CN104593320A

CN104593320A - 一种汗腺分化诱导培养基及其应用

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Publication number: CN104593320A
Application number: CN201510002902.3A
Authority: CN
Inventors: 张茂; 许永安
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-01-04
Filing date: 2015-01-04
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2035-01-04
Also published as: CN104593320B

Abstract

本发明涉及细胞生物学领域，特别涉及一种汗腺分化诱导培养基及其应用。该培养基是在低糖DMEM培养基中添加以下成分：以低糖DMEM培养基体积计，胎牛血清体积分数8-15％，半琥珀酰氢化可的松0.3-0.5μg/ml，rh-KGF 10-100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸1-3nmol/ml，rh-EGF 10-100ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.05-0.2ml/ml。该汗腺分化诱导培养基以重组人角化细胞生长因子作为关键调控因子，构建出成品化的汗腺分化诱导培养基，诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化，结果稳定可靠，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研究及临床应用。

Description

一种汗腺分化诱导培养基及其应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体而言，涉及一种汗腺分化诱导培养基及其应用。

背景技术

目前对于诱导人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)和/或脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)向汗腺细胞分化可以采用与热休克汗腺细胞共培养或培养于含热休克汗腺培养基的上清液的方法获得具有汗腺细胞表型特征的BM-MSCs和/或hUC-MSCs。而采用以上方法获得汗腺样细胞(SGCs)一般需要从供体获得正常汗腺组织(sweat glands,SGs)，继而采用相应的诱导方式获取SGCs。而对于以上汗腺诱导方法，一方面需要等待获取正常的SGs，另一方面对于诱导MSCs向SGCs分化的关键调控基因不明确，因此无法配制成品化的汗腺分化诱导培养基，上述诱导方法受到SGs来源的限制而无法广泛开展。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种汗腺分化诱导培养基，以重组人角化细胞生长因子(rhKGF)作为关键调控因子，在原有汗腺细胞培养基的基础上构建出成品化的汗腺分化诱导培养基，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研究及临床应用。

本发明的第二目的在于提供一种所述的汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的应用，所述的汗腺分化诱导培养基能够诱导人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)向汗腺样细胞(SGCs)分化，得到汗腺样细胞，以解决背景技术中的不足。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种汗腺分化诱导培养基，其特征在于，在低糖DMEM培养基中添加以下成分：以低糖DMEM培养基的体积计，胎牛血清的体积分数为8-15％，半琥珀酰氢化可的松0.3-0.5μg/ml，rh-KGF10-100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸1-3nmol/ml，rh-EGF 10-100ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.05-0.2ml/ml；

其中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液包含以下成分：胰岛素0.01g/L，人转运铁蛋白0.0055g/L，亚硒酸0.000006g/L。

本发明提供的汗腺分化诱导培养基，以重组人角化细胞生长因子(rhKGF)作为关键调控因子，在原有汗腺细胞培养基的基础上构建出的成品化的汗腺分化诱导培养基，该汗腺分化诱导培养基能够诱导人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)向汗腺样细胞(SGCs)分化，得到汗腺样细胞，结果稳定可靠，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研究及临床应用。

为了使达到更好的培养效果，优选地，胎牛血清为特级胎牛血清。

为了使汗腺分化诱导培养基更好的发挥诱导作用，以获得性状更明显的汗腺样细胞，优选地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 20-100ng/ml。

进一步地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF40-100ng/ml。

更进一步地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 40ng/ml。

为了增强各成分之间的协同配合作用，以得到更好表达的汗腺样细胞，优选地，以低糖DMEM培养基的体积计，胎牛血清的体积分数为10％，半琥珀酰氢化可的松0.4μg/ml，三碘甲状腺原氨酸2nmol/ml，rh-EGF 10-50ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.1ml/ml；

更优选地，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-EGF 10ng/ml。

此外，为了防止细胞在培养过程中受到污染，优选地，所述汗腺分化诱导培养基还包括：以低糖DMEM培养基的体积计，青霉素90-110U/ml，链霉素90-110μg/ml。

