CN105754936A - 人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法、通过所述方法产生的间充质干细胞以及包含间充质干细胞的细胞治疗产品。本发明的方法操作简单、便捷，只需要使用更换诱导培养基和维持培养基即可，不需要使用流式分选技术，节省费用和时间；获得的间充质干细胞纯度高、生存能力强、不容易老化，可至少传代到80代，并保持功能正常。

Description

人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法、通过所述方法产生的间充质干细胞以及包含间充质干细胞的细胞治疗产品。

背景技术

干细胞是能够分化为构成有机体组织的多种细胞的细胞，且一般指分化之前的未分化细胞，其可获自胚胎、胎儿和成人身体的各个组织。干细胞通过分化刺激分化为特定细胞；与因分化完成而引起其细胞分裂已停止的细胞不同，干细胞允许通过经由细胞分裂产生与其本身相同的细胞来进行增殖；且由于在不同环境下或通过不同的分化刺激，干细胞可分化为其它细胞，因此干细胞在分化过程中具有可塑性。

干细胞根据其分化能力可分为多能(pluripotent)、多效(multipotent)和单能(unipotent)干细胞。多能干细胞为具备全能性以分化为所有细胞的多能细胞，且这些多能干细胞包含胚胎干细胞(ES细胞)以及诱导性多能干细胞(iPS细胞)等。

胚胎干细胞由早期胚胎发育中胚细胞的内细胞团形成；具备全能性以分化为所有细胞从而使得其能够分化为任何种类的组织细胞；可以永生和未分化状态的形式培养；与成体干细胞不同，可通过生殖细胞的制备遗传到下一代。

通过在人类胚胎形成的时候仅分离并培养内细胞团来制备人类胚胎干细胞，且当前，已从灭菌操作后剩余的冷冻胚胎中获得全局制备的人类胚胎干细胞。为使用能够分化为所有细胞的多能人类胚胎干细胞作为细胞治疗产品，已进行了各种尝试；然而，这些尝试尚未完全克服例如致癌和免疫排斥风险等高障碍。

近来，已提供了具有免疫调节功能并且无肿瘤发生风险的间充质干细胞作为用于解决这些问题的替代方法。间充质干细胞为能够分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、心肌细胞等的多效细胞，且已报道具有调节免疫反应的功能。为使间充质干细胞用作细胞治疗产品，再生医学和/或细胞治疗领域所需的约1×10⁹最少数量的细胞需得到满足。然而，在考虑用于设定条件和标准的实验时，实际需要的细胞数量进一步增加。因此，体外实验中需要至少10次传代以由获自各种来源的现有间充质干细胞提供所述量的细胞。在这种情况下，细胞变得老化并经修饰，因此，它们可能不会再适于用作细胞治疗产品。虽然已通过使用这些细胞来设定条件和标准，但可能会出现一些问题：这些细胞可能在实际用于治疗中之前就已变得枯竭，从而需要使用来自他人的间充质干细胞，且在这种情况下，由于使用不同的细胞而需要进行额外的实验。

解决现有间充质干细胞培养系统的上述问题的最理想替代方法是使用人类多能干细胞或胚胎干细胞来产生间充质干细胞。然而现有的方法需要用到流式分选技术，存在着操作复杂、耗时长，生产效率低的问题。

发明内容

一方面，本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，本发明的方法能够更便捷的将不同来源的多能干细胞诱导分化为具有功能的且生存能力强的间充质干细胞。

本发明采用的技术方案为：一种人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

1)将人诱导性多能干细胞置于Matrigel铺板的载体上，使用iPSc-MSC诱导培养基诱导所述人诱导性多能干细胞以将其转化为间充质干细胞，iPSc-MSC诱导培养基为添加有血清及L-抗坏血酸的培养基；

2)以增殖性的方式培养步骤1)中得到的间充质干细胞。

优选地，所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％的血清及50-100μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM；所述血清为FBS。

发明人经大量试验证明，L-抗坏血酸可有效预防间充质干细胞在传代过程中老化，iPSc-MSC诱导培养基中加入L-抗坏血酸后，得到的间充质干细胞生存能力极强。

优选地，所述步骤1)中的诱导时间为14-21天。

优选地，所述步骤2)通过以下步骤实施：

21)消化步骤1)得到的间充质干细胞，将其传代至细胞粘合剂铺板的载体上，使用维持培养基来培养间充质干细胞，得到第一代间充质干细胞；所述维持培养基为添加有血清、bFGF以及内皮生长因子(EGF)的培养基；

