CN107384862B - MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒 - Google Patents

MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN107384862B
CN107384862B CN201710728042.0A CN201710728042A CN107384862B CN 107384862 B CN107384862 B CN 107384862B CN 201710728042 A CN201710728042 A CN 201710728042A CN 107384862 B CN107384862 B CN 107384862B
Authority
CN
China
Prior art keywords
scs
recombinant human
culture
growth factor
mscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710728042.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107384862A (zh
Inventor
张洪钿
苑春慧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Regeneration Biology Technology Research Institute Co ltd
Original Assignee
Beijing Regeneration Biology Technology Research Institute Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Regeneration Biology Technology Research Institute Co ltd filed Critical Beijing Regeneration Biology Technology Research Institute Co ltd
Priority to CN201710728042.0A priority Critical patent/CN107384862B/zh
Publication of CN107384862A publication Critical patent/CN107384862A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107384862B publication Critical patent/CN107384862B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒，包括SCs无血清基础培养基、SCs培养添加剂1、SCs培养添加剂2及SCs培养表面包被液，其中，SCs无血清基础培养基为含有B27，无动物源成分血清替代品，人二氢睾丸酮，L‑谷氨酰胺的DMEM/F12；SCs培养添加剂1为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子、全反式维甲酸的DMEM/F12；SCs培养添加剂2为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、毛喉素、重组人血小板来源生长因子AA、重组人神经胶质细胞生长因子‑2的DMEM/F12；SCs培养表面包被液为含有重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白‑β1的DMEM/F12。本发明提出的雪旺细胞制备试剂盒，具有操作简单、无动物源成分的优势，获得的SCs均一性好、产率高。

Description

MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒。
背景技术
神经细胞在生理学方面属于不可再生细胞，当神经损伤发生时，常规的治疗手段是周围神经移植来进行修复。自体神经移植一方面会带来新的神经损伤，另一方面，由于神经再生不全、远端接合口纤维化、疤痕化和神经瘤发生等影响神经功能恢复。近些年的研究发现，周围神经系统的组织学微环境是神经再生修复的关键因素，而雪旺细胞（Schwanncells ，SCs）是微环境的重要组成部分。诸多研究表明，SCs与周围细胞外基质成分相互作用稳定髓磷脂的生理状态，在神经再生过程中诱导髓鞘形成，并分泌多种神经营养和嗜神经因子促进轴突再生，SCs移植在脱髓鞘、神经退行性、外伤性神经损伤等疾病的细胞治疗领域的应用受到广泛关注。
既往SCs多分离自自体神经周围组织，其取材受限，提取复杂，细胞收率低，限制了雪旺细胞的临床研究和产品化。近年来的研究发现，多种来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有SCs分化潜能。目前，多个实验室披露的诱导SCs分化的方法需要β-巯基乙醇、全反式维甲酸两次预诱导，然后使用SCs诱导培养基，不经过Nestin+神经前体细胞阶段，不符合雪旺细胞发育规律，且步骤繁琐，使用胎牛血清，得到的SCs均一性差、产率低。因此，研究如何从MSCs制备，按SCs发育程序诱导，能够用于临床的、组织工程产品的纯度高、数量大的雪旺细胞是关键环节。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种MSCs来源的雪旺细胞制备方法及试剂盒，具有操作简单、无动物源成分的优势，获得的SCs均一性好、产率高的特点。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒，包括SCs无血清基础培养基、SCs培养添加剂1、SCs培养添加剂2及SCs培养表面包被液，其中，
