CN107513519A - 一种雪旺细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种雪旺细胞的培养方法，包括如下步骤：S1.脐带血单个核细胞经MSCs培养基培养得到P1代脐带血MSCs；S2.P1代脐带血MSCs经神经球培养基培养收获P3代神经球；S3.P3代神经球经雪旺细胞培养基培养得到雪旺细胞。本发明的有益效果：本发明所述的雪旺细胞的培养方法，是经过nestin+神经球阶段的培养脐带血MSCs来源的雪旺细胞的方法。采用P1代脐带血MSCs诱导神经球形成，神经球形成率高达41%。本发明还提供了具体的神经球培养基，足以诱导脐带血MSCs形成nestin+神经球；提供了具体的nestin+神经前体细胞向雪旺细胞分化得培养方案，能显著促进nestin+神经前体细胞贴壁和迁移，防止细胞增殖过程中成团和多层生长。

Description

一种雪旺细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种雪旺细胞的培养方法。
背景技术
雪旺细胞（schwann cells,Scs）是周围神经系统的胶质细胞，具有多种生理功能。当周围神经损伤时，雪旺细胞发生形态行为学的改变，分泌生长因子，构建轴突生长微环境，引导轴突再生。早在1995年，Gulati等就发现移植雪旺细胞和支架成分能促进轴突再生，但需要足量的雪旺细胞提供神经营养物质和趋化因子。雪旺细胞或雪旺细胞为基础的组织工程产品在神经损伤修复、神经退行性疾病方面的应用受到重视。1905年-1995年这90年间很多科研人员在研究如何获得满足移植数量的雪旺细胞，验证了手术采集雪旺细胞、神经组织中分离雪旺细胞以及体外培养雪旺细胞的方法。但成体雪旺细胞采集需要手术采集神经周围组织甚至神经组织，样本来源经常是胎儿、尸体，因导致二次损伤自体样本采集极其受限。干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的未分化细胞，干细胞与再生医学的研究为雪旺细胞样本资源提供了新的思路和希望。胚胎干细胞作为多能干细胞的代表，是最早研究用于体外制备雪旺细胞的干细胞，胚胎干细胞体外经过拟胚体-神经球-雪旺细胞的分化体系已经成熟。但随后的研究发现，胚胎干细胞在分化过程中的胚性残留以及分化方向的多样化导致体内移植成瘤性和雪旺细胞纯度不高。因此还有研究人员试图从成体干细胞的分化途径中找到制备雪旺细胞的方法，并取得了成功。既往的研究表明，脂肪、骨髓、羊水间充质干细胞（mesenchymal stem cells）等中胚层起源的干细胞具有成神经分化潜能，通过多种生物活性分子和化学物质分步诱导，能产生雪旺细胞。但这几个组织样本需有创采集，采集量也有一定的限制。
针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种雪旺细胞的培养方法，符合雪旺细胞的发育规律，同时满足样本来源广泛、雪旺细胞纯度高的要求，很适于临床研究和使用。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种雪旺细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1.脐带血单个核细胞经MSCs培养基培养得到P1代脐带血MSCs；
S2.P1代脐带血MSCs经神经球培养基培养收获P3代神经球；
S3. P3代神经球经雪旺细胞培养基培养得到雪旺细胞。
进一步地，所述神经球培养基为包含以下物质的神经培养基：
0.5 mM L-谷氨酰胺；
2% B-27™ 添加剂；
20ng /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子；
20ng /mL重组人表皮生长因子。
进一步地，所述雪旺细胞培养基为包含以下物质的神经培养基：
0.5 mM L-谷氨酰胺；
2% B-27™ 添加剂；
10%无动物源成分血清替代品；
5nM人二氢睾丸酮；
10ng/mL rh b-FGF；
10uM毛喉素；
5 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA；
50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。
进一步地，所述步骤S1进一步包括如下步骤：脐带血单个核细胞经洗涤重悬，铺至淋巴细胞分离液上，离心后取中间云雾层；以MSCs培养基重悬细胞，隔天换液，至70-80%汇合时收获；收获时先加入胰蛋白酶溶液消化，再加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物以细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代脐带血MSCs；P0代脐带血MSCs以MSCs培养基重悬培养至70-80%汇合时收获P1代脐带血MSCs。