22)将步骤21)得到第一代间充质干细胞再次传代至细胞粘合剂铺板的载体上，使用所述维持培养基培养，得到第二代间充质干细胞；

23)待第二代间充质干细胞长满后，使用所述维持培养基按正常的间充质干细胞培养方法进行培养及传代。

优选地，所述维持培养基为添加有8-15％的血清、5-10ng/mL的bFGF以及10-20ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基；所述血清为FBS。

优选地，所述步骤21)中，消化是指利用消化酶消化5-15min；传代比例为1:1～1:3；培养时间为2～6d。更优选地，所述消化在37℃下进行。

优选地，所述步骤22)中，传代比例为1:1～1:3。

优选地，所述细胞粘合剂为明胶或Matrigel。

优选地，所述载体为细胞培养板，如6孔板、12孔板等，更优选为6孔板。

细胞粘合剂铺板就是将细胞粘合剂(如Gelatine或Matrigel)加入载体(如6孔板)中，每孔加700ml，37℃静置半小时，即完成铺板。

正常的间充质干细胞培养方法是指传统的培养方法，即不使用细胞粘合剂(如Gelatine或Matrigel)，仅使用维持培养基对间充质干细胞进行培养。

另一方面，本发明还提供了一种间充质干细胞，所述间充质干细胞由所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法产生。

再一方面，本发明还提供了一种细胞治疗产品，其包括所述的间充质干细胞。

又一方面，本发明还提供了一种用于培养细胞的饲养细胞，其包括所述的间充质干细胞。

进一步地，本发明还提供了一种用于将人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：

a.iPSc-MSC诱导培养基，其为添加有血清及L-抗坏血酸的培养基；

b.维持培养基，其为添加有血清、bFGF以及内皮生长因子的培养基。

优选地，所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％的血清及50-100μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM；

所述维持培养基为添加有8-15％的血清、5-10ng/mL的bFGF以及10-20ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基；

所述血清为FBS。

在上述技术方案中，使用iPSc-MSC诱导培养基可以大大减少在分化过程中由于细胞生长过密及产生的自由基而引起诱导细胞的过早老化。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明的人诱导性多能干细胞及人胚胎干细胞诱导为间充质干细胞的方法操作简单、便捷，只需要使用更换诱导培养基和维持培养基即可，不需要使用流式分选技术，节省费用和时间；获得的间充质干细胞纯度高、生存能力强、不易老化，可至少传代到80代，并保持功能正常。

附图说明

图1为根据本发明人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法的一个实施例的流程示意图；

图2为实施例1中的UC-iPScP30的显微镜照片；

图3为实施例1中iPSc诱导为MSC的过程照片；

图4为实施例1中iPSc-MSCP4的显微镜照片；

图5为实施例1中iPSc-MSCP50的显微镜照片

图6为实施例1中iPSc-MSCP11的老化实验显微镜照片，结果显为没有老化细胞；

图7为实施例1中iPSc-MSCP50的老化实验显微镜照片，结果显示仅有个别细胞出现老化(核蓝色细胞)；

图8显示了iPSc-MSC的表面标志的检测结果；

图9显示了iPSc的OCT4、Sox2、TRA-1-81、TRA-1-60干性因子表达；

图10显示了iPSc-MSC的OCT4、Sox2、TRA-1-81、TRA-1-60干性因子表达，iPSc-MSC不表达上述iPSc的干性因子；

图11显示了诱导所得iPSc-MSC具有成骨、成脂及成软骨分化能力。

具体实施方式

如图1所示，其为根据本发明人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法的一个实施例的流程示意图，该方法包括以下步骤：

步骤S1：将人诱导性多能干细胞置于Matrigel铺板的载体上，使用iPSc-MSC诱导培养基诱导所述人诱导性多能干细胞以将其转化为间充质干细胞；

其中，所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％(V/V)的FBS及50-100μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM，优选为添加有10％(V/V)的FBS及50μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM；使用本培养基可以大大减少在分化过程中由于细胞生长过密及产生的自由基而引起诱导细胞的过早老化；诱导时，隔天更换iPSc-MSC诱导培养基至14-21天，细胞形态上逐渐趋近MSC；

Matrigel为基质胶，可为iPSc的生长提供胶原滋养，并协助iPSc贴壁生长；Matrigel铺板就是将Matrigel加入载体(如6孔板)中，每孔加700ml，37℃静置半小时，即完成铺板；所述载体为细胞培养板，如6孔板、12孔板等，优选为6孔板。