所述SCs无血清基础培养基为含有B27，无动物源成分血清替代品，人二氢睾丸酮，L-谷氨酰胺的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂1为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子、全反式维甲酸的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂2为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、毛喉素、重组人血小板来源生长因子AA、重组人神经胶质细胞生长因子-2的DMEM/F12；
所述SCs培养表面包被液为含有重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1的DMEM/F12。
进一步地，
所述SCs无血清基础培养基为含有1×B27，10%无动物源成分血清替代品，5nM人二氢睾丸酮，2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂1为含有1 ug /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子、1 ug /mL重组人表皮生长因子、2ug/ml 全反式维甲酸的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂2为含有0.5 ug/mL 重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5mM毛喉素、250 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA、2.5ug/mL重组人神经胶质细胞生长因子-2的DMEM/F12；
所述SCs培养表面包被液为含有100ng/mL重组人层黏连蛋白、100ng/mL重组人纤黏连蛋白、1ug/mL 重组人调蛋白-β1的DMEM/F12。
本发明的另一方面，提供了一种MSCs来源的雪旺细胞制备方法，包括如下步骤：
S1.用SCs培养表面包被液包被培养表面；
S2.P2代的MSCs以MSCs培养基培养至60-70%汇合；
S3.换含SCs培养添加剂1的SCs无血清基础培养基，培养至80-90%汇合，用胰蛋白酶溶液消化收获细胞，记为神经上皮预诱导细胞；
S4.以含SCs培养添加剂2的SCs无血清基础培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至被SCs培养表面包被液包被的培养表面，培养至60-80%汇合时传代，记为P0代SCs。
进一步地，所述含SCs培养添加剂1的SCs无血清基础培养基中SCs培养添加剂1含量为2%；所述含SCs培养添加剂2的SCs无血清基础培养基中SCs培养添加剂2的含量为2%。
进一步地，所述步骤S4后还包括如下步骤：将P0代SCs按常规贴壁细胞传代方法传代，收获P1代细胞。
进一步地，所述常规贴壁细胞传代方法传代过程中的接种密度为2×104/cm2，培养体系为含2%SCs培养添加剂2的SCs无血清基础培养基；培养表面为经SCs培养表面包被液包被的培养表面。
进一步地，所述MSCs来源于人脐带、羊膜、羊水、胎盘、脐带血、宫膜、牙髓、骨髓、皮肤、肌腱、骨骼肌组织。
本发明的有益效果：使用本发明所述的MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒，P1代SCs得率是初始接种P2代MSCs的42.16倍，并且，GFAP+SCs为80.72±7.31%，均一性较高，说明本试剂盒是一种高纯度、高效制备GFAP+SCs的试剂盒，并且，使用方便，无血清等动物源成分。
附图说明
图1是P2代羊水来源MSCs的细胞形态图;
图2是P2代羊水来源MSCs细胞表达nestin形态图；
图3是P2代羊水来源MSCs细胞表达GFAP形态图；
图4是神经上皮预诱导细胞形态图；
图5是神经上皮预诱导细胞表达nestin形态图；
图6是神经上皮预诱导细胞表达GFAP形态图；
图7是P0代SCs的细胞形态图;
图8是P0代SCs细胞表达nestin形态图；
图9是P0代SCs细胞表达GFAP形态图；
图10是P1代SCs的细胞形态图;
图11是P1代SCs细胞表达nestin形态图；
图12是P1代SCs细胞表达GFAP形态图；
图13是不同培养阶段细胞标志蛋白的表达的统计图；
图14是不同培养阶段细胞得率统计图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中所使用的各种试剂、机械未经特殊说明均可从商业途径获得。
首先，对本申请中出现的英文名称及实施例中所具体使用的各种产品的生产厂家、货号进行简要说明。
DMEM/F12：货号12400-024，生产厂家GIBCO；
B27:人体白细胞抗原；
无动物源成分血清替代品：货号C08003C，生产厂家Stemboscience；
PBS:磷酸盐缓冲液，货号PB2004Y，生产厂家天津灏洋；
0.25%胰蛋白酶溶液：货号T6424-1VL，成产厂家Biological industries；