进一步地，所述步骤S2中，培养神经球所使用的培养器皿为细菌培养皿。
进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以神经球培养基重悬P1代脐带血MSCs，接种至细菌培养皿中，37°C ，5% CO2，饱和湿度条件下培养；隔天添加新的神经球培养基，连续培养7天，传代培养。收获P3代神经球。
进一步地，所述传代培养具体包括如下步骤：传代时，轻轻吹打培养液，离心，以神经球培养基重悬沉淀，轻轻吹打，使得神经球成3-5个细胞的细胞团或单个细胞，按1：5分盘传代培养。
进一步地，所述步骤S3中，培养雪旺细胞所使用的培养器皿为重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白和重组人调蛋白-β1包被的组织培养瓶。
进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以雪旺细胞培养基悬浮P3代神经球，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白和重组人调蛋白-β1包被的组织培养瓶中，隔天换液，至60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，室温消化5分钟后终止消化，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代UCB来源的雪旺细胞，P0代雪旺细胞传代培养1次
本发明的有益效果：本发明所述的雪旺细胞的培养方法，是经过nestin+神经球阶段的培养脐带血MSCs来源的雪旺细胞的方法。本发明所述的雪旺细胞的培养方法，采用P1代脐带血MSCs诱导神经球形成，神经球形成率高达41%。本发明还提供了具体的神经球培养基，足以诱导脐带血MSCs形成nestin+神经球；提供了具体的nestin+神经前体细胞向雪旺细胞分化得培养方案，能显著促进nestin+神经前体细胞贴壁和迁移，防止细胞增殖过程中成团和多层生长，而既往诱导MSCs分化成雪旺细胞或诱导神经前体细胞分化成雪旺细胞的培养方案比较复杂，经常包括β-巯基乙醇、全反式维甲酸、bFGF、PDGF-AA，heregulin-1和forskolin等多种化学或生物活性成分，此外，申请人还发现，在神经培养基中添加低浓度的人二氢睾丸酮能促进神经前体细胞向雪旺细胞分化，神经胶质细胞来源的生长因子能提高雪旺细胞产率和纯度。
附图说明
图1是脐带血单个核细胞接种培养开始时的形态图；
图2是脐带血单个核细胞经MSCs培养基培养第3天时的形态图；
图3是脐带血单个核细胞经MSCs培养基培养第7天时的形态图；
图4是脐带血单个核细胞经MSCs培养基培养第9天时的形态图；
图5是脐带血单个核细胞培养得到P1代脐带血MSCs时的形态图；
图6是P1代脐带血MSCs经神经球培养基培养至第7天时神经球的形态图；
图7是P3代神经球高表达nestin的形态图；
图8是P3代神经球低表达GFAP的形态图；
图9是雪旺细胞培养基诱导神经球细胞分化的形态图；
图10是 P1代雪旺细胞高表达GFAP的形态图；
图11是P1代雪旺细胞低表达nestin的形态图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，实施例中所涉及的各种试剂和实验器械未经特殊说明均可从商业途径获得。
首先，对本发明具体实施例中涉及的试剂、出现的英文及缩写进行简单的说明。
UCB:umbilical cord blood，脐带血，是新生儿胎盘、脐带中残留的血液，是产科废弃物；
单个核细胞：Mononuclear cells，MNCs；
淋巴细胞分离液：生产厂商为天津灏洋，货号为HY2015；
Ultra CULTURE：无血清培养基，生产厂商为LONZA，货号为12-725F；
Ultroser G serum substitute：血清替代物，生产厂商为PALL，货号为15950-017；
胰蛋白酶溶液：生产厂商为Biological industries，货号为T6424-1VL；
抑肽酶溶液：生产厂商为Sigma，货号为A1250000；
神经培养基：neurobasal medium，生产厂商为GIBCO，货号为2110349；
L-谷氨酰胺；生产厂商为GIBCO，货号为25030081；
B-27™ 添加剂：生产厂商为GIBCO，货号为17504-044；