步骤S2：消化间充质干细胞，将其传代至明胶铺板的载体上，使用维持培养基来培养间充质干细胞，得到第一代间充质干细胞；

其中，所述维持培养基为添加有8-15％(V/V)的FBS、5-10ng/mL的bFGF以及10-20ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基，优选为添加有10％(V/V)的FBS、5ng/mL的bFGF以及10ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基；所述消化是指利用消化酶Accutase在37℃下消化5-15min；传代比例为1:1～1:3，优选为1:2；培养时间为2～6d，优选为3d；

明胶铺板就是将明胶(Gelatine)加入载体(如6孔板)中，每孔加700ml，37℃静置半小时，即完成铺板；所述载体为细胞培养板，如6孔板、12孔板等，优选为6孔板。

步骤S3：将第一代间充质干细胞再次传代至明胶铺板的载体上，使用所述维持培养基培养，得到第二代间充质干细胞；

其中，传代比例为1:1～1:3，此步骤中的维持培养基同步骤S2中的维持培养基；明胶铺板就是将明胶(Gelatine)加入载体(如6孔板)中，每孔加700ml，37℃静置半小时，即完成铺板。

步骤S4：待第二代间充质干细胞长满后，使用所述维持培养基按正常的间充质干细胞培养方法进行培养及传代。

其中，正常的间充质干细胞培养方法是指传统的培养方法，即不使用细胞粘合剂，仅使用维持培养基对间充质干细胞进行培养；此步骤中的维持培养基同步骤S2中的维持培养基。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本发明中的术语解释：iPSc为人诱导性多能干细胞的简称；MSC是间充质干细胞的简称；Px是指第x代细胞；iPSc-MSCPx即由iPSc诱导形成的MSC的第x代细胞；epidermalgrowthfactor为内皮生长因子；Gelatine为明胶；HighGlucoseDMEM为DMEM高糖培养基；L-ascorbate为L-抗坏血酸；bFGF(BasicFibroblastGrowthFactor)为人碱性成纤维细胞生长因子。

实施例1

人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法

本实施例中使用的iPSc为UC-iPSc，其来源于广州健康与生命科学院馈赠，并使用UC-iPSc的30代-40代细胞进行诱导；UC-iPSc来源于人尿道上皮细胞(UC-5)，使用电转方法将OCT-4，SOX-2，KLF-4，SV40LT转入细胞内所得，称为UC-iPSc。

本实施例的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

①iPSc在Matrigel铺板的细胞培养板上种到约60％满，使用iPSc培养基(F12培养基，10％(V/V)m-TeSR，100μmol/L青霉素/链霉素双抗)，对iPSc进行培养；

②将培养好的iPSc用F12(基础培养基，用于清洗细胞)洗细胞一次，其后将人诱导性多能干细胞置于Matrigel铺板的细胞培养板上，使用iPSc-MSC诱导培养基诱导所述人诱导性多能干细胞，iPSc-MSC诱导培养基的具体组分为：基础培养基：α-MEM(Gibco)，血清：8％-18％(V/V)FBS(Gibco)，抗氧化老化剂：50-100uML-ascorbate(Sigama)，隔天换液至14-21天；细胞形态上逐渐趋近MSC；

③用消化酶Accutase(StemCell)消化细胞，5-10min，37摄氏度，1:1-1：3传代至明胶铺板的细胞培养板中，此代细胞为iPSc-MSCP1。此时及以后培养基都使用维持培养基培养，组分为：基础培养基HighGlucoseDMEM(Gibco),血清：8％-15％(V/V)FBS(Gibco),促生长的细胞因子：bFGF(5-10ng/mL),epidermalgrowthfactor(10-20ng/mL)；