AccutaseTM消化液：货号40506ES60，生产厂家Innovative Cell Technologies,Inc；
冻存保护液：货号CELLBANKER-II，生产厂家ZENOAQ；
淋巴细胞分离液：货号LDS10750125，生产厂家天津灏洋；
抑肽酶溶液：货号A1250000，生产厂家Sigma；
FBS：胎牛血清，货号04-400-1A，生产厂家BI。
实施例一：试剂盒的构成
MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒包括SCs无血清基础培养基（SBM）、SCs培养添加剂1（SS1）、SCs培养添加剂2（SS2）及 SCs培养表面包被液（SCB）。
其中，SCs无血清基础培养基（SBM）为包含以下物质的DMEM/F12培养基：
1×B27，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
2mM L-谷氨酰胺。
SCs培养添加剂1（SS1）为包含以下物质的DMEM/F12培养基：
1 ug /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh b-FGF），
1 ug /mL重组人表皮生长因子（rh EGF），
2ug/ml 全反式维甲酸。
SCs培养添加剂2（SS2）为包含以下物质的DMEM/F12培养基：
0.5 ug/mL 重组人碱性成纤维细胞生长因子（rh b-FGF），
0.5mM毛喉素（FSK），
250 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA（rh PDGF-AA），
2.5ug/mL重组人神经胶质细胞生长因子-2（rh GGF-2）。
SCs培养表面包被液（SCB）为包含以下物质的DMEM/F12培养基：
100ng/mL重组人层黏连蛋白（rh LN），
100ng/mL重组人纤黏连蛋白（rh FN），
1ug/mL 重组人调蛋白-β1（rh HRG-β1）。
实施例二：SCs的制备
SCs的制备使用的试剂，除PBS、消化液、冻存保护液外，均为实施例一中所述的MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒提供。
S1. 4℃条件下将-20℃以下冻存的SS1、SS2、SCB过夜解冻备用;
S2.用10×SCB（即将试剂盒中的SCB稀释至终浓度为10%）按每毫升包被35cm2培养表面室温包被培养表面1小时，吸弃包被液，以2-8℃PBS漂洗3次，置于4℃保存不超过1周；
S3.人脐带、羊膜、羊水、胎盘、脐带血、宫膜、牙髓、骨髓、皮肤、肌腱、骨骼肌等组织来源的P2代MSCs，按6000个/cm2接种，以MSCs培养基培养至60-70%汇合，其中，所述MSCs培养基为含10%无动物源成分血清替代品的DMEM/F12；
S4.换含2%SS1的SBM培养基，培养至80-90%汇合，用0.25%胰蛋白酶溶液消化收获细胞，记为神经上皮预诱导细胞；
S5.以含2%SS2的SBM培养基重悬神经上皮预诱导细胞，调整细胞密度至2×104/cm2，接种至SCB包被的培养表面培养，隔天换液，8-12天60-80%汇合时传代，记为P0代SCs；
S6.P0代SCs按常规贴壁细胞传代方法传代，消化液为AccutaseTM消化液，接种密度为2×104/cm2，培养体系为含2% SS2的SBM培养基；培养表面为SCB包被的培养表面；
S7.收获P1代细胞，可以直接制备制剂，也可以使用冻存保护液低温冻存，冻存细胞密度为2×106/mL。
实施例三：羊水MSCs来源的SCs体外制备
3.1羊水MSCs分离培养
无菌穿刺采集16-20周胎儿羊水，以淋巴细胞分离液，2000g离心30分钟，取中间层单个核细胞；以MSCs培养基（即含10%无动物源成分血清替代品的DMEM/F12培养基）重悬细胞，调整细胞密度至1×105/mL，接种至175cm2组织培养瓶（货号：EasyFlask，生产厂家：NUNC），隔天换液，培养至80-90%汇合时收获。收获时吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以PBS洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代MSCs；P0代MSCs以MSCs培养基重悬，调整细胞密度为6000/cm2，接种至175cm2组织培养瓶，培养至70-80%汇合时收获P1代MSCs；按细胞密度6000/cm2继续传代，收获P2代MSCs。
3.2MSCs源SCs制备
以MSCs培养基重悬P2代羊水来源的MSCs，按6000个/cm2接种，培养至60-70%汇合，换含2%SS1的SBM培养基，培养至80-90%汇合，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为神经上皮预诱导细胞；
以含2%SS2的SBM培养基重悬神经上皮预诱导细胞，按2×104/cm2接种至SCB包被的175cm2组织培养瓶，隔天换液，60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入AccutaseTM消化液5mL，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代SCs；
以含2%SS2的SBM培养基重悬P0代SCs，按2×104/cm2接种至SCB包被的175cm2组织培养瓶，培养至60-80%汇合时收获，记为P1代SCs。
实施例四：MSCs、神经上皮预诱导细胞、SCs的一般生物学检测
4.1免疫组织学检测
