CN109609456A - 一种雪旺细胞来源外泌体的新用途、诱导剂和试剂盒 - Google Patents

一种雪旺细胞来源外泌体的新用途、诱导剂和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种雪旺细胞来源外泌体的新用途、诱导剂和试剂盒，本发明研究发现，雪旺细胞来源外泌体能够用于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞。本发明证明雪旺细胞来源外泌体可有效诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞，可用于制备诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化的诱导剂和试剂盒。

Description

一种雪旺细胞来源外泌体的新用途、诱导剂和试剂盒
技术领域
本发明涉及医疗领域，特别涉及一种雪旺细胞来源外泌体的新用途、诱导剂和试剂盒。
背景技术
临床上导致周围神经缺损的原因很多，如肿瘤切除、创伤等均可造成神经缺损，临床上治疗周围神经离断除及时的神经对位缝合外，一般常用自体神经移植来治疗，但是存在造成供区神经功能丧失、遗留手术疤痕及供体有限、供区的附加切口、移植神经支配区的功能障碍等问题，且并不能保证达到确实的修复效果，近年来，周围神经组织工程技术的兴起，为神经缺损的修复提供了新的方法和手段。
雪旺细胞因其在周围神经结构组成中的特殊地位和作用，一直是研究的重点，雪旺细胞能够促进轴突再生、促进再生轴突的髓鞘化，雪旺细胞还具有复神经支配作用，在周围神经组织工程修复中充当种子细胞，但临床应用中来源有限，细胞增殖时间较长，因此快速获得组织工程化人工神经所需要的雪旺细胞非常重要，目前国内外在此方面有较多的研究，但普遍存在着技术复杂、所需试剂昂贵、雪旺细胞纯度不高等不足。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种雪旺细胞来源外泌体的新用途、诱导剂及试剂盒，该新用途、诱导剂和试剂盒可用于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了雪旺细胞来源外泌体在骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞中的应用。
本发明还提供了一种诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，该方法为采用雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞。
进一步的改进，该方法具体为：在含有对数生长期骨髓间充质干细胞的α-MEM培养液中加入雪旺细胞来源外泌体，换液后再加入血旺细胞来源外泌体培养骨髓间充质干细胞，共换液3次，每次培养3天。
其中，根据细胞生长情况，可以在培养过程中进行传代，传代后使用原培养液继续培养。
进一步的改进，该方法具体为：取对数生长期的骨髓间充质干细胞用pH值为7.4的PBS清洗三遍，加入含有0.5-1.5mmβ-巯基乙醇的α-MEM培养液孵育24h，再用含体积分数为5％-15％FBS和30-40ng/mL全反式维甲酸的α-MEM培养液孵育3d，更换为原始分化培养液，同时添加180-220μg/mL的雪旺细胞来源外泌体，孵育7-8d。
其中，在孵育过程中根据细胞生长情况，可以在培养过程中进行传代，传代后使用原培养液继续培养。
进一步的改进，对数生长期的骨髓间充质干细胞由如下方法制得：将骨髓间充质干细胞加入到α-MEM完全培养液中制备浓度为4-6×107/ml的骨髓间充质干细胞悬液，取骨髓间充质干细胞悬液导入细胞培养瓶中，置于37℃、95％湿度和5％CO2浓度条件下孵育3天后，倾去α-MEM完全培养液，用pH值为7.4的PBS溶液清洗去除未贴壁的骨髓间充质干细胞，更换新的α-MEM完全培养液培养至细胞融合度为70％-80％。
进一步的改进，原始分化培养液以α-MEM培养液为基础，添加8-12ng/mL的FBS、4-6μM的FSK、8-12ng/mL的b-FGF、4-6ng/mL的PDGF和180-220ng/mL的LHRG-β1。
其中，FBS为胎牛血清，FSK为佛司可林，b-FGF为碱性成纤维生长因子，PDGF为血小板衍生生长因子。
本发明还提供了一种用于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的诱导剂，该诱导剂含有雪旺细胞来源外泌体。
本发明还提供了一种用于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的试剂盒，该试剂盒含有雪旺细胞来源外泌体。
