CN113388577A - 一种msc分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统，S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备；S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞；S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞。其中，使用经过玻连蛋白和重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用特殊的无动物源性外周神经诱导培养基、无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基及无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基，工艺整体优化，培养基化学成分明确，在培养基的质量控制和终产品的质量控制上有明显优势，工艺整体可做到无动物源性，避免了动物源性致病因子污染风险，适用于大的表面面积的细胞培养器皿，加大了每个批次的雪旺氏细胞产量，有利工业化生产。

Description

一种MSC分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种MSC分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统。
背景技术
雪旺氏细胞(Schwann cells，以下简称SC)是一种具有促进神经再生能力的细胞，在疾病治疗、科学研究等领域有巨大应用潜力，疾病治疗和药物研发都需要大量高纯度的SC。SC的现有获得方法主要分为两种：组织提取法和干细胞分化法。组织提取法通过提取健康供者的外周神经组织，提取其中的SC，再通过体外培养获得足够数量的SC用于治疗。干细胞分化发通过体外分化手段，将间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)、胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)或诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)分化为SC。然而，组织提取法无可避免会对供者的外周神经系统造成损伤，并且获得的SC数量有限、有批次间差异，难以广泛应用到临床。另一方面，现有的体外分化方法大多工艺不成熟、使用化学成分不完全明确的培养基，对培养基关键成分的浓度也未有深入研究，所得到的SC批次间质量差异较大，不利工业生产，限制了SC细胞的应用。分化过程所使用的试剂和物料包含了牛血清白蛋白、鼠源细胞分泌物(基质胶，Matrigel)等大量的动物源性物料。因上述情况，以现有干细胞分化法制备得到的SC，和工业规模生产和实际临床应用仍有较大的距离。另一方面，ESC本身的获得需要消耗胚胎组织，有一定的道德争议。此外，现有技术多用于科学研究，未尝试摸索SC大量生产的方法，未能满足工业生产和治疗应用的需求。
综上，目前SC的获得途径有限，制备工艺步骤欠成熟，使用化学成分不完全明确、含动物源性成分的试剂和培养基，所得到的SC批次间质量差距较大，制备成本高、产量低，局限了其应用，亟需一种制备过程简化、制备时间短、成本低、污染风险小、产量和纯度高、利于工业化生产的分化方法和培养基。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种MSC分化为雪旺氏细胞的方法及培养基和系统，S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备；S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞；S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞。其中，使用经过玻连蛋白和重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用特殊的无动物源性外周神经诱导培养基、无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基及无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基。
本发明提供一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的方法，包括如下步骤：
S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备，具体包括以下步骤：
(a)分离间充质干细胞，原代培养；
(b)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(c)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
(d)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞，获得的神经前体细胞将进一步分化为雪旺氏细胞；所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。
S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞，具体包括以下步骤：
(e)诱导多能干细胞的培养；
包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；
(f)诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞；
将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01进行培养，更换培养基，培养8～10天，对诱导多能干细胞分化后得到的外周神经干细胞进行处理，收集外周神经干细胞。
(g)外周神经干细胞进一步分化为外周神经元细胞；
将外周神经干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养10～12天后对外周神经元细胞进行分析，检测其纯度和产量。所得到的外周神经元细胞辅助间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞。