重组人碱性成纤维细胞生长因子：生产厂商为GIBCO，货号为13256-029；
重组人表皮生长因子：生产厂商为GIBCO，货号为13247-051；
重组人层黏连蛋白：生产厂商为BioLamina，货号为Laminin-221；
重组人纤黏连蛋白：生产厂商为ProSpec，货号为PRO-448；
重组人调蛋白-β1：生产厂商为GenScript，货号为Z03051-10；
AccutaseTM消化液：生产厂商为Innovative Cell Technologies, Inc，货号为40506ES60；
毛喉素：生产厂商为Sigma，货号为F6886；
重组人血小板来源生长因子AA：生产厂商为Sigma，货号为SPR-3268；
重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2：生产厂商为BPS Biosciensice，货号为BPS-90255-A；
mouse anti-nestin：小鼠抗巢蛋白，生产厂商为Millipore，货号为MAB5326；
mouse anti-GFAP：小鼠抗神经胶质酸性蛋白，生产厂商为Abcam，货号为ab10062；
Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor® 647）：羊抗鼠免疫球蛋白GH&L（AlexaFluor® 647标记），生产厂商为Abcam，货号为ab150119。
实施例一：UCB来源培养收获MSCs
UCB来源于脐带血库冻存的UCB单个核细胞。
复苏UCB-MNCs，以生理盐水洗涤1次，以25mL生理盐水重悬细胞，小心铺到15mL淋巴细胞分离液，800g，水平离心20分钟；取中间云雾层，生理盐水洗涤2次；以MSCs培养基重悬细胞，调整细胞密度至2×105/cm2，接种至175cm2组织培养瓶（货号：EasyFlask，生产厂商：NUNC）中培养，隔天换液，至70-80%汇合时收获；收获时吸弃培养上清，生理盐水洗涤培养表面1次，加入0.25%胰蛋白酶溶液，室温消化5分钟，加入1mL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀物；以生理盐水洗涤2次，以100um尼龙细胞筛过滤，收集滤液；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代UCB-MSCs；P0代UCB-MSCs以MSCs培养基重悬，调整细胞密度为6000/cm2，接种至175cm2组织培养瓶，培养至70-80%汇合时收获P1代UCB-MSCs。
其中，所述的MSCs培养基为含2% Ultroser G serum substitute的UltraCULTURE。
实施例二：UCB-MSCs来源培养收获神经球
以神经球培养基重悬P1代UCB-MSCs，调整细胞密度至2×105/mL，接种至细菌培养皿（货号：4021，生产厂商：NUNC）中，每皿20mL，37°C ，5% CO2，饱和湿度条件下培养；隔天添加10mL新的神经球培养基，连续培养7天，传代；传代时，轻轻吹打培养液，300g离心10分钟，以神经球培养基重悬沉淀，轻轻吹打10次，使得神经球成3-5个细胞的细胞团或单个细胞，按1：5分盘传代培养；收获P3代神经球。
其中，所述神经球培养基为包含以下物质的neurobasal medium：
0.5 mM L-谷氨酰胺；
2% B-27™ 添加剂；
20ng /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子；
20ng /mL重组人表皮生长因子。
实施例三：培养收获雪旺细胞
以雪旺细胞培养基悬浮P3代神经球，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的组织培养瓶中，隔天换液，8-12天60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，加入AccutaseTM消化液1mL，室温消化5分钟，加入200uL抑肽酶溶液终止消化；400g离心，5min，弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代UCB来源的雪旺细胞。P0代雪旺细胞传代培养1次。
其中，所述雪旺细胞培养基为包含以下物质的neurobasal medium：
0.5 mM L-谷氨酰胺，
2% B-27™ 添加剂，
10%无动物源成分血清替代品，
5nM人二氢睾丸酮，
10ng/mL rh b-FGF，
10uM毛喉素，
5 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA，