本发明证明雪旺细胞来源外泌体可有效诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞，可用于制备诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化的诱导剂和试剂盒。
附图说明
图1为成纤维细胞和雪旺细胞外泌体的透射电镜图(Fb代表成纤维细胞；RSC96代表雪旺细胞)；
图2为成纤维细胞和雪旺细胞外泌体标记性蛋白的鉴定图(Fb代表成纤维细胞；RSC96代表雪旺细胞)；
图3为诱导分化不同时间点细胞形态的变化(BMSCs代表骨髓间充质干细胞；induced BMSCs代表诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+RSC96exo代表雪旺细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+Fbexo代表成纤维细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；RSC96代表雪旺细胞)；
图4为分化诱导后相关标志分子mRNA的蛋白表达条带图(BMSCs代表骨髓间充质干细胞；induced BMSCs代表诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+RSC96exo代表雪旺细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+Fbexo代表成纤维细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；RSC96代表雪旺细胞)；
图5-9为分化诱导后相关标志分子mRNA的检测图，其中，BMSCs代表骨髓间充质干细胞；induced BMSCs代表诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+RSC96exo代表雪旺细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+Fbexo代表成纤维细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；RSC96代表雪旺细胞；图5为分化后相关标志分子S100的mRNA相对表达量；图6为分化后相关标志分子GFAP的mRNA相对表达量；图7为分化后相关标志分子NGRF的mRNA相对表达量；图8为分化后相关标志分子SOX10的mRNA相对表达量；图9为分化后相关标志分子Egr2的mRNA相对表达量；
图10-14为分化诱导后相关标志分子蛋白表达荧光染色，标尺为50μm(BMSCs代表骨髓间充质干细胞；induced BMSCs代表诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+RSC96exo代表雪旺细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+Fbexo代表成纤维细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；RSC96代表雪旺细胞)；
图15-19为分化诱导后各组细胞相关标志分子蛋白细胞阳性表达比例统计(BMSCs代表骨髓间充质干细胞；induced BMSCs代表诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+RSC96exo代表雪旺细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；BMSCs+Fbexo代表成纤维细胞来源外泌体诱导的骨髓间充质干细胞；RSC96代表雪旺细胞；图15为分化后相关标志分子S100的mRNA相对表达量；图16为分化后相关标志分子GFAP的阳性表达率；图17为分化后相关标志分子NGRF的阳性表达率；图18为分化后相关标志分子SOX10的阳性表达率；图19为分化后相关标志分子Egr2的阳性表达率)。
具体实施方式
说明，本发明所有实施例和对照例中的雪旺细胞和成纤维细胞均购自上海复祥，胎牛血清(10099-141)购自Gibco，α-MEM(SH30265.01B)、双抗(DY14011)购自Hyclone，β-巯基乙醇(M3148-100ML)、ATRA(R2625)购自Sigma，bFGF(400-29)、PDGF-AA(100-13A)、HRG-β1(100-03)购自Peprotech，forskol in(T2939)购自Targetmol。