贴壁细胞免疫组织学检测时，吸弃培养基，以PBS漂洗2次，以4％多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟，以PBS漂洗2次，滴加一抗，4℃过夜；PBS洗涤2次，滴加FITC标记二抗，室温孵育1小时；PBS漂洗2次，滴加1μg/ ml 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），孵育5分钟，PBS漂洗2次，镜检。
免疫组织化学检测使用抗体包括：
mouse anti-nestin (1:400)，生产厂家Millipore；
mouse anti-GFAP (1:800) ，生产厂家Chemicon；
FITC标记二抗：猴抗鼠IgG（1:200），生产厂家Life Technologies。
4.2细胞得率统计
以细胞成像系统（Cytell Cell Imaging System，GE Healthcare）行活细胞计数和免疫组织学染色计数，包括：P2代MSCs、nestin+神经上皮预诱导细胞数量，nestin+、GFAP+的P0代SCs和P1代SCs数量。
统计学分析采用SPSS17.0进行统计学处理。数据以
Figure 608044DEST_PATH_IMAGE002
±S表示，均值比较采用独立样本t-test，P<0.05有统计学意义。
实施例五：结果
5.1神经上皮预诱导细胞培养
不同培养阶段细胞标志蛋白的表达统计结果如图13所示。
如图1~3所示，
P2代羊水来源MSCs呈纤维样细胞形态，随培养时间延长呈典型的漩涡状生长（参见图1）;
47.42±-6.67%的细胞表达nestin（参见图2）；
1.17±0.16%的细胞表达GFAP（参见图3）；
如图4~6所示，
经含2%SS1的SBM培养基培养后，细胞逐渐相互平行, 缩回细胞质, 形成明显拉长的细胞体（参见图4）；
87.19±9.33%的细胞表达nestin（参见图5）；
11.80±2.11%的细胞表达GFAP（参见图6）。
5.2 SCs培养
如图7~9所示
以含2%SS2的SBM培养基培养神经上皮预诱导细胞4-6天，部分贴壁细胞获得双极性形态（参见图7）,细胞增殖较慢，8-12天60-80%汇合时，多数细胞为双极性形态，部分多极性形态，呈现鱼群状生长（参见图7）；
21.62±5.51%的细胞表达nestin（参见图8）；
81.09±9.37%的细胞表达GFAP（参见图9）。
5.3 SCs细胞得率
不同培养阶段细胞得率统计结果如图14所示。
1.05×106P2代MSCs按6000个/cm2接种到175cm2组织培养瓶中，获得6.44±0.98×106神经上皮预诱导细胞；
神经上皮预诱导细胞约按2×104/cm2接种至SCB包被的2个175cm2组织培养瓶（Easyflask，NUNC）中，获得19.71±2.99 ×106 P0代SCs；
P0代OPCs约按2×104/cm2接种至SCB包被的5个175cm2组织培养瓶（Easyflask，NUNC）中，获得44.27±6.88 ×106 P1代SCs。
实施例六：结果分析
外周神经系统损伤时，机体的生理性反应是保护损伤区域剩余的神经组织，重建轴突，SCs在其中起到关键作用。SCs构建轴突再生通道，通过细胞间相互作用和分泌细胞因子、趋化因子，诱导轴突生长和新生，重建髓鞘结构。
SCs为基础的外周神经损伤修复医学的技术基础是SCs的制备。既往SCs分离依赖于神经周边组织，但不可避免造成新的损伤，供体非常受限。并且，成体分离的SCs数量有限，限制了SCs的临床研究和产业化转化。因此，通过干细胞技术，研究干细胞来源SCs的制备方法，是周围神经损伤的再生修复医学的关键问题。
近年来，脂肪组织来源的MSCs的SCs诱导技术取得很大进展，其他诸如：羊膜、脐带等来源的MSCs的相似的SCs诱导方法也有报道。其共性在于，首先需要通过β-巯基乙醇预诱导。β-巯基乙醇是抗氧化剂，在低浓度时保护细胞免受自由基的影响，起初在胚胎干细胞的神经分化诱导中，但β-巯基乙醇在干细胞分化中主要诱导骨架蛋白表达的变化，且有一定的毒性；其次采用诱导试剂直接诱导MSCs向雪旺细胞分化，没有经过神经前体细胞阶段，不符合SCs发育规律，SCs均一性差，收率不高。而另外的研究采用MSCs-神经球-SCs的分化途径，经过Nestin+神经球阶段，其操作复杂，SCs均一性高，但产率低。申请人开发了一种基于MSCs-神经上皮预诱导细胞-SCs途径的试剂盒，用于MSCs来源的SCs的制备，其操作简单，无动物源成分，SCs均一性高，细胞量大。使用羊水来源的MSCs体外制备SCs，发现，P1代SCs得率是初始接种P2代MSCs的42.16倍，并且，GFAP+SCs为80.72+/-7.31%，均一性较高，说明本试剂盒是一种高纯度、高效制备羊水来源的SCs的试剂盒。
目前的研究表明，MSCs的来源广泛，羊水、骨髓、羊膜、胎盘、脐带、脐带血、肌肉、肌腱、骨膜等多种组织中均能制备MSCs。不同组织来源的MSCs在表型特征方面存在一定差异，例如成体MSCs表达stro-1，而围产期组织来源MSCs不表达或低水平表达stro-1；骨髓、脂肪、胎盘底蜕膜、真皮等组织来源的MSCs表达CD271，而脐带血、脐带、胎盘绒毛膜、外周血等组织来源MSCs阴性表达CD271，但在神经分化功能方面并没有充分证据证明不同组织来源的MSCs之间存在差异。申请人比较了羊水、脐带、羊膜、脂肪组织来源的MSCs，采用本试剂盒诱导nestin+神经上皮预诱导细胞，其nestin蛋白表达阳性率、细胞得率两个方面没有显著差异。因此，有理由相信，通过nestin+神经上皮预诱导细胞阶段，诱导MSCs体外制备SCs是可行的。另外，目前国内除脐带血库之外，最普遍存储的围产期MSCs是脐带MSCs。一根10cm脐带，体外制备P2代MSCs，得率平均为1.34±1.10×109，体外制备SCs，其收率大约为5.65×1010，完全满足建立基于SCs再生修复医学的库级产业化制备的需求。因此，本发明所述的MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒是一款使用方便、无血清等动物源成分的、高效制备GFAP+SCs的试剂盒。本发明所述的MSCs来源的雪旺细胞制备方法是一种用方便、高效制备GFAP+SCs的方法。

