CN103305459A - 小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诱导猪精原干细胞转变为多能性干细胞的技术，可以在不改变细胞基因组的前提下，使猪精原干细胞发生细胞形态和分子表达水平向胚胎干细胞转变，且高表达多能性相关基因0ct4、Nanog和Klf4等，同时克隆为碱性磷酸酶阳性克隆。本发明具有高效、安全性好、应用前景广泛等优点。

Description

小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法

技术领域

本发明涉及猪精原干细胞向多能性干细胞的转变及其用途，属于生物与新医药技术领域。

背景技术

精原干细胞是雄性体内唯一可以将遗传物质传递给后代的成体干细胞，在睾丸生精小管的微环境内具有自我更新和单向分化为雄性配子的能力。但在体内或体外其他的特定条件下，精原干细胞表现出更广泛的分化潜能和去分化能力，从而转变为其他类型的细胞。Liz Simona等研究表明将小鼠精原干细胞移植到体内的前列腺组织、皮肤组织及子宫组织，精原干细胞会失去自身的特性，分别转化为前列腺、皮肤和子宫上皮细胞；在体外的特定条件下，已被多个研究团队证实，小鼠精原干细胞在体外培养过程中通过自发去分化作用转变为多能性生殖干细胞，从而具有和胚胎干细胞相似的分化潜能，可形成具有生殖系转移的嵌合体小鼠后代。目前条件下，若能将此技术成功应用于大型家畜动物从而获得多能性生殖干细胞，成为胚胎干细胞的替代细胞，对当前仍无体外长期培养的胚胎干细胞的家畜的基因改造和育种具有重要意义。

睾丸内的支持细胞(Sertoli cells)可分泌生长因子GDNF和bFGF来调节精原干细胞的增殖和分化。GDNF被证实是维持精原干细胞自我更新所必需的细胞因子，GDNF通过src激酶激活PI3K/Akt信号通路并上调N-myc的表达，通过激活Ras/Erkl/2信号通路促进c-Fog的表达，从而促进小鼠精原干细胞的增殖和自我更新。碱性成纤维细胞生长因子(basic-Fibroblast Growgh Factor，bFGF)被证实可以促进多种细胞的增殖，睾丸内的支持细胞也可通过旁分泌的方式分泌bFGF作用于精原干细胞。LIF可以激活Jak/Stat3信号通路来维持小鼠ES细胞的自我更新，而Jak/Stat信号通路对精原干细胞的自我更新也具有重要作用，Jak或Stat92E的基因突变会导致精原干细胞的丧失。因此，在体外培养精原干细胞或将其转变为生殖系多能性干细胞的过程中，一般都使用用GDNF、bFGF和LIF。

在生长因子存在的情况下，猪的精原干细胞多能性相关基因表达量难以维持，细胞无法实现向生殖系多能性干细胞的转变。而oct4、nanog和klf4表达量的维持对干细胞自我更新和分化的细胞向多能性干细胞的转变具有重要意义。研究发现在小鼠ES细胞内，Vitamin A可以促进nanog的表达，而过表达nanog可促进小鼠ES细胞的自我更新即使在缺乏LIF激活LIF/stat3的情况下。Forskolin是一种双萜类化合物，它可以激活腺苷酸环化酶的催化活性，从而通过蛋白激酶A信号通路促进klf4的表达。De Felici证实forskolin能缓解PGC的自然死亡，使细胞存活时间延长。Shamblott等在培养液中添加10μmol/L的forskolin，从人胎儿中分离克隆出5个PGC多能干细胞系。可见Forskolin对促进生殖系细胞的存活和干细胞的建系具有重要作用。本研究分别向培养液内加入终浓度为1μM Vitamin A和10μMforskolin，real-time PCR检测显示可以明显促进猪SSCs nanog和klf4的表达。

精原干细胞向多能性生殖干细胞的转变是细胞重编程的一个过程，涉及到细胞基因组表观遗传改变。表观遗传的改变表现为组蛋白乙酰化水平和DNA甲基化水平的变化。一般情况下，组蛋白乙酰化水平高而DNA甲基化水平低将有利于基因的表达。目前有许多小分子化合物可以调节细胞组蛋白的乙酰化和DNA甲基化。研究表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA(trichostatin A)和DNA甲基化酶抑制剂AZA(5-aza-2’-deoxycytidine)的联合使用，可以降低组蛋白去乙酰化酶HDAC2和DNA甲基化酶DNMT1和DNMT3b的转录，oct4和sox2的表达量显著升高而DNA的甲基化水平显著下降。Oct4启动子区域DNA的去甲基化会促进Oct4基因的表达，而启动子区域DNA高度甲基化会使该基因沉默。同样在进行猪SSCs向生殖系多能性细胞诱导之前，我们已验证AZA和TSA可以促进猪精原干细胞oct4的表达。