实施例1
本实施例提供一种雪旺细胞来源外泌体的制备方法和雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，具体包括以下步骤：
取含有对数生长期的骨髓间充质干细胞的α-MEM培养液20ml，α-MEM培养液中的细胞密度为5×107/ml，在培养液中加入200μg雪旺细胞来源外泌体培养，换液再培养，共换液3次，每次培养3天；
雪旺细胞来源外泌体通过以下方法制得：
A.将含有融合程度达到90％的雪旺细胞消化，制备细胞悬液，先经2500g离心14min，去除凋亡细胞和细胞碎片，取上清液；
B.在上清液中加入ExoQuick外泌体沉淀溶液混合均匀，所述上清液与ExoQuick外泌体沉淀溶液的体积比为100:31，密封，在1℃条件下放置11h，制得混合液体；
C.将混合液体在9000g的条件下离心25min，弃上清，将沉淀重悬于PBS，即得雪旺细胞来源外泌体。
实施例2
本实施例提供一种雪旺细胞来源外泌体的制备方法和雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，具体包括以下步骤：
取细胞融合度达到70％的骨髓间充质干细胞用pH值为7.4的PBS清洗三遍，加入含有0.5mmβ-巯基乙醇的α-MEM培养液孵育24h，再用含体积分数为5％FBS和30ng/mL全反式维甲酸的α-MEM培养液孵育3d，更换为原始分化培养液，同时添加180μg/mL的雪旺细胞来源外泌体，孵育7d；
其中，雪旺细胞来源外泌体在使用前进行以下处理：用BCA试剂盒对雪旺细胞外泌体进行定量：将雪旺细胞来源外泌体加入试剂盒自带工作液稀释，使得到的雪旺细胞外泌体浓度为1.22μg/μL；
其中，原始分化培养液以α-MEM培养液为基础，添加8ng/mL的FBS、4μM的FSK、8ng/mL的b-FGF、4ng/mL的PDGF和180ng/mL的LHRG-β1；
其中，雪旺细胞来源外泌体的制备方法与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供一种雪旺细胞来源外泌体的制备方法和雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)对数生长期的骨髓间充质干细胞由如下方法制得：将骨髓间充质干细胞加入到α-MEM完全培养液中制备浓度为5×107/ml的骨髓间充质干细胞悬液，取骨髓间充质干细胞悬液导入细胞培养瓶中，置于37℃、95％湿度和5％CO2浓度条件下孵育3天后，倾去α-MEM完全培养液，用pH值为7.4的PBS溶液清洗去除未贴壁的骨髓间充质干细胞，更换新的α-MEM完全培养液培养至细胞融合度为70％；
(2)取步骤(1)制得的对数生长期的骨髓间充质干细胞用pH值为7.4的PBS清洗三遍，加入含有0.5mmβ-巯基乙醇的α-MEM培养液孵育24h，再用含体积分数为5％FBS和30ng/mL全反式维甲酸的α-MEM培养液孵育3d，更换为原始分化培养液，同时添加180μg/mL的雪旺细胞来源外泌体，孵育7d；
其中，雪旺细胞来源外泌体在使用前进行以下处理：用BCA试剂盒对雪旺细胞外泌体进行定量：将雪旺细胞来源外泌体加入试剂盒自带工作液稀释，使得到的雪旺细胞外泌体浓度为1.22μg/μL；
原始分化培养液以α-MEM培养液为基础，添加8ng/mL的FBS、4μM的FSK、8ng/mL的b-FGF、4ng/mL的PDGF和180ng/mL的LHRG-β1；
其中，雪旺细胞来源外泌体的制备方法与实施例1相同。
实施例4
本实施例提供一种雪旺细胞来源外泌体的制备方法和雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)对数生长期的骨髓间充质干细胞由如下方法制得：将骨髓间充质干细胞加入到α-MEM完全培养液中制备浓度为5×107/ml的骨髓间充质干细胞悬液，取3ml骨髓间充质干细胞悬液导入25ml细胞培养瓶中，置于37℃、95％湿度和5％CO2浓度条件下孵育3天后，倾去α-MEM完全培养液，用pH值为7.4的PBS溶液清洗去除未贴壁的骨髓间充质干细胞，更换新的α-MEM完全培养液培养至细胞融合度为75％；
(2)取步骤(1)制得的对数生长期的骨髓间充质干细胞用pH值为7.4的PBS清洗三遍，加入含有1mmβ-巯基乙醇的α-MEM培养液孵育24h，再用含体积分数为10％FBS和35ng/mL全反式维甲酸的α-MEM培养液孵育3d，更换为原始分化培养液，同时添加200μg/mL的雪旺细胞来源外泌体，孵育7.5d；