Claims (7)

1.一种MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒，其特征在于，包括SCs无血清基础培养基、SCs培养添加剂1、SCs培养添加剂2及SCs培养表面包被液，其中，
所述SCs无血清基础培养基为含有B27，无动物源成分血清替代品，人二氢睾丸酮，L-谷氨酰胺的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂1为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子、全反式维甲酸的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂2为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、毛喉素、重组人血小板来源生长因子AA、重组人神经胶质细胞生长因子-2的DMEM/F12；
所述SCs培养表面包被液为含有重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1的DMEM/F12。
2.根据权利要求1所述的一种MSCs来源的雪旺细胞制备试剂盒，其特征在于，
所述SCs无血清基础培养基为含有1×B27，10%无动物源成分血清替代品，5nM人二氢睾丸酮，2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂1为含有1 ug /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子、1 ug /mL重组人表皮生长因子、2ug/ml 全反式维甲酸的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂2为含有0.5 ug/mL 重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5mM毛喉素、250 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA、2.5ug/mL重组人神经胶质细胞生长因子-2的DMEM/F12；
所述SCs培养表面包被液为含有100ng/mL重组人层黏连蛋白、100ng/mL重组人纤黏连蛋白、1ug/mL 重组人调蛋白-β1的DMEM/F12。
3.一种MSCs来源的雪旺细胞制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.用SCs培养表面包被液包被培养表面；
S2.P2代的MSCs以MSCs培养基培养至60-70%汇合；
S3.换含SCs培养添加剂1的SCs无血清基础培养基，培养至80-90%汇合，用胰蛋白酶溶液消化收获细胞，记为神经上皮预诱导细胞；
S4.以含SCs培养添加剂2的SCs无血清基础培养基重悬神经上皮预诱导细胞，接种至被SCs培养表面包被液包被的培养表面，培养至60-80%汇合时传代，记为P0代SCs；
其中，
所述SCs无血清基础培养基为含有B27，无动物源成分血清替代品，人二氢睾丸酮，L-谷氨酰胺的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂1为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子、全反式维甲酸的DMEM/F12；
所述SCs培养添加剂2为含有重组人碱性成纤维细胞生长因子、毛喉素、重组人血小板来源生长因子AA、重组人神经胶质细胞生长因子-2的DMEM/F12；
所述SCs培养表面包被液为含有重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1的DMEM/F12。
4.根据权利要求3所述的一种MSCs来源的雪旺细胞制备方法，其特征在于，
所述含SCs培养添加剂1的SCs无血清基础培养基中SCs培养添加剂1含量为2%；
所述含SCs培养添加剂2的SCs无血清基础培养基中SCs培养添加剂2的含量为2%。
5.根据权利要求3所述的一种MSCs来源的雪旺细胞制备方法，其特征在于，所述步骤S4后还包括如下步骤：将P0代SCs按常规贴壁细胞传代方法传代，收获P1代细胞。
6.根据权利要求5所述的一种MSCs来源的雪旺细胞制备方法，其特征在于，所述常规贴壁细胞传代方法传代过程中的接种密度为2×104/cm2，培养体系为含2%SCs培养添加剂2的SCs无血清基础培养基；培养表面为经SCs培养表面包被液包被的培养表面。
7.根据权利要求3所述的一种MSCs来源的雪旺细胞制备方法，其特征在于，所述MSCs来源于人脐带、羊膜、羊水、胎盘、脐带血、宫膜、牙髓、骨髓、皮肤、骨骼肌组织。