附图说明

图1为猪精原干细胞的碱性磷酸酶染色(A)、Oct4免疫荧光(B)和原代形成的精原干细胞克隆(C)。

图2为单独使用小分子对猪精原干细胞细胞形态(A)和分子表达(B)的影响。

图3为在小分子作用下，猪精原干细胞形成胚胎干细胞样克隆团(A)、Oct4免疫荧光(B)和多能性基因(C)的表达情况。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。

KO-DMEM培养液、penicillin-streptomycin和L-glutamine购于invitrogen公司，non-essential amino acids购于Sigma-Aldrich Inc公司，fetal bovine serum购于Hyclone公司。生长因子GDNF购于R&D Systems，Inc公司，LIF购于Chemicon，Temecula公司。小分子vitamin A购于Sigma-Aldrich Inc公司，Forskolin购于Sigma-Aldrich Inc公司，AZA购于Sigma-Aldrich Inc公司，TSA购于Sigma-Aldrich Inc公司。

实施例1，猪精原干细胞的预处理

7日龄小公猪，无菌操作取出睾丸后将睾丸用70％的酒精进行冲洗，冲洗干净后，将其放于盛有3倍双抗的PBS(双抗浓度为3％)50ml离心管内，4℃冰盒保存，1小时内运回实验室。

将新鲜的睾丸组织放于超净工作台内，用双抗浓度为3％PBS洗三次之后，将其放到含有PBS的60mm Petri dish上。

用灭好菌的手术器械去除睾丸表面的白膜和睾丸内部的睾丸网，将睾丸剪成小碎块，放于含30mlPBS的50ml离心管内，200g，离心3min，15-25℃。

去除上清，200g，离心3min，15-25℃，重复2次。

将离心后的睾丸组织沉淀转移到一个新的含10倍于睾丸组织体积的collagenase/DNase solution的60-mm Petri dish上，37℃的CO2培养箱内消化约30min直到曲精小管分离，collagenase终浓度为1mg/ml，DNase I终浓度为10μg/ml。

用5ml移液器驱散曲精小管片段。收集消化液到50ml的Falcon管，200g，离心3min，15-25℃。

用20mlPBS清洗沉淀，200g，离心5min，15-25℃。重复3次。

将沉淀放入10倍于沉淀体积的dispase II/Dnase I溶液，在37℃，CO2培养箱消化30min，每2-5分钟轻轻摇动，dispase II终浓度为1mg/ml，DNase I终浓度为10μg/ml。

用5ml移液器吹散曲精小管，获得单细胞混合物消化液。

将混合物通过一个40μm孔径尼龙网进行过滤，获得单细胞悬液。

单细胞悬液离心，200g，3min，，15-25℃。然后弃除酶溶液。

将细胞悬浮于SSCs培养液内，计数，制成0.5×107/ml的悬液备用。

采用差异贴壁法进行纯化，步骤如下：(1)将消化获得的单细胞悬液放于明胶处理2小时以上的100mm dish内，每个dish起始细胞数为1×107，加入精原干细胞培养液8ml，放于37℃，CO2培养箱，培养4-8小时。(2)用移液器轻吹皿底，使精原干细胞悬浮于培养液内，贴壁的其他细胞如成纤维细胞、间充质细胞和肌细胞等仍留在皿底。(3)收集含有精原干细胞的培养液于50ml离心管内离心，200g，3min，15-25℃。(4)离心后的细胞沉淀重新加入新的明胶处理2小时以上的100mm dish内，3个100dish内获得的悬浮细胞可放于1个100mm dish内，放于37℃，CO2培养箱，培养6-12小时。(5)重复步骤(2)-(4)2次，即可获得纯度较高的精原干细胞。

7日龄猪精原干细胞的鉴定采用形态和细胞大小观察法、碱性磷酸酶染色法和免疫荧光法如图1所示。

碱性磷酸酶染色：将精原干细胞放于含feeder的4孔板内，培养12-24小时当精原干细胞贴壁后，按碱性磷酸酶检测试剂盒(SK-5300，DAKO，Wector Labs)进行染色操作。