S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞；
将所述步骤S1获得的神经前体细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01培养8～10天后，收集细胞，接种到经过重组层粘连蛋白处理，并且已经接种有步骤S2获得的诱导多能干细胞来源的外周神经元的培养器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02培养12～15天，处理并收集雪旺氏细胞进行第一轮分析，再在无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基培养后进行第二轮分析。
进一步的，所述无动物源性外周神经诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、全反式维生素A酸、Y27632；所述无动物源性外周神经诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、Y27632、5-氟-2’-脱氧尿苷。
进一步的，所述无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、全反式维生素A酸；所述无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、神经生长因子。
进一步的，所述无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子。
本发明还提供一种无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基，包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、全反式维生素A酸。
进一步的，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述重组人源神经调节蛋白-1beta的浓度为50～250ng/mL；所述重组人源碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述重组人源血小板衍生生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述全反式维生素A酸的浓度为0.5～5ng/mL。
本发明还提供一种无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基，包括以下成分：神经元培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、神经生长因子。
进一步的，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述重组人源神经调节蛋白-1beta的浓度为20～100ng/mL；所述重组人源碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述重组人源血小板衍生生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述神经生长因子的浓度为2～20ng/mL。
本发明还提供一种无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基，包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、全反式维生素A酸。
进一步的，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述重组人源神经调节蛋白-1beta的浓度为5～50ng/mL；所述重组人源碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.5～10ng/mL。
本发明还提供一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的的系统，包括以下组分：
(1)玻连蛋白处理的细胞培养器皿；
(2)重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿；
(3)所述的无动物源性外周神经诱导培养基-01和无动物源性外周神经诱导培养基-02；
(4)所述的无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01和无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02；
(5)所述的雪旺氏细胞扩增培养基。
进一步的，所述重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿的表面面积为9.5～75cm2。75cm2的大器皿可以实现大体积量的雪旺氏细胞制备，有利于工业化生产。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明的方法改良试剂组合，培养基配方可做到化学成分明确，成功摸索关键试剂的浓度范围，在每个批次的培养基进行配制时，可对所有原材料进行控制，并减少因培养基成分不明或试剂浓度不确定确带来的终产品质量波动，在培养基的质量控制和终产品的质量控制上有明显优势，并改良了培养方法，上述改进使雪旺氏细胞的制备工艺得到整体优化，有利于工业化生产。
2.本发明的方法以非动物源性物料完全取代牛源性、鼠源性物料，开发了“无动物源性培养体系”，减少动物病原体污染等风险。其中，现有技术往往使用B27这个血清替代物，但B27其实仍含有动物源性，并且其各个原料浓度是不公开的，不利质量控制。上述改进有利包括临床治疗在内的各类应用。
3.本发明的方法对细胞接种密度、培养用器皿的大小、培养基使用量等条件进行了摸索，有利于雪旺氏细胞大量生产，满足工业生产和治疗应用的需求。
4.本发明的方法获得的雪旺氏细胞纯度高，可收获纯度大于90％的雪旺氏细胞。