进一步地，以低糖DMEM培养基的体积计，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

本发明还提供了所述的汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的应用。

3-5代的人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的细胞增殖、分化活性最强，优选地，所述人脐带间充质干细胞采用3-5代细胞。

优选地，细胞诱导的时间为20-25天，优选为21天。该培养天数，人脐带间充质干细胞被诱导向汗腺样细胞分化，得到汗腺样细胞。

为了使诱导过程的顺利进行，进一步地，所述人脐带间充质干细胞以1×10⁴/孔的密度接种进行培养；

在培养过程中优选为2-3天更换1次培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种汗腺分化诱导培养基，以重组人角化细胞生长因子(rhKGF)作为关键调控因子，在原有汗腺细胞培养基的基础上构建出成品化的汗腺分化诱导培养基，可广泛用于多种MSCs向汗腺细胞分化诱导的相关研究及临床应用；

(2)为了增强各成分之间的协同配合作用，以得到更好表达的汗腺样细胞，本发明限定了汗腺分化诱导培养基各成分之间的配比；

(3)本发明还提供了汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的应用，并限定了培养的细胞、接种的密度以及培养的天数等条件，以稳定获得汗腺样细胞。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中人脐带间充质干细胞的表型鉴定图；

图2为本发明实施例1中hUC-MSCs多向分化潜能鉴定电镜图；

图3为本发明实施例2和3中汗腺样细胞的细胞形态及表型鉴定图；

图4为本发明实施例3中不同浓度的rhKGF诱导表达汗腺表面标记物抗原CEA、CK14、CK19活性的柱形图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

一、脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定

1.脐带间充质干细胞的分离、培养

(1)新鲜脐带组织在获得患者知情同意的情况下以医疗废物的形式采集后，以无菌方式保存在4℃的转运盒内，并于6h内切除脐带双侧带有夹痕及淤血的部分；

(2)用含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的磷酸盐溶液(PBS缓冲液)冲洗脐带外周以及脐静脉内腔；

(3)然后将脐带组织剪切成0.5-1.0mm³的组织块，直接加入1g/L的II型胶原酶溶液置于37℃保温箱中孵育16h；

(4)用PBS溶液洗涤脐带组织后，加入25g/L胰蛋白酶继续在37℃保温箱中孵育0.5h；

(5)加入体积分数为20％胎牛血清的培养基，以直径为100μm的滤网过滤细胞，收集滤液；

(6)PBS溶液洗涤细胞，1500rpm离心20min后，弃上清；

(7)以普通脐带间充质干细胞培养基重悬细胞，按1×10³/cm²的密度将细胞接种于25cm²培养瓶中；

(8)3d后首次换液，以后每2-3d更换细胞培养液1次；

(9)观察贴壁细胞生长，当细胞达70％～80％融合时，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液(EDTA)消化细胞然后进行对其进行传代培养、扩增细胞；

(10)镜下观察细胞生长、增殖活性。

2.hUC-MSCs鉴定及存储

(1)形态学观察

在倒置相差显微镜(100×)下定期观察脐带间充质干细胞的形态及其生长增殖活性。显微镜下观察至细胞呈梭形、成纤维细胞样形态即可。

(2)流式细胞术检测细胞表面抗原表达特性

hUC-MSCs经过传代、扩增后，取第3代hUC-MSCs用胰蛋白酶-EDTA消化后用FITC标记的一抗CD29、CD44、CD105、Oct-4进行孵育，以鼠源IgG1作为阴性对照，用以鉴定该细胞的抗原表达阳性率。具体步骤如下：

1)标本收集：选取3代hUC-MSCs，弃去hUC-MSCs培养基，用PBS平衡盐溶液洗涤细胞2次，每次5min，洗除残留的细胞培养基；

2)每个细胞培养瓶中加入约3ml胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液，消化细胞，待细胞形态变圆、呈漂浮状时，滴加2ml含20％FBS的DMEM培养液终止消化；