其中，雪旺细胞来源外泌体在使用前进行以下处理：用BCA试剂盒对雪旺细胞外泌体进行定量：将雪旺细胞来源外泌体加入试剂盒自带工作液稀释，使得到的雪旺细胞外泌体浓度为1.22μg/μL；
原始分化培养液以α-MEM培养液为基础，添加10ng/mL的FBS、5μM的FSK、10ng/mL的b-FGF、5ng/mL的PDGF和200ng/mL的LHRG-β1；
其中，雪旺细胞来源外泌体的制备方法与实施例1相同。
实施例5
本实施例提供一种雪旺细胞来源外泌体的制备方法和雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)对数生长期的骨髓间充质干细胞由如下方法制得：将骨髓间充质干细胞加入到α-MEM完全培养液中制备浓度为6×107/ml的骨髓间充质干细胞悬液，取3ml骨髓间充质干细胞悬液导入25ml细胞培养瓶中，置于37℃、95％湿度和5％CO2浓度条件下孵育3天后，倾去α-MEM完全培养液，用20重量份的pH值为7.4的PBS溶液清洗去除未贴壁的骨髓间充质干细胞，更换新的α-MEM完全培养液培养至细胞融合度为80％；
(2)取步骤(1)制得的对数生长期的骨髓间充质干细胞用pH值为7.4的PBS清洗三遍，加入含有1.5mmβ-巯基乙醇的α-MEM培养液孵育24h，再用含体积分数为15％FBS和40ng/mL全反式维甲酸的α-MEM培养液孵育3d，更换为原始分化培养液，同时添加220μg/mL的雪旺细胞来源外泌体，孵育8d；
其中，雪旺细胞来源外泌体在使用前进行以下处理：用BCA试剂盒对雪旺细胞外泌体进行定量：将雪旺细胞来源外泌体加入试剂盒自带工作液稀释，使得到的雪旺细胞外泌体浓度为1.22μg/μL。原始分化培养液以α-MEM培养液为基础，添加12ng/mL的FBS、6μM的FSK、12ng/mL的b-FGF、6ng/mL的PDGF和220ng/mL的LHRG-β1；
其中，雪旺细胞来源外泌体的制备方法与实施例1相同。
实施例6
本实施例提供一种雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，具体包括以下步骤：
(1)对数生长期的骨髓间充质干细胞由如下方法制得：将骨髓间充质干细胞加入到α-MEM完全培养液中制备浓度为6×107/ml的骨髓间充质干细胞悬液，取3ml骨髓间充质干细胞悬液导入25ml细胞培养瓶中，置于37℃、95％湿度和5％CO2浓度条件下孵育3天后，倾去α-MEM完全培养液，用20重量份的pH值为7.4的PBS溶液清洗去除未贴壁的骨髓间充质干细胞，更换新的α-MEM完全培养液培养至细胞融合度为80％；
(2)取步骤(1)制得的对数生长期的骨髓间充质干细胞用pH值为7.4的PBS清洗三遍，加入含有1.5mmβ-巯基乙醇的α-MEM培养液孵育24h，再用含体积分数为15％FBS和40ng/mL全反式维甲酸的α-MEM培养液孵育3d，更换为原始分化培养液，同时添加220μg/mL的雪旺细胞来源外泌体，孵育8d；
其中，雪旺细胞来源外泌体在使用前进行以下处理：用BCA试剂盒对雪旺细胞外泌体进行定量：将雪旺细胞来源外泌体加入试剂盒自带工作液稀释，使得到的雪旺细胞外泌体浓度为1.22μg/μL。原始分化培养液以α-MEM培养液为基础，添加12ng/mL的FBS、6μM的FSK、12ng/mL的b-FGF、6ng/mL的PDGF和220ng/mL的LHRG-β1；
其中，雪旺细胞来源外泌体的制备方法与实施例1相同。
对照例1
本对照例提供一种成纤维细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，与实施例1的区别之处在于，用成纤维细胞来源外泌体替代雪旺细胞来源外泌体；
成纤维细胞来源外泌体通过以下方法制得：
A.将含有成纤维细胞的培养液先经2500g离心14min，去除凋亡细胞和细胞碎片，取上清液；
B.在上清液中加入ExoQuick外泌体沉淀溶液混合均匀，所述上清液与ExoQuick外泌体沉淀溶液的体积比为100:31，密封，在1℃条件下放置11h，制得混合液体；
C.将混合液体在9000g的条件下离心25min，弃上清，将沉淀重悬于PBS。
试验例1
分别取实施例1和对照例1制备的雪旺细胞来源外泌体、成纤维细胞来源外泌体和实施例1和对照例1诱导分化后的雪旺细胞进行以下试验。
1、透射电镜观察
分别取雪旺细胞来源外泌体和成纤维细胞来源外泌体悬液50μL滴加在红蜡上，将聚醋酸甲基乙烯酯/碳-包被的铜网放于液滴中，室温静置20min，滤纸吸走多余的液体，用2％多聚甲醛固定2min，将铜网用双蒸水清洗3次，用2％磷钨酸(西亚试剂，4724)复染1min，滤纸吸走铜网上多余的液体后室温过夜干燥，用透射电镜分别观察雪旺细胞来源外泌体和成纤维细胞来源外泌体的形态，结果见图1和图2。
