发明提供的方法诱导出的胰岛细胞，从图中可以看出，胰岛细胞聚集成团，面积较大，且数量较多；图2深色部分代表通过现有技术诱导出的胰岛细胞放大图，从图中可以看出胰岛细胞较分散、不成团，胰岛细胞数量相对较少。

综上所述，相对于现有技术中利用干细胞与胰岛细胞共培养获得胰岛细胞的方式，本发明提供的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，不仅省去前期获取胰岛细胞的过程，易操作，减少花费，而且所获得胰岛细胞数量较多，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素，对于临床移植脐带间充质干细胞治疗1型糖尿病具有重要意义。

以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (11)

1.一种脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于：

取第三代脐带间充质干细胞，置于培养箱中，按以下步骤对第三代脐带间充质干细胞进行诱导：

在细胞培养基中加入第一种诱导液，培养至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体；

并在含有胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基中，加入第二种诱导液，培养所述预转化干细胞体至细胞转化结束，获得胰岛细胞液；

其中，所述第一种诱导液包括5-15mmol/L尼克酰胺和15-30μg/L表皮生长因子；

所述第二种诱导液包括5-15mmol/L尼克酰胺和5-15μg/L碱性成纤维细胞生长因子。

2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第一诱导液还包括60μg/L-150μg/Lβ-神经生长因子和1-10nmol/L激活素A。

3.根据权利要求2所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第一诱导液还包括还原剂。

4.根据权利要求3所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述还原剂为β-琉基乙醇，且β-琉基乙醇为5-15μg/L。

5.根据权利要求4所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第一种诱导液中尼克酰胺的浓度为5mmol/L，表皮生长因子的浓度为30μg/L，β-神经生长因子的浓度为150μg/L，激活素A的浓度为10nmol/L，β-琉基乙醇的浓度为10μg/L。

6.根据权利要求4所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第一种诱导液中尼克酰胺的浓度为15mmol/L，表皮生长因子的浓度为15μg/L，β-神经生长因子的浓度为60μg/L，激活素A的浓度为1nmol/L，β-琉基乙醇的浓度为15μg/L。

7.根据权利要求4所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第一种诱导液中尼克酰胺的浓度为10mmol/L，表皮生长因子的浓度为25μg/L，β-神经生长因子的浓度为100μg/L，激活素A的浓度为4nmol/L，β-琉基乙醇的浓度为5μg/L。

8.根据权利要求1-7任一项所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，DMEM/F12培养基中含有的胰岛素-转铁蛋白-硒质量分数为1％-5％。

9.根据权利要求1-7任一项所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第二种诱导液中尼克酰胺的浓度为10mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10μg/L。

10.根据权利要求1-7任一项所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第二种诱导液中尼克酰胺的浓度为5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5μg/L。

11.根据权利要求1-7任一项所述的脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法，其特征在于，所述第二种诱导液中尼克酰胺的浓度为15mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15μg/L。