5.本发明的方法可以缩短分化为雪旺氏细胞的时间，可在最短20天内从间充质干细胞分化出纯度≥90％的雪旺氏细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为各个培养基配方对NPC进行分化后，SC的纯度。注：Control采取25个NPC团块/cm2的密度接种。
图2为各个培养基配方对NPC进行分化后，SC的产量。注：Control采取25个NPC团块/cm2的密度接种。＄：SCiM-01+02产量对比Control，P≤0.05，有统计学意义。§：同培养基，对比接种密度0.5×104，P≤0.05，有统计学意义。§§：同培养基，对比接种密度0.5×104以及1.0×104，P≤0.05，有统计学意义。
图3为SCeM-01AF对SC进行扩增培养后，SC的纯度。※：SCiM-01+02纯度对比Control，P≤0.05，有统计学意义。
图4为SCeM-01AF对SC进行扩增培养后，SC的产量。＄：SCiM-01+02产量对比Control，P≤0.05，有统计学意义。§：同培养基，对比接种密度0.5×104，P≤0.05，有统计学意义。§§：同培养基，对比接种密度0.5×104以及1.0×104，P≤0.05，有统计学意义。
图5为SCeM-01AF对SC在不同表面面积培养皿进行扩增培养后，SC的纯度。
图6为SCeM-01AF对SC在不同表面面积培养皿进行扩增培养后，SC的产量。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明的方法具体包括以下几个步骤：
S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备
(a)分离间充质干细胞，原代培养；
(b)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(c)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
(d)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞，获得的神经前体细胞将进一步分化为雪旺氏细胞；所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。
S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞
(e)诱导多能干细胞(iPSC)的培养
将iPSC以1.0～2.5×104个/cm2的密度接种在经过玻连蛋白(Vitronectin，Vc，无动物源性，代替鼠源性的基质胶Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用Essential 8培养基(E8)进行原代培养，每隔24小时更换培养基，3～4天后、iPSC融合度达到60～80％时以胰酶替代物(TrypLE)或EDTA(浓度为0.5mM)对iPSC进行处理，收集iPSC后进行传代培养，传代时同样以1.0～2.5×104个/cm2的密度接种在经过玻连蛋白处理的细胞培养皿。
(f)诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞(NP)
将iPSC以1.0～4.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Laminin，Lm，无动物源性，代替鼠源性的基质胶Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01(pNiM-01AF)进行培养，每隔36～48小时更换培养基，在培养8～10天后以TrypLE对iPSC分化后得到的NP进行处理，收集到的NP用于下一步iPN分化。
(g)外周神经元细胞(iPN)的制备
将外周神经干细胞(NP)以0.5～3.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm，无动物源性，代替鼠源性的Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02(pNiM-02AF)进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养10～12天后对外周神经元细胞(iPN)进行分析，检测其纯度和产量。
S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞
将间充质干细胞来源神经前体细胞(NPC)以25个NPC团块/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm)处理的细胞培器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01(SCiM-01AF)进行培养8～10天后，以胰酶替代物处理并收集细胞，以0.5～1.5×104个细胞/cm2的密度接种到经过重组层粘连蛋白(Lm)处理，并且已经接种有iPSC来源外周神经元的培养器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02(SCiM-02AF)进行培养12～15天，再以胰酶替代物处理并收集雪旺氏细胞进行第一轮分析，再在无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基(SCeM-01AF)培养后进行第二轮分析。
S4：间充质干细胞来源雪旺氏细胞的大规模制备
将步骤S3的雪旺氏细胞以0.5～1.5×104个细胞/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm)处理的细胞培器皿(大小分别为9.5cm2、25cm2、75cm2)，以无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基(SCeM-01AF)进行培养5～7天，最后以胰酶替代物处理并收集雪旺氏细胞。检测雪旺氏细胞纯度和产量，对表面面积(大小)各异的培养器皿生产雪旺氏细胞的能力进行测试。
实施例1间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备
(1)分离间充质干细胞(MSC)，原代培养；
(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；所述无血清成分的细胞培养基的配方如表1所示。