2、细胞形态观察
细胞诱导分化4d后，在光镜(Olympus，CX41)下观察细胞的形态变化。
3、Western检测
取诱导后的雪旺细胞弃上清，采用PBS洗涤2次后，加入100μL的RIPA裂解液，充分裂解后使用细胞刮刀收集裂解液，12000rpm离心5min，取上清，将离心后的上清分装转移到0.5mL的离心管，在提取的蛋白上清与5倍蛋白上样缓冲液混合放入沸水中进行沸水浴10min，变性完后冷却至室温，制得蛋白样品，将制备好的胶固定到电泳槽上，储液池中倒入电泳液，用微量加样器将制备好的蛋白样品和marker(Fermentas，SM1811)加入上样孔，各样品总蛋白量为40μg，加样后先恒压60V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压90V至溴酚蓝到凝胶底部用时1.5h，取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的NC膜(Millipore，HATF00010)和滤纸，一同浸泡于电转缓冲液中，按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，在转膜槽中加满电转液开始转膜，用含5％脱脂奶粉的TBST浸泡NC膜，室温摇床封闭2h。用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜，TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司，BA1054)---1:5000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h，TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次，将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1:1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。一抗信息：Sox 10(Affinity，DF8009，1:1000)、Oct 6(Omnimabs，OM203409，1:100)、Egr2(Affinity，AF0480，1:500)、NGFR(Omnimabs，OM267104，1:2000)、S100(Affinity，AF0251，1:1000)、GFAP(Affinity，AF6166，1:1000)，GADPH(杭州贤至生物有限公司，AB-P-R 001，1:1000)、CD63(Affinity，DF2305，1:1000)，CD81(Affinity，DF2306，1:1000)、Calnexin(Affinity，AF5362，1:1000)。
4、免疫荧光检测
细胞爬片用75％酒精浸泡15min后，用酒精灯烘烤干，冷却后放到24孔板中；接种细胞到爬片上20000/孔，按分组用不同的培养液培养；培养至所需的时间，吸取培养液，用PBS清洗一遍后，用4％多聚甲醛固定15min，室温；PBS洗4次；1％BSA 37℃封闭30min；一抗(Sox10，Affinity，DF8009，1:250；Egr2，Affinity，AF0480，1:100；NGFR，Omnimabs，OM267104，1:50；S100，Affinity，AF0251，1:100；GFAP，Affinity，AF6166，1:100)4℃过夜；PBS洗3次；二抗37℃孵育30min；PBS洗5次；滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBS洗去多余的DAPI，用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液(Southernbiotech，0100-01)封片，然后在荧光显微镜(奥林巴斯，BX53)下观察采集图像。
三.实验结果
1、外泌体提取分离鉴定
如图1和图2所示，对实施例1和对照例1的雪旺细胞来源外泌体和成纤维细胞来源外泌体进行鉴定，电镜下，提取物为100nm左右颗粒，符合外泌体特征，对提取物进行标记性蛋白检测，结果显示成纤维细胞和雪旺细胞来源提取物均表达外泌体标记性蛋白CD81和CD63，而不表达内质网标记性蛋白Calnexin，说明成功提取成纤维细胞和雪旺细胞外泌体。
2、细胞形态观察
如图3所示，用雪旺细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞进行分化诱导，诱导后的骨髓间充质干细胞的长款比例有所增加，在培养细胞中加入雪旺细胞来源外泌体和成纤维细胞来源外泌体培养后，两组细胞长宽比例均有一定程度的上升。