3)收集细胞，1200rpm，离心5min，弃上清液，收集细胞，用预冷的75％的乙醇固定细胞30min；

4)然后用PBS溶液洗涤细胞3次，每次5min，洗除残余的固定液；

5)在每个流式检测管中加入50μl的荧光标记稀释好的一抗(按照产品说明书用抗体稀释液稀释成合适的浓度)；在空白管/孔或同型对照管/孔中加入50μl PBS溶液；

6)每管分别加入100μl细胞悬液，细胞量为1-1.5×10⁶，并轻轻混匀；

7)室温避光孵育30分钟或4℃避光孵育过夜；

8)每管分别加入2ml PBS平衡盐溶液洗涤未结合的一抗；

9)室温避光离心，1500rpm离心5分钟，并弃去上清，反复洗涤细胞3次；

10)加入150μl荧光素标记的二抗(按照产品说明书适当稀释二抗)，37℃，避光孵育30min；

11)用2ml PBS洗涤细胞一次，1500rpm离心5分钟；

12)弃上清后，用PBS溶液制备细胞悬液450μl，上流式仪检测，得到的结果如图1所示。

从图1可以看出，hUC-MSCs阳性表达间充质细胞表面标记物抗原CD29和CD105以及胚胎细胞标记物Oct-4；阴性表达造血细胞系标记物CD45。通过以上细胞表面标记物抗原鉴定，可以确定从人脐带组织中获得的hUC-MSCs具有扩增活性。

(3)多向分化诱导实验

倒置相差显微镜下观察hUC-MSCs的形态特征，取体外培养、扩增后的3代hUC-MSCs以1×10⁴/cm²密度接种于3个6孔板中进行贴壁培养，待细胞贴壁后，分别加入骨细胞条件诱导培养基、脂肪细胞条件诱导培养基以及软骨细胞分化诱导培养基，诱导培养2-3周后分别采用钙钴法-碱性磷酸酶染色、油红-O染色以及免疫组织化学染色鉴定II型胶原抗体的染色效果。

镜下观察骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的形态特征及染色情况。在各个分化诱导培养组中，均以普通脐带间充质干细胞培养基培养的细胞为阴性对照组。

1)成骨诱导鉴定

1.待hUC-MSCs达到80～90％融合时，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞；

2.将hUC-MSCs接种于六孔板中，每孔约3×10³个细胞，每孔中各加入2ml普通脐带间充质培养液，放入37℃，5％CO₂孵箱中培养；

3.24h后，移去旧的培养液，加入2ml/孔成骨分化诱导培养液；

4.每3天更换1次培养基，诱导2-3周；

5.2-3周后，镜下观察钙结节的形成，钙钴法检测碱性磷酸酶的产生；

6.弃去细胞培养板中的骨细胞分化诱导培养基，用PBS溶液漂洗细胞3次，每次5min，去除残留细胞培养基；

7.用10％的多聚甲醛溶液固定细胞；

8.用PBS磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，去除残留固定液；

9.孵化：一次加入碱性磷酸酶孵化液中的3％β-甘油磷酸钠水溶液、2％巴比妥钠溶液、2％氯化钙溶液、5％硫酸镁水溶液、蒸馏水，按序混合各种溶液后，用10％氢氧化钠调pH值在9.0-9.6之间。固定的细胞孵育前，先将孵育液置37℃温箱预热。细胞固定完备后，将孵化液加入6孔板中，37℃下孵化4-6h，自来水冲洗数次。

10.2％硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗3次。

11.1％的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固，于显微镜下观察，得到的结果如图2A所示。

其中，孵育液含有以下成分：

从图2A可以看出，hUC-MSCs经过分化诱导后可以分化碱性磷酸酶染色阳性的成骨细胞。

2)成脂分化诱导鉴定

①待脐带间充质干细胞达到80-90％融合时，用胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞；

②然后将干细胞接种于六孔板中，每孔约1x10³个细胞，每孔加入2ml脂肪细胞分化诱导培养液。放入37℃，5％CO₂孵箱中培养；

③每3天换液一次，分化诱导3周；

④当脂滴出现较多，开始油红-O染色鉴定；

油红-O染色鉴定方法如下：

I试剂配置：

油红-O的配制方法：称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，置于棕色瓶中密封或锡箔纸包裹避光，4℃保存储存液，可长期保存。用时取6ml储存液加三蒸水4ml混匀，定性滤纸过滤，稀释后5小时内用完。