50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。
实施例四：免疫组织学检测
贴壁细胞免疫组织学检测时，吸弃培养基，以PBS漂洗2次，以4％多聚甲醛（PFA）固定细胞10分钟，以PBS漂洗2次，滴加一抗，4℃过夜；PBS洗涤2次，滴加FITC标记二抗，室温孵育1小时；PBS漂洗2次，滴加1μg/ ml 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），孵育5分钟，PBS漂洗2次，镜检。
免疫组织化学检测使用抗体包括：
mouse anti-nestin；
mouse anti-GFAP；
Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor® 647）。
实施例五：实验结果
5.1UCB-MSCs培养和分析
UCB-MSCs培养的不同阶段参见图1~5。
UCB-MNCs按2×105/cm2接种培养，参见图1；
至第3天时有少量成纤维样贴壁细胞，生长缓慢，参见图2；
第7天显示出不同的细胞克隆形态，有成纤维样细胞克隆，有内皮样细胞克隆，参见图3；
第9天时70-80%汇合，参见图4；
P0代UCB-MSCs传代培养，细胞形态趋于均一，细胞生长呈现MSCs典型的漩涡状，参见图5。
5.2 UCB-MSCs来源的雪旺细胞培养和分析
雪旺细胞培养的不同阶段参见图6~11。
以神经球培养基重悬P1代UCB-MSCs，接种到低粘附的细菌培养皿中培养神经球，4-5天可以观察到小的细胞球，7天时部分神经球比较大开始贴壁，参见图6；
吹打成小细胞团或单个细胞后传代。传代的神经球生长很快，每4天可以传代1次。P3代神经球高表达nestin，参见图7，低表达GFAP，参见图8；
P3代神经球接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白、重组人调蛋白-β1包被的组织培养瓶中，很快贴壁，逐渐有双极性或多极性细胞爬出，参见图9；
P0代雪旺细胞传代培养至P1代，P1代雪旺细胞高表达GFAP，参见图10，低表达nestin，参见图11。
实施例六：结果分析
雪旺细胞是神经胶质细胞的一种，来源于神经干/祖细胞。既往的研究证明，成体神经干细胞、胚胎干细胞来源的nestin+神经前体细胞体外经诱导分化能产生雪旺细胞。但成体神经干细胞除了从流产胎儿神经组织分离外，只能从成体神经周围组织中少量手术采集，或者从尸体采集，其样本资源限制比较大。而胚胎干细胞被认为是最适于制备神经系统相关细胞的种子细胞，在体外很容易分化成nestin+神经前体细胞，并能继续分化产生雪旺细胞。但胚胎干细胞的使用受到伦理学限制，并且体外诱导分化存在胚性残留，体内移植有成瘤性。此外，胚胎干细胞几乎是最原始的干细胞，现有的分化诱导体系很难控制其定向分化。因此，近几年来，更多的科研人员试图采用成体干细胞培养雪旺细胞。研究表明，骨髓干细胞、脐带血干细胞、脂肪干细胞以及MSCs在特定的诱导体系作用下，都能分化成雪旺样细胞，具有类似于雪旺细胞的功能。但目前具有库级存储潜力的成体干细胞必然是脐带血。脐带血中包含丰富的细胞类型，经过体外操作能规模化制备脐带血来源的MSCs。本研究采用脐带血MSCs，经nestin+神经球阶段，继续诱导产生雪旺细胞，符合雪旺细胞的发育规律，同时满足样本来源广泛、雪旺细胞纯度高的要求，很适于临床研究和使用。
既往的研究表明，胚胎干细胞来源的神经球与脐带或骨髓MSCs来源的神经球相比，nestin表达率是不同的，前者更高，且雪旺细胞的诱导效率更高。因此，优化MSCs来源的雪旺细胞培养体系是其产业化转化的关键因素。我们的研究发现，脐带血MSCs的神经球分化潜能随传代次数的增加呈下降趋势，而P1代脐带血MSCs的细胞得率较高，且神经球形成率高达41%，因此本研究采用P1代脐带血MSCs诱导神经球形成。既往诱导MSCs向神经球分化采用条件培养基、血清或更复杂的化合物体系，我们的研究发现采用GIBCO公司商品化的neurobasal medium和B-27无血清添加剂补充低剂量的b-FGF和EGF足以诱导脐带血MSCs形成nestin+神经球。但必须接种到细菌培养表面，如果接种至组织培养处理的培养表面，MSCs贴壁，再诱导的话会发生随机分化。神经球是可以扩增培养的，但随着扩增代数的增加，培养的神经球均是非单克隆来源，体积变大，神经球周围细胞分化严重，因此本研究采用P3代神经球，严格控制神经球体积，避免神经球过度分化，影响雪旺细胞纯度。