其中，经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)和未经促进细胞贴壁处理(NonTc-Treated，简称nTCT)细胞培养基质如细胞培养皿和细胞培养板等，都以聚苯乙烯制成，最大分别是TCT基质表面经过气体等离子(Gas Plasma)处理。
表1无血清培养基配方
Figure BDA0003124727990000111
(4)用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，收获神经前体细胞，获得的神经前体细胞将进一步分化为雪旺氏细胞。
实施例2诱导多能干细胞(iPSC)分化为外周神经元细胞
(1)iPSC的培养
将iPSC以1.5×104个/cm2的密度接种在经过玻连蛋白(Vc)处理的细胞培养器皿(实施例培养皿：6孔板)，使用E8进行培养(实施例用量：6孔板每孔2mL)，每隔24小时更换培养基，3～4天后、iPSC融合度达到60～80％时以EDTA(0.5mM)对iPSC进行处理(EDTA处理时间范围：3～8分钟，实施例处理时间：5分钟)，收集iPSC后进行传代，传代时同样以1.5×104个/cm2的密度接种在经过Vc处理的细胞培养皿。
(2)iPSC的NP分化
将iPSC以2.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm)处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01
(pNiM-01AF)进行培养(实施例用量：6孔板每孔2mL)，pNiM-01AF的配方见表2，在序号为1的DMEM/F12基础培养基中添加序号2～23的组分，在培养8～10天后以胰酶替代物对iPSC分化后得到的NP进行收集。
表2无动物源性外周神经诱导培养基-01(pNiM-01AF)
Figure BDA0003124727990000121
Figure BDA0003124727990000131
**：Y27632在培养的首36～48小时加入。
其中，LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、Y27632为潜在候选药物的代号。
(3)外周神经干细胞(NP)进一步分化为外周神经元细胞(iPN)
将NP以0.5～3.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm，无动物源性，代替鼠源性的Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02(pNiM-02AF)进行培养(实施例用量：6孔板每孔2mL)。pNiM-02AF的配方见表3。在序号为1的神经元培养基中添加序号2～21的组分。
表3无动物源性外周神经诱导培养基-02(pNiM-02AF)
Figure BDA0003124727990000132
Figure BDA0003124727990000141
*：仅在培养第1天加入。
**：仅在培养第1～3天加入。
其中，GlutaMAX是生产商的一个产品名称，为谷氨酰胺的替代物，功能上等同于谷氨酰胺，因为高浓度的谷氨酰胺长期培养可产生细胞毒性。Y27632为潜在候选药物的代号。
接种NP并以表3所示的pNiM-02AF进行为期10～12天的分化培养，期间每36～48小时更换培养基，完成后统计iPN的纯度。
实施例3间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞
将间充质干细胞来源神经前体细胞(NPC)以25个NPC团块/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm)处理的细胞培器皿，以SCiM-01AF进行培养8～10天后，以胰酶替代物处理并收集细胞，以0.5～1.5×104个细胞/cm2的密度接种到经过重组重组层粘连蛋白(Lm)处理，并且已经接种有iPSC来源外周神经元的培养器皿，以SCiM-02AF进行培养12～15天，最后以胰酶替代物处理并收集雪旺氏细胞。
SCiM-01AF和SCiM-02AF的最终配方经过优化得到，首先设计了“无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01(SCiM-01)”和“无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02(SCiM-02)”，和现有工艺进行对比(现有工艺：将间充质干细胞来源神经前体细胞(NPC)以25个NPC团块/cm2的密度接种在经过重组重组层粘连蛋白(Lm)处理的细胞培器皿，以含动物源性成分的培养基(Control)培养12～15天，不包含再接种到有iPSC来源外周神经元的培养器皿这一步骤)。具体培养基配方如下表4～6。
表4现有含动物源性成分培养基(Control)
Figure BDA0003124727990000151
*：动物源性。
表5无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01(SCiM-01)
Figure BDA0003124727990000152
Figure BDA0003124727990000161
表6无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02(SCiM-02)
Figure BDA0003124727990000162
为验证SCiM-01和02的配合对比Control诱导NPC分化为SC的效力，按照下列表4接种NPC并以表SCiM-01和Control培养基分别进行为期8～10天的分化培养，期间每36～48小时更换培养基。8～10天后培养完成后，Control组收集细胞进入下一步，SCiM-01组收集细胞继续接种到含有iPSC来源外周神经元细胞的体系，并以SCiM-02继续培养10～15天再收集细胞，此时“SCiM-01+02”和Control分别统计SC纯度和产量后(表7)，进入下一步。
“SCiM-01+02”和Control组收集细胞后，分别以接种在经过重组Laminin(Lm)处理的细胞培器皿，以SC扩增培养基“SCeM-01AF”(表8)培养5～7天后，对SC的纯度和产量进行分析(表9)。
表7各个培养基配方的NPC向SC分化结果
Figure BDA0003124727990000171