II染色步骤：

将诱导完毕的细胞弃去培养液，用PBS溶液清洗细胞3次，每次5min。用10％多聚甲醛溶液固定细胞30min，用PBS溶液清洗细胞3次，每次5min。37℃恒温培养箱中，孵育油红-O染料1-2h。

III观察镜检：脂质呈红色，背景无色，具体如图2B所示。

从图2B可以看出，hUC-MSCs经过分化诱导后可以分化油红-O染色的成脂细胞。

成骨和成脂试验可以看出，获得的hUC-MSCs具有多向分化潜能。

实施例2

汗腺细胞分离及鉴定

1.正常汗腺细胞分离、培养

(1)将皮肤置于含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的D-Hank’s平衡盐溶液中，反复漂洗3次，每次5min，洗除多余血渍；

(2)然后修除皮下脂肪组织，用D-Hank’s平衡盐溶液继续反复漂洗，每次5min，清除残留脂肪组织；

(3)用微粒皮制作法将皮肤修剪成直径约为0.5-0.8mm大小的微粒皮，加入3ml浓度为2.5mg/ml的II型胶原酶溶液，使微粒皮悬浮于II型胶原酶溶液中；

(4)然后将含有皮肤微粒的II型胶原酶溶液置于温度为37.5℃，湿度保持在95％以上的保温孵箱中促使II型胶原酶溶液对皮肤组织的酶解消化作用；

(5)在清洁、紫外线消毒的倒置相差显微镜下观察皮肤组织的酶解、消化进度；

(6)待汗腺组织的分泌部/导管部完全从皮肤组织中游离出时，用10μl微量移液器分离、提取游离出的汗腺组织，然后将其转置于含有4ml普通汗腺细胞培养基的细胞培养皿/板中进行体外培养、扩增；

(7)细胞培养条件为温度为37℃，含有5％CO₂，湿度为95％的恒温细胞培养箱；

(8)汗腺细胞培养24-48h后第一次更换培养基，以后每2-3d更换一次培养基，同时镜下观察汗腺细胞生长、增殖活性；

(9)汗腺细胞培养4-6d后，在汗腺细胞周围会出现梭状的成纤维细胞；为消除成纤维细胞对汗腺细胞增殖的影响，更换汗腺培养基时弃去旧培养基后，加入3ml含有质量分数为0.25％的胰蛋白酶-质量分数为0.01％的乙二胺四乙酸(EDTA)混合消化液，室温孵育3min后，见成纤维细胞呈圆形并呈漂浮状，而汗腺细胞的贴壁生长未见影响时，用含10％胎牛血清的DMEM培养基终止胰蛋白酶-EDTA溶液的消化作用，弃去消化液，用Hank平衡盐溶液(HBSS)漂洗培养皿/板2次，每次2min，洗除残留的成纤维细胞；

(10)然后添加新鲜普通汗腺细胞培养基，继续培养汗腺细胞。

2.汗腺细胞鉴定

(1)形态学鉴定

更换汗腺细胞培养基时，定期在倒置相差显微镜下分离获取的汗腺细胞的生长状态，包括扩增后的汗腺细胞的形态学特征：正常汗腺细胞培养后呈克隆样、铺路石状增殖。

(2)免疫组织化学染色

分离获取的汗腺细胞培养周期为7-10天，显微镜下观察到增殖的汗腺细胞呈铺路石状时，采用免疫组织化学染色法对其进行细胞表面抗原(CK14、CK19、CEA)鉴定，确定细胞的抗原表达特性及其阳性率。

具体鉴定步骤如下：

1)细胞标本准备

对于贴壁生长的汗腺细胞：直接用6孔细胞培养板或60mm细胞培养皿等培养，按照汗腺细胞的常规培养方法进行体外扩增，当观察到汗腺细胞扩增呈铺路石样克隆性增生时进行细胞固定等后续操作；