④培养3天左右，1:2或1:3再次传代至明胶铺板的细胞培养板中，为iPSc-MSCP2；

⑤iPSc-MSCP2长满后可按正常MSC培养方法培养及传代，在P4代时可做流式鉴定表面marker，在6-8代时可做成骨、成脂及成软骨鉴定。

图2为本实施例中的UC-iPScP30的显微镜照片，是正常形态的iPSc；图3为本实施例中iPSc诱导为MSC的过程照片，可见iPSc由圆形团块生长转变扁平样分散生长，形态已向间充质干细胞转变；图4为本实施例中iPSc-MSCP4的显微镜照片，可见分散贴壁生长，呈现出间充质干细胞形态；图5为本实施例中iPSc-MSCP50的显微镜照片，可见细胞仍未出现体积变大或胞浆颗粒增多等老化现象；图6为本实施例中iPSc-MSCP11老化染色实验的显微镜照片，未见呈现出核染色为蓝色的老化的阳性细胞；图7为本实施例中iPSc-MSCP50老化染色实验的显微镜照片，只有极个别的细胞呈现微弱的老化染色阳性；图8为本实施例中诱导所得iPSc-MSC的MSC相关膜分子表型流式检验结果，结果显示,iPSc-MSC不表达造血细胞表面标志即CD34(造血及内皮细胞阳性)、CD45(白细胞阳性)，单核细胞巨噬细胞系统表面标志CD14阴性。而MSC的典型表面分子CD105、CD90、CD73、CD144、CD146、CD44阳性。图9为本实施例中iPSc流式检测多能干性因子，结果为iPSc表达OCT3/4、Sox-2、TRA-1-60、TRA-1-8等多能干因子。图10为本实施例中iPSc-MSC流式检测多能干性因子，结果为iPSc-MSC不表达OCT3/4、Sox-2、TRA-1-60、TRA-1-81。图11为本实施例中iPSc-MSC具有成骨、成脂及成软骨分化能力。OSTEO:成骨分化鉴定ADIPO:成脂分化鉴定；CHRONDRO:成软骨分化鉴定。

实施例2

人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法

本实施例中使用的iPSc为A-iPSc，其购买于深圳三启生物有限公司，并使用A-iPSc的30代-40代细胞进行诱导；A-iPSc是利用人羊水细胞，使用逆转录病毒进行转染，转入OCT-4，SOX-2，KLF-4，c-MYC这四个干性基因所得，称为A-iPSc。

本实施例的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法同实施例1。

MSC的表面marker流式鉴定

MSC的表面marker流式鉴定方法：

1)将根据本发明的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法得到的iPSc-MSCP8代细胞消化收集细胞，计数后分装管；

2)PBS洗一次，1500rpm离心l0min；弃上清，加100ulPBS重悬细胞，吹打混匀细胞；

3)加入鼠抗人单克隆抗体CD44-PerCP-Cy5.5、CD144-PerCP-Cy5.5、CD90-PE、CD73-PE、CD166-PE、CD105-PE、CD34-APC、CD45-APC，设一管为空白对照；4摄氏度，避光反应30min；PBS洗一次，1500rpm离心10min；弃上清，加入400μLPBS吹打混匀细胞，置4℃待测，24小时内上流式细胞仪检测。

流式细胞仪检测细胞表面标志的检测结果如图8所示，结果显示，iPSC-MSC不表达造血细胞表面标志即CD34(造血及内皮细胞阳性)、CD45(白细胞阳性)，单核细胞巨噬细胞系统表面标志CD14阴性。而MSC的典型表面分子CD105、CD90、CD73、CD144、CD146、CD44阳性。

实施例5

MSC功能鉴定

(1)成骨鉴定

将根据本发明的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法得到的第8代以上细胞，1x10⁵/孔接种于六孔板，MSC培养基培养24h后换用含10％FBS的DMEM，并加入地塞米松、抗坏血酸磷酸盐、一磷酸甘油，每3天半量换液，共诱导2～4周。AlizarinRed染色鉴定诱导细胞去培养基后，PBS洗一次，加入12％中性甲醛溶液固定5min，加入AlizarinRed染液染色30min，60％甲醛脱色数秒，镜下观察。

(2)成脂鉴定

将根据本发明的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法得到的第8代以上细胞，按1x10⁵/孔接种于六孔板,MSC培养基培养24h后换用含10％FBS的DMEM，并加入地塞米松、IBMX、罗格利酮、胰岛素的诱导培养基，诱导3天后完全换液为含10％FBS、胰岛素的DMEM培养基培养24小时，再换为第一种培养基，按如此方案重复3-5个循环。油红染色鉴定脂滴形成：诱导细胞去培养基后，PBS洗一次，加入12％中性甲醛溶液固定5min，加入油红O染液染色30min，60％甲醛脱色数秒，镜下观察。

(3)成软骨鉴定

将根据本发明的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法得到的第8代以上细胞，于尖底试管中900rpm低速离心，使细胞形成微团，加入含2.5％FBs的DMEM并加入胰岛素、转铁蛋白、ITS+Supplement、丙酮酸钠、抗坏血酸磷酸、TGF，每3天半量换液，连续培养2周。诱导2周后细胞去培养基后PBS洗一遍，4％多聚甲醛溶液固定15min，PBS洗1次，使用石蜡包埋切片后，加入AlcianBlue染色液孵育30min，显微镜下观察结果。