CN201710728042.0A 2017-08-23 2017-08-23 MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒 Active CN107384862B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710728042.0A CN107384862B (zh) 2017-08-23 2017-08-23 MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710728042.0A CN107384862B (zh) 2017-08-23 2017-08-23 MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107384862A CN107384862A (zh) 2017-11-24
CN107384862B true CN107384862B (zh) 2020-08-04

Family

ID=60354166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710728042.0A Active CN107384862B (zh) 2017-08-23 2017-08-23 MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107384862B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108410794B (zh) * 2018-03-06 2020-12-25 无锡市人民医院 一种培养贴壁细胞用无血清培养基及其应用
CN113388577A (zh) * 2021-06-21 2021-09-14 香港再生医学有限公司 一种msc分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007142651A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 Caritas St. Elizabeth Medical Center Of Boston, Inc. Methods and compositions for the treatment of neuropathy
CN102191217A (zh) * 2010-03-12 2011-09-21 上海市第一人民医院 一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法
CN103041450A (zh) * 2013-01-25 2013-04-17 南通大学 用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法
KR20160086170A (ko) * 2015-01-09 2016-07-19 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 슈반 세포의 분화 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007142651A1 (en) * 2006-06-09 2007-12-13 Caritas St. Elizabeth Medical Center Of Boston, Inc. Methods and compositions for the treatment of neuropathy
CN102191217A (zh) * 2010-03-12 2011-09-21 上海市第一人民医院 一种诱导脐带间充质干细胞分化为类神经细胞的方法
CN103041450A (zh) * 2013-01-25 2013-04-17 南通大学 用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法
KR20160086170A (ko) * 2015-01-09 2016-07-19 이화여자대학교 산학협력단 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 슈반 세포의 분화 방법

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Neural differentiation of novel multipotent progenitor cells from cryopreserved human umbilical cord blood;Lee MW等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20070629;第358卷(第2期);全文 *
Proteomic analysis of mesenchymal to Schwann cell transdifferentiation;Sharma AD等;《Journal of Proteomics》;20170808;第165卷;全文 *
Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells;Mari Dezawa等;《European Journal of Neuroscience banner》;20011220;第14卷;全文 *
Transdifferentiation of mesenchymal stem cells into Schwann cell-like myelinating cells;Gerburg Keilhoff等;《European Journal of Cell Biology》;20160111;第85卷(第1期);全文 *