注：SC纯度通过统计Schwann cell标志物p75的阳性百分比以及细胞形态是否符合要求计算。
＄：SCiM-01+02产量对比Control，P≤0.05，有统计学意义。
§：同培养基，对比接种密度0.5×104，P≤0.05，有统计学意义。
§§：同培养基，对比接种密度0.5×104以及1.0×104，P≤0.05，有统计学意义。
通过表7数据得到结论，分别以0.5×104个/cm2、1.0×104个/cm2和1.5×104/cm2的密度接种，通过“SCiM-01+02”培养获得SC，其纯度均≥85％，纯度趋势高于Control，产量在0.5×104个/cm2、1.0×104个/cm2和1.5×104/cm2的接种密度均显著高于Control(图1、图2)。综上所述，“无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01”和“无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02”分别命名为SCiM-01AF和SCiM-02AF。
鉴于SCiM-02AF接种时密度为1.0×104个/cm2和1.5×104/cm2所收获SC数量高于0.5×104个/cm2，而从1.0×104个/cm2到1.5×104/cm2这两个密度之间SC收获量相对上升值，相对从1.0×104个/cm2到1.5×104/cm2的SC收获量相对上升值为低，故选择1.0×104个/cm2为最优选密度。
表8无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基(SCeM-01AF)
Figure BDA0003124727990000172
Figure BDA0003124727990000181
表9 SCeM-01AF培养后SC纯度和产量
Figure BDA0003124727990000182
注：SC纯度通过统计Schwann cell标志物p75的阳性百分比以及细胞形态是否符合要求计算。
※：SCiM-01+02纯度对比Control，P≤0.05，有统计学意义。
＄：SCiM-01+02产量对比Control，P≤0.05，有统计学意义。
§：同培养基，对比接种密度0.5×104，P≤0.05，有统计学意义。
§§：同培养基，对比接种密度0.5×104以及1.0×104，P≤0.05，有统计学意义。
通过表9数据得到结论，通过“SCiM-01+02”得到，并以0.5×104个/cm2、1.0×104个/cm2和1.5×104/cm2的接种密度在SCeM-01AF培养5～7天的SC，其纯度均≥90％，并且纯度和产量显著高于Control(图3、图4)。鉴于在使用SCeM-01AF培养时，接种密度1.5×104/cm2的产量最高，选择1.5×104/cm2为最优选密度。
实施例4间充质干细胞来源SC的大规模制备
将SCiM-02AF培养后收获的SC以1.5×104/cm2的密度接种在经过重组Laminin(Lm)处理的、表面面积各异的细胞培器皿，以SCeM-01AF进行培养，详见表10。
表10不同表面面积培养器皿SC产量
Figure BDA0003124727990000191
通过表10数据得到结论，在9.5、25和75cm2三种表面面积，使用SCeM-01AF对SC进行培养均可收获纯度≥90％的SC(图5)，而表面面积大小对神经干细胞产量并无显著影响(图6)。
本发明的方法培养体系以玻连蛋白和重组层粘连蛋白取代基质胶对培养器皿进行处理，首先在培养器皿层面避免了动物源性物料。
使用“SCiM-01AF+02AF”，首先通过50个NPC/cm2，再在0.5×104个/cm2、1.0×104个/cm2和1.5×104/cm2的接种密度接种到外周神经元，都可以收获纯度≥85％的雪旺氏细胞。鉴于SCiM-02AF接种时密度为1.0×104个/cm2和1.5×104/cm2所收获SC数量高于0.5×104个/cm2，而1.0×104个/cm2和1.5×104/cm2这两个密度之间SC收获量并无显著分别，选择1.0×104个/cm2为最优选密度。
对比Control，使用“SCiM-01AF+02AF”可显著增加雪旺氏细胞的产量。
使用“SCiM-01AF+02AF”将NPC分化为SC，再以“SCeM-01AF”对接种密度为1.5×104/cm2，接种在6孔板(每孔表面面积9.5cm2)、25cm2培养皿和75cm2培养皿的SC进行扩增培养，均可收获纯度≥90％的SC，结果显示“SCeM-01AF”从较小(9.5cm2)至较大(75cm2)表面面积的细胞培养器皿，均可维持SC纯度≥90％的扩增。
“SCiM-01AF+02AF”和“SCeM-01AF”完全避免了动物源性、并且培养基配方化学成分明确，适合临床治疗或研究用雪旺氏细胞的制备。
综合以上实施例，本发明相对于现有技术具有明显的优势和进步：
(1)MSC分化为雪旺氏细胞工艺优化
本发明通过使用“SCiM-01AF”、“SCiM-02AF”和“SCeM-01AF”培养基配方，不但可制备高纯度雪旺氏细胞，更显著提升了绝对产量和缩小了批次间产量的差异，有利工业化生产。
(2)培养基配方化学成分明确
一些现有雪旺氏细胞制备法使用血清或化学成分不明确的添加物，但本发明的培养基配方“SCiM-01AF”、“SCiM-02AF”和“SCeM-01AF”所有化学成分明确，在每个批次的培养基进行配制时，可对所有原材料进行控制，在培养基的质量控制上有明显优势。
(3)工艺整体无动物源性
一些现有雪旺氏细胞制备法使用牛源性血清、鼠源细胞分泌物(Matrigel)等，引入动物源性致病因子污染风险，本发明的方法可做到全流程无动物源性，相当程度上避免了动物源性致病因子污染风险。
(4)可在较大培养器皿实施雪旺氏细胞制备
经验证，本发明方案的适用范围涵盖从较小(9.5cm2)至较大(75cm2)表面面积的细胞培养器皿，加大了每个批次的雪旺氏细胞产量，有利工业化生产，这是本发明的重要进步，因为目前现有技术中并无大体积量制备雪旺氏细胞且能达到很高纯度和产量的先例。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：间充质干细胞的培养和神经前体细胞制备，具体包括以下步骤：
(a)分离间充质干细胞，原代培养；
(b)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