图11显示了诱导所得iPSC-MSC具有成骨、成脂及成软骨分化能力。

比较例

本实验小组曾使用以下方案进行iPSc-MSC的诱导，具体步骤如下：

1)iPSc消化传代至0.1％明胶铺板的培养孔上；

2)使用MSC培养基培养2周，MSC培养基包括：α-MEM、10％FCS、青霉素/链霉素、丙酮酸纳、L-柠檬酸纳、L-谷氨酰胺、非必须氨基酸及HEPES；

3)将所得细胞按1:3传代至明胶铺板的培养孔上培养；

4)当传代至P2时，可以不需要使用明胶铺板，直接传代；

5)在5-10代间进行流式鉴定。

经试验得出采用此方法进行iPSc-MSC的诱导具有以下缺点：

1)诱导所得的细胞体型肥大，胞浆颗粒多，呈现老化形态。

2)细胞活力及生存力差，各代细胞传代比例均需1:2，且新生细胞需生长2周以上才能继续传代。

3)细胞寿命短：所得细胞传代至10-15代时已基本不能生长，无法继续传代。

而本发明的将人多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法过程简单，只需要使用更换诱导培养基和维持培养基即可，不需要使用流式分选技术，节省费用和时间；获得的间充质干细胞生存能力强，体型健康，并可至少传代到80代，而保持功能正常。

产业利用性

根据本发明，间充质干细胞可以低成本大规模生产作为用于细胞治疗产品的最佳资源，同时仍维持其一致性。最终，本发明可通过使用人类多能干细胞，很容易地大规模生产间充质干细胞(其可理想地用于生殖医学和细胞治疗中)。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (13)

1.一种人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将人诱导性多能干细胞置于Matrigel铺板的载体上，使用iPSc-MSC诱导培养基诱导所述人诱导性多能干细胞以将其转化为间充质干细胞，iPSc-MSC诱导培养基为添加有血清及L-抗坏血酸的培养基；

2)以增殖性的方式培养步骤1)中得到的间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％的血清及50-100μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM；所述血清为FBS。

3.根据权利要求1所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤1)中的诱导时间为14-21天。

4.根据权利要求1所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤2)通过以下步骤实施：

21)消化步骤1)得到的间充质干细胞，将其传代至细胞粘合剂铺板的载体上，使用维持培养基来培养间充质干细胞，得到第一代间充质干细胞；所述维持培养基为添加有血清、bFGF以及内皮生长因子的培养基；

22)将步骤21)得到第一代间充质干细胞再次传代至细胞粘合剂铺板的载体上，使用所述维持培养基培养，得到第二代间充质干细胞；

23)待第二代间充质干细胞长满后，使用所述维持培养基按正常的间充质干细胞培养方法进行培养及传代。

5.根据权利要求4所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述维持培养基为添加有8-15％的血清、5-10ng/mL的bFGF以及10-20ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基；所述血清为FBS。

6.根据权利要求4所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤21)中，消化是指利用消化酶消化5-15min，传代比例为1:1～1:3；培养时间为2～6d。

7.根据权利要求4所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤22)中，传代比例为1:1～1:3。

8.根据权利要求4所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，其特征在于：所述细胞粘合剂为明胶或Matrigel。

9.一种间充质干细胞，其特征在于：所述间充质干细胞由权利要求1～8中任一权利要求所述的人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法产生。

10.一种细胞治疗产品，其特征在于：其包括权利要求9所述的间充质干细胞。

11.一种用于培养细胞的饲养细胞，其特征在于：其包括权利要求9所述的间充质干细胞。

12.一种用于将人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

a.iPSc-MSC诱导培养基，其为添加有血清及L-抗坏血酸的培养基；

b.维持培养基，其为添加有血清、bFGF以及内皮生长因子的培养基。

13.根据权利要求12所述的用于将人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的试剂盒，其特征在于：所述iPSc-MSC诱导培养基为添加有8-18％的血清及50-100μmol/L的L-抗坏血酸的α-MEM；

所述维持培养基为添加有8-15％的血清、5-10ng/mL的bFGF以及10-20ng/mL的内皮生长因子的DMEM高糖培养基；

所述血清为FBS。