免疫荧光检测Oct4的表达：(1)将精原干细胞放于含feeder的4孔板内，培养12-24小时精原干细胞实现贴壁生长。(2)固定：去除培养液后用PBS洗2次，然后每孔加入300ul固定液，常温固定30min。(3)通透和封闭：弃去固定液，加入通透液，通透30min。(4)用封闭液(3％羊血清，1XPBS稀释)洗3次，每次15min，最后在封闭液中封闭2小时。(5)一抗孵育：弃去封闭液，加入一抗(封闭液1∶1000稀释)，4℃冰箱放置过夜。.(6)二抗孵育：弃去一抗溶液，封闭液洗3次，每次15min，然后加入二抗溶液(封闭液1∶1000稀释)，室温放置2h，然后封闭液洗3次(7)染核：向每孔中加入10ug/ml的Hochest33342，放置20-30min，加入一滴Vectashiel以防止荧光淬灭。荧光显微镜下观察并照相。

实施例2，猪精原干细胞向胚胎干细胞样细胞的转变

二步酶法消化获得的睾丸细胞混合物，通过差异贴壁的方法获得高纯度的精原干细胞，计数后将浓度调整为2x10⁶/ml。

提前准备好铺面丝裂霉素C处理过的MEF的24孔板，在将精原干细胞放入之前2小时，先将培养液换为SSCs培养液II。24孔板每个孔加入105个精原干细胞。培养条件为37℃，5％的CO2的培养箱，每孔加入培养液0.8ml，每天半量换液。根据实验需求，定期进行拍照、收细胞和检测。

需传代时，先将培养液换为新鲜的培养液，用1ml移液器反复多次轻轻吹打培养皿的底部，精原干细胞就会脱落下来，显微镜下观察，若精原干细胞已完全脱离底部的滋养层，即可将其按1∶2传到新的有滋养层的24孔板孔内进行培养。

培养液里分别加入VitaminA、Forsklin、AZA和TSA之后可分别提高猪精原干细胞Nanog、Klf4和Oct4的表达如图2所示。

在FBS浓度为1％的SSCs培养液内，加入生长因子(GDNF(4ng/ml)和hLIF(1000U/ml))和小分子vitaminA(1μM)、forskolin(10μM)、AZA(2.5uM)和TSA(0.1uM)的情况下培养8-10天，部分精原干细胞发生形态转变，有半悬浮状态的圆形或椭圆形转变为紧密贴壁生长的克隆团，细胞核和核仁明显，Oct4免疫荧光阳性且高表达Oct4，Nanog和Klf4如图3所示。

Claims (5)

1.一种小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法，其特征在于：包括猪精原干细胞的预处理和小分子诱导猪精原干细胞向胚胎干细胞样细胞的转变两个步骤：

(1)猪精原干细胞预处理：取猪的睾丸，通过两步酶消化法和差异贴壁法获得高纯度的猪精原干细胞。

(2)小分子诱导猪精原干细胞向胚胎干细胞样细胞的转变：用含有小分子和生长因子的低血清或血清替代品的KO-DMEM培养液诱导。

2.根据权利要求1所述的小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法，其特征在于：猪精原干细胞预处理步骤为：猪睾丸组织剪碎后，放于含10倍体积的1mg/ml Collagenase IV和10μg/mlDNase I的消化液内消化30分钟，再放于含10倍体积的1mg/ml Dispase II和10μg/ml DNase I消化30分钟。用40μm滤器进行过滤后计数。再经过2次差异贴壁后，每次4-8小时，获得纯度在90％以上的精原干细胞。

3.根据权利要求1所述的小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法，其特征在于：小分子诱导猪精原干细胞向胚胎干细胞样细胞的转变步骤为：纯化后的猪精原干细胞在含有小分子和生长因子的低血清或血清替代品的KO-DMEM培养液8-10天。

4.根据权利要求3所述的小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法，其特征在于：所述的小分子成分为vitamin A、forskolin、AZA和TSA，生长因子的成分为GDNF和LIF.

5.根据权利要求4所述的小分子诱导猪精原干细胞转变为胚胎干细胞样细胞的方法，其特征在于：vitamin A的浓度为1μmol/L，forskolin的浓度为10μmol/L，AZA的浓度为2.5μmol/L，TSA的浓度为0.1μmol/L，GDNF的浓度为10ng/ml，LIF的浓度为1000U/ml。

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