3、标志物检测
如图4和图5所示，与未经过雪旺细胞外泌体诱导组相比，经过雪旺细胞外泌体诱导后，BMSCs细胞S100、GFAP、Sox 10、NGFR、Egr2蛋白和mRNA表达均显著增加。与未经过成纤维细胞来源外泌体诱导组相比，经过成纤维细胞外泌体诱导后，BMSCs细胞S100、GFAP、Sox1和Egr2蛋白和mRNA表达均无明显变化；证明雪旺细胞来源的外泌体可以促进正常培养的BMSCs向雪旺细胞分化，标记性蛋白和转录因子在诱导过程中表达增加；成纤维细胞外泌体作为对照，未见雪旺细胞标记性蛋白以及转录因子表达增加。
4、荧光检测结果
如图6-15所示，免疫荧光结果显示，大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs经过诱导分化后，S100、GFAP、NGFR、Sox10和Egr2阳性表达比例均显著增加，与未经过雪旺细胞外泌体诱导组相比，经过雪旺细胞外泌体诱导后，BMSCs细胞S100、GFAP、NGFR、Sox10、Egr2阳性表达比例均显著增加，与未经过成纤维细胞来源外泌体处理诱导组相比，经过成纤维细胞外泌体诱导后，BMSCs细胞S100、GFAP、NGFR、Sox 10、和Egr2阳性表达比例均无明显变化。
由上可知，雪旺细胞来源外泌体能够用于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞，可用于制备诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化的诱导剂和试剂盒。

Claims (8)

1.雪旺细胞来源外泌体在诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞中的应用。
2.一种诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，其特征在于，所述方法为采用雪旺细胞来源外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞。
3.如权利要求2所述的诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，其特征在于，所述方法具体为：在含有对数生长期骨髓间充质干细胞的α-MEM培养液中加入雪旺细胞来源外泌体，换液后再加入血旺细胞来源外泌体培养骨髓间充质干细胞，共换液3次，每次培养3天。
4.如权利要求2所述的诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，其特征在于，所述方法具体为：取对数生长期的骨髓间充质干细胞用pH值为7.4的PBS清洗三遍，加入含有0.5-1.5mmβ-巯基乙醇的α-MEM培养液孵育24h，再用含体积分数为5％-15％FBS和30-40ng/mL全反式维甲酸的α-MEM培养液孵育3d，更换为原始分化培养液，同时添加180-220μg/mL的雪旺细胞来源外泌体，孵育7-8d。
5.如权利要求4所述的诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，其特征在于，所述对数生长期的骨髓间充质干细胞由如下方法制得：将骨髓间充质干细胞加入到α-MEM完全培养液中制备浓度为4-6×107/ml的骨髓间充质干细胞悬液，取骨髓间充质干细胞悬液导入细胞培养瓶中，置于37℃、95％湿度和5％CO2浓度条件下孵育3天后，倾去α-MEM完全培养液，用pH值为7.4的PBS溶液清洗去除未贴壁的骨髓间充质干细胞，更换新的α-MEM完全培养液培养至细胞融合度为70％-80％。
6.如权利要求4所述的诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法，其特征在于，所述原始分化培养液以α-MEM培养液为基础，添加8-12ng/mL的FBS、4-6μM的FSK、8-12ng/mL的b-FGF、4-6ng/mL的PDGF和180-220ng/mL的LHRG-β1。
7.一种用于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有雪旺细胞来源外泌体。
8.一种用于诱导骨髓间充质干细胞分化为雪旺细胞的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂含有雪旺细胞来源外泌体。
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