2)固定使用10％的福尔马林(甲醛)溶液固定细胞，固定30min以后，用PBS平衡盐溶液漂洗两次，每次5min，洗除残余的细胞固定液；

3)去除内源性过氧化物酶

汗腺细胞经PBS洗涤后，用滤纸吸尽细胞培养皿或板中残余水分(但不能使细胞太干燥)，向培养皿/板中滴加3％过氧化氢(H₂O₂)溶液2ml，室温湿化盒中继续孵育10-15min，去除内源性非特异性过氧化物酶的干扰，待细胞表面出现小气泡时，表示过氧化氢溶液反应完全；

4)PBS漂洗细胞3次，每次5min，去除残余的过氧化氢溶液，避免非特异性染色反应的发生；

5)一抗孵育

参考一抗(CK14、CK19、CEA)的说明书，按照适当比例(1:50-100)用免疫染色一抗稀释液稀释一抗，立即向细胞培养板或细胞培养皿中加入适量稀释好的一抗，37℃孵育1h或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育过夜；待一抗反应孵育完毕后，弃去一抗反应液，用PBS平衡盐溶液洗涤细胞3次，每次5min，洗除未结合的一抗；

6)二抗孵育

参考二抗的说明书，按照适当比例(1:100-200)用PBS磷酸盐缓冲液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠/兔二抗，用滤纸吸尽一抗洗涤液后，立即加入适量稀释好的二抗反应液，37℃条件下孵育二抗1h，弃去二抗反应液，加入PBS平衡盐溶液在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤细胞2次，每次10min；

7)显色、复染以及封片

按照DAB显色试剂盒说明书的要求配制DAB工作液，用滤纸吸除残余的二抗洗涤液后，向培养皿或培养板中添加DAB显色液0.5-1ml，避光显色30s-5min，待细胞膜反应呈黄色或棕黄色时，用蒸馏水终止显色反应；

然后在苏木素溶液中进行细胞核复染2min，用蒸馏水漂洗10min，待细胞核呈蓝染后用封片剂封片；

8)照相

Leica DMI-4000B自动曝光显微照相系统照相，结果如图3中的D、E和F所示。从图3可以看出，正常汗腺细胞阳性表达汗腺标记物CEA、CK14、CK19。

实施例3

汗腺分化诱导培养基的配制及应用

1.汗腺分化诱导培养基的配制

组1：在低糖DMEM培养基中添加以下成分：以低糖DMEM培养基的体积计，特级胎牛血清的体积分数为10％，半琥珀酰氢化可的松0.4μg/ml，rh-KGF分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml 100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸2nmol/ml，rh-EGF 10ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.1ml/ml，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

组2：在低糖DMEM培养基中添加以下成分：以低糖DMEM培养基的体积计，特级胎牛血清的体积分数为8％，半琥珀酰氢化可的松0.3μg/ml，rh-KGF分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml 100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸1nmol/ml，rh-EGF 50ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.05ml/ml，青霉素90U/ml，链霉素110μg/ml；

组3：在低糖DMEM培养基中添加以下成分：以低糖DMEM培养基的体积计，特级胎牛血清的体积分数为15％，半琥珀酰氢化可的松0.5μg/ml，rh-KGF分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml 100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸3nmol/ml，rh-EGF 100ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.2ml/ml，青霉素110U/ml，链霉素90μg/ml；

2.按各成分分别配置得到100ml的汗腺分化诱导培养评价体系；

2.将第3-5代hUC-MSCs按照1X10⁴/孔的密度接种于6孔细胞培养板中；

2-3天更换1次分化培养基，培养期间在显微镜下观察细胞的形态学变化，细胞培养21天后收集细胞(SGCs)。

(1)、对hUC-MSCs和细胞培养21天后收集SGCs电镜观察，结果如图4中的A、B和C所示；

其中，图4中的A是由人脐带组织中分离、获取、扩增培养后形成具有克隆性增殖、成纤维细胞样形态的间充质干细胞；图4中的B为hUC-MSCs经过在汗腺分化诱导培养基中培养21天后，细胞形态增生、肥大，并呈聚集性增殖，形成SGCs；图4中的C为单个SGCs图，可以看出，分化形成的SGCs具有类似正常汗腺细胞增殖后的细胞形态。