二氢睾酮联合骨髓间充质干细胞对小鼠外伤性脑损伤后BDNF及GDNF表达的影响;金涛等;《牡丹江医学院学报》;20160415;第37卷(第2期);第3页左栏第1-2段 *
大鼠脂肪干细胞源性神经球分化为雪旺细胞样细胞;许勇峰等;《南京医科大学学报》;20110715;第31卷(第7期);全文 *
李永明等.脐血源性神经球分化为类雪旺细胞的研究.《中华神经医学杂志》.2010,第9卷(第9期), *
脐血源性神经球分化为类雪旺细胞的研究;李永明等;《中华神经医学杂志》;20101012;第9卷(第9期);第884页，细胞培养和分化 *
脐血间充质干细胞诱导分化为类雪旺细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究;王玺等;《中国修复重建外科杂志》;20150127;第29卷(第2期);全文 *
骨髓间充质干细胞向雪旺细胞诱导分化方法的研究进展;李爽等;《国际生物医学工程杂志》;20111123;第34卷(第4期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107384862A (zh) 2017-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100871984B1 (ko) 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제
US20080124701A1 (en) Growth of neural precursor cells using umbilical cord blood serum and a process for the preparation for therapeutic purposes
CN104726406B (zh) 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法
KR20100065338A (ko) 인간 또는 동물 배아에서 중간엽 줄기세포를 추출 및 그 분비물을 추출하는 방법
CN110898078B (zh) 一种间充质干细胞分泌因子的制备及应用
CN105683359B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为肝细胞的方法
US20050059152A1 (en) In vitro culture of mesenchymal stem cells (MSC) and a process for the preparation thereof for therapeutic use
TW201311145A (zh) 臍帶組織及其衍生細胞之儲存、培養及應用
CN107164326B (zh) 一种3D培养自体脂肪MSCs来源的神经前体细胞的方法
CN110179826B (zh) 人脐带间充质干细胞来源干细胞因子微囊泡制剂及制备方法
CN110974944B (zh) 间充质干细胞复合活性因子冻干粉及其制备方法和应用
CN105705632B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为软骨细胞的方法
CN113151149A (zh) 一种经济简便诱导肺类器官的方法及实验模型的建立
CN107384862B (zh) MSCs来源的雪旺细胞的制备方法及试剂盒
CN102021143B (zh) 一种提高间充质干细胞迁移能力的预处理方法
CN102146359A (zh) 从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法
CN107513519B (zh) 一种雪旺细胞的培养方法
WO2019210887A2 (zh) 一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用
KR101592401B1 (ko) 지방-유래 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포
CN107164325B (zh) MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒
CN105705631B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为造骨细胞的方法
CN105683358B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为脂肪细胞的方法
CN110484491B (zh) 羊膜和羊水来源的内皮祖细胞获取方法及其纯化培养方法
CN107365743B (zh) 一种少突胶质前体细胞的培养方法
KR101982835B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 췌장의 베타세포로 분화시키는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Chen Ge

Inventor after: Yuan Chunhui

Inventor before: Zhang Hongdian

Inventor before: Yuan Chunhui

CB03 Change of inventor or designer information