(c)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
(d)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞，获得的神经前体细胞将进一步分化为雪旺氏细胞；所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。
S2：诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞，具体包括以下步骤：
(e)诱导多能干细胞的培养；
包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；
(f)诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞；
将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01进行培养，更换培养基，培养8～10天，对诱导多能干细胞分化后得到的外周神经干细胞进行处理，收集外周神经干细胞。
(g)外周神经干细胞进一步分化为外周神经元细胞；
将外周神经干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养10～12天后对外周神经元细胞进行分析，检测其纯度和产量。所得到的外周神经元细胞辅助间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞。
S3：间充质干细胞来源的神经前体细胞分化为雪旺氏细胞；
将所述步骤S1获得的神经前体细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01培养8～10天后，收集细胞，接种到经过重组层粘连蛋白处理，并且已经接种有步骤S2获得的诱导多能干细胞来源的外周神经元的培养器皿，以无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02培养12～15天，处理并收集雪旺氏细胞进行第一轮分析，再在无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基培养后进行第二轮分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物源性外周神经诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、全反式维生素A酸、Y27632；所述无动物源性外周神经诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、Y27632、5-氟-2’-脱氧尿苷。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、全反式维生素A酸；所述无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、神经生长因子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子。
5.一种无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基，其特征在于，包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、全反式维生素A酸。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述重组人源神经调节蛋白-1beta的浓度为50～250ng/mL；所述重组人源碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述重组人源血小板衍生生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述全反式维生素A酸的浓度为0.5～5ng/mL。
7.一种无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基，其特征在于，包括以下成分：神经元培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、神经生长因子。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述重组人源神经调节蛋白-1beta的浓度为20～100ng/mL；所述重组人源碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述重组人源血小板衍生生长因子的浓度为2～20ng/mL；所述神经生长因子的浓度为2～20ng/mL。
9.一种无动物源性雪旺氏细胞扩增培养基，其特征在于，包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、重组人源神经调节蛋白-1beta、重组人源碱性成纤维细胞生长因子、重组人源血小板衍生生长因子、全反式维生素A酸。
10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述重组人源神经调节蛋白-1beta的浓度为5～50ng/mL；所述重组人源碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.5～10ng/mL。
11.一种间充质干细胞分化为雪旺氏细胞的的系统，其特征在于，包括以下组分：
(1)玻连蛋白处理的细胞培养器皿；
(2)重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿；
(3)权利要求2所述的无动物源性外周神经诱导培养基-01和无动物源性外周神经诱导培养基-02；
(4)权利要求3所述的无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-01和无动物源性雪旺氏细胞诱导培养基-02；
(5)权利要求4所述的雪旺氏细胞扩增培养基。
12.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿的表面面积为9.5～75cm2。
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