nestin+神经前体细胞向雪旺细胞分化已经有许多培养方案，其中有两个关键因素：一是培养表面的包被，二是复杂的诱导培养基。既往的研究披露的包被液包括多聚赖氨酸、层黏连蛋白，我们的研究发现，层黏连蛋白对于MSCs向神经球分化，以及神经球向神经胶质细胞分化是至关重要的，但添加了纤黏连蛋白能显著促进nestin+神经前体细胞贴壁和迁移，防止细胞增殖过程中成团和多层生长，因此本研究使用的包被液包含了层黏连蛋白和纤黏连蛋白。既往诱导MSCs分化成雪旺细胞或诱导神经前体细胞分化成雪旺细胞的培养方案比较复杂，经常包括β-巯基乙醇、全反式维甲酸、bFGF、PDGF-AA，heregulin-1和forskolin等多种化学或生物活性成分。我们的研究发现，在neurobasal medium中添加低浓度的人二氢睾丸酮能促进神经前体细胞向雪旺细胞分化，神经胶质细胞来源的生长因子能提高雪旺细胞产率和纯度。因此发明证明了一种经过nestin+神经球阶段的培养脐带血MSCs来源的雪旺细胞的方法。

Claims (9)

1.一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.脐带血单个核细胞经MSCs培养基培养得到P1代脐带血MSCs；
S2.P1代脐带血MSCs经神经球培养基培养收获P3代神经球；
S3. P3代神经球经雪旺细胞培养基培养得到雪旺细胞。
2.根据权利要求1所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述神经球培养基为包含以下物质的神经培养基：
0.5 mM L-谷氨酰胺；
2% B-27™ 添加剂；
20ng /mL重组人碱性成纤维细胞生长因子；
20ng /mL重组人表皮生长因子。
3.根据权利要求1所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述雪旺细胞培养基为包含以下物质的神经培养基：
0.5 mM L-谷氨酰胺；
2% B-27™ 添加剂；
10%无动物源成分血清替代品；
5nM人二氢睾丸酮；
10ng/mL rh b-FGF；
10uM毛喉素；
5 ng/mL重组人血小板来源生长因子AA；
50ng/mL重组人神经胶质细胞来源的生长因子-2。
4.根据权利要求1所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S1进一步包括如下步骤：脐带血单个核细胞经洗涤重悬，铺至淋巴细胞分离液上，离心后取中间云雾层；以MSCs培养基重悬细胞，隔天换液，至70-80%汇合时收获；收获时先加入胰蛋白酶溶液消化，再加入抑肽酶溶液终止消化；离心弃上清，收获沉淀物；沉淀物以细胞筛过滤，收集滤液；滤液离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代脐带血MSCs；P0代脐带血MSCs以MSCs培养基重悬培养至70-80%汇合时收获P1代脐带血MSCs。
5.根据权利要求1所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，培养神经球所使用的培养器皿为细菌培养皿。
6. 根据权利要求5所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2进一步包括如下步骤：以神经球培养基重悬P1代脐带血MSCs，接种至细菌培养皿中，37°C ，5%CO2，饱和湿度条件下培养；隔天添加新的神经球培养基，连续培养7天，传代培养，收获P3代神经球。
7.根据权利要求6所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述传代培养具体包括如下步骤：传代时，轻轻吹打培养液，离心，以神经球培养基重悬沉淀，轻轻吹打，使得神经球成3-5个细胞的细胞团或单个细胞，按1：5分盘传代培养。
8.根据权利要求1所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S3中，培养雪旺细胞所使用的培养器皿为重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白和重组人调蛋白-β1包被的组织培养瓶。
9.根据权利要求8所述的一种雪旺细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S3进一步包括如下步骤：以雪旺细胞培养基悬浮P3代神经球，接种至重组人层黏连蛋白、重组人纤黏连蛋白和重组人调蛋白-β1包被的组织培养瓶中，隔天换液，至60-80%汇合时，吸弃培养上清，PBS洗涤培养表面1次，室温消化5分钟后终止消化，离心弃上清，收获沉淀细胞，记为P0代UCB来源的雪旺细胞，P0代雪旺细胞传代培养1次。
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