(2)、将得到的SGCs采用与实施例2相同的方式进行免疫组织化学染色，并通过采用流式细胞术对不同浓度rh-KGF诱导后获取的SGCs进行检测活性，结果如图3和图4所示。

分化诱导获得的SGCs阳性表达汗腺标记物抗原CEA、CK14、CK19的电镜图分别如图3中的G、H、I所示；而正常汗腺细胞按照免疫细胞化学染色的方法鉴定后能够阳性表达汗腺标记物抗原CEA、CK14、CK19的电镜图分别如图4中的D、E和F所示。

可以看出，经由hUC-MSCs分化诱导获得的SGCs具有类似正常汗腺细胞表面标记物抗原的活性。

图4为组1中不同浓度的rhKGF诱导表达汗腺表面标记物抗原CEA、CK14、CK19的活性；从图4可以看出，rhKGF浓度为10-100ng/ml时，所构建的汗腺分化诱导培养基使hUC-MSCs分化为SGCs表达汗腺标记物抗原CEA、CK14、CK19；

其中，rhKGF浓度为2-100ng/ml时，所构建的汗腺分化诱导培养基使hUC-MSCs分化为SGCs表达汗腺标记物抗原CEA、CK14、CK19效率较高；

而rhKGF浓度为40ng/ml时所构建的汗腺分化诱导培养基，使hUC-MSCs分化为SGCs时表达汗腺标记物抗原CEA、CK14、CK19的效率最高(p<0.05)。

同时，hUC-MSCs培养于普通培养基时则阴性表达汗腺标记物抗原。

此外，组2和组3的结果与组1的结果一致。

另外，细胞诱导的时间还设置为20、22、23、24、25天等，收获得到的SGCs结果与上述结果一致。

综上，可以看出，本发明提供的汗腺分化诱导培养基成功诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化。

其中，rh-KGF供应商为Abcom,USA，使用时按产品说明书将rh-KGF稀释成10ng/ml的浓度冻存于-20℃，备用；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液(ITS)可以购买成品，如购自GibcoBRL，USA。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种汗腺分化诱导培养基，其特征在于，在低糖DMEM培养基中添加以下成分：以低糖DMEM培养基的体积计，胎牛血清的体积分数为8-15％，半琥珀酰氢化可的松0.3-0.5μg/ml，rh-KGF10-100ng/ml，三碘甲状腺原氨酸1-3nmol/ml，rh-EGF 10-100ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.05-0.2ml/ml；

2.根据权利要求1所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 20-100ng/ml。

3.根据权利要求1所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 40-100ng/ml。

4.根据权利要求1所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培养基的体积计，rh-KGF 40ng/ml。

5.根据权利要求1-4任一项所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，以低糖DMEM培养基的体积计，胎牛血清的体积分数为10％，半琥珀酰氢化可的松0.4μg/ml，三碘甲状腺原氨酸2nmol/ml，rh-EGF 10-50ng/ml，优选为rh-EGF 10ng/ml，胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液0.1ml/ml；

其中，所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠溶液包含以下成分：胰岛素0.01g/L，人转运铁蛋白0.0055g/L，亚硒酸0.000006g/L；

6.根据权利要求5所述的汗腺分化诱导培养基，其特征在于，所述汗腺分化诱导培养基还包括：以低糖DMEM培养基的体积计，青霉素90-110U/ml，链霉素90-110μg/ml；优选为青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml。

7.权利要求1-6任一项所述的汗腺分化诱导培养基在诱导人脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞采用3-5代细胞。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，细胞诱导的时间为20-25天，优选为21天。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞以1×10⁴/孔的密度接种进行培养；

在培养过程中优选为2-3天更